この研究は、NCIの学内研究プログラムによってサポートされていました。

マスター株式の1。準備<ol><li> DMSO中でテストされる化合物のマスターストックを作る。 20 mMの標準濃度で在庫を準備します。 注：10mMの上記の任意の濃度を用いることができる。このアッセイを確認するための陽性対照として使用することができる化合物は、RAL、EVGおよびDTGが挙げられる。 </li><li>確保化合物は、15秒間溶液を複数回ボルテックスし、室温で1時間インキュベートすることによりDMSOに溶解する。使用するまで-20℃の暗所で20 mMのストック溶液を保管してください。 </li></ol>化合物スクリーニングのための96ウェルプレートの2。準備<ol><li>試験される細胞株（ 例えば、HOS又はTZM-blを）を選択し、（培地中で（4,000細胞/ウェル）を4×10 4細胞/ mlの密度でそれらの細胞を100μlのシード例えば、ダルベッコ改変イーグル又はDMEM培地5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、ペニシリン（50単位/ ml）を補充したプラスストレプトomycin）。 </li></ol>ウイルスストックの3。​​生成 （ 図1に示すように、ステップ1）、32-34、293細胞をトランスフェクトすることにより、VSV-G偽型HIVを産生する。 <ol><li>トランスフェクションの前の日に、1.5×10 6細胞の密度で直径100mmの皿上にプレートした293細胞。 </li><li>リン酸カルシウム法35を使用し、VSV（pHCMV-G）の4μgの-トランスフェクションの日に、野生型または変異型のHIV（ΔLUCpNLNgoMIVR）の16μgの293細胞をトランスフェクト。 </li><li>約リン酸カルシウム沈殿後6時間が追加され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回、293細胞を洗浄し、48時間新鮮な培地でインキュベートする。 [DMEM、5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、およびペニシリン（50単位/ ml）およびストレプトマイシン（50μg/ ml）を補充した]。 </li><li>直径100mmから培地を除去して、上清を含有するウイルスを回収する皿、RTで30分間ターボDNaseで上清を治療し、感染アッセイにおいて調製に培地中の上清を希釈、45μmの孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタ処理、10分間3,000 rpmでの低速遠心分離により上清を明らかにする。 -80℃で、一定分量で、凍結したウイルス上清を保存する 注：上清中のp24の量は、HIV-1のp24酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて決定される。 p24の濃度は、試料中のウイルスの量を制御するために使用される。ウイルスの約500 ngの感染前の日に1.5×10 5細胞/皿の密度で直径60mmの皿上にプレートHOS細胞に添加される。インキュベーションの48時間後、細胞を収穫し、遠心分離により回収し、洗浄し、100μlのPBSに再懸濁した。発光レポーター遺伝子アッセイ試薬の等量を追加し、セクション5.4.1に記載したようにルシフェラーゼ活性を測定し5.4.2。ステップ4.6で説明したようにこのことから、ウイルスの適切な希釈を行うことができる。 </li></ol> 96ウェルプレートに4。物のスクリーニング三重に各化合物を選別し、結果を平均する。 注：ウイルス複製の各化合物の効果を、任意の化合物の非存在下で得られた複製のレベルに正規化することによって補正される。 <ol><li>スクリーニングされる経験的な濃度範囲を決定する。 注：典型的には、11連続希釈を有するスクリーンは、カラム7連続希釈によってプレート画面カラムに化合物を添加することにより製造される、行によって化合物を添加することにより製造される。井戸のセット一連の化合物なしの制御のために予約しておく必要があります。また、1列または1行には、負/バックグラウンドコントロールとして動作するように空白のままにする必要があります。ウイルスが追加された場合に最後に、それは細胞の細胞傷害性または感染性アッセイであるか否かを決定するであろう。 </li><li>準備する20 mM保存液から段階希釈​​。 （ 表1に示されるように）濃度が試験される濃度は経験的に決定された範囲に応じて選択される。最終濃度が100μMであることを行っている場合は、 すなわち 、1 mMのワーキングストックを作る、10倍の所望の最終濃度で培地中に希釈液を調製する。 注：50秒5〜10μM以上のICを有する化合物は通常、医薬品開発のための良い候補ではない。最初の検定では、唯一のWTベクターに対する化合物を試験する。効果的に、WTベクトルを阻害有望な化合物は、その後、薬剤耐性変異のパネルに対してテストされます。 </li><li>インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、三連のウェルに試験されるべき化合物の連続希釈物を加える（ 図1に示すように、ステップ2）。 注意：ウェルに加え、ボリュームは最終濃度の1/10の体積にする必要があります。このように、22μL/ウェル（最終容量Pを追加OSTウイルスのほかには、感染性アッセイのために220μL）です。細胞毒性アッセイのために、11μL/ウェルを（最終容量は110μL/ウェルである）を追加します。 </li><li>インキュベーターに96ウェルプレートを返す。性細胞傷害画面の場合は、37℃で96ウェルプレートを48時間インキュベートし、それ以上の操作はプロトコル4で必要とされていません。プロトコル5に進んで感染性アッセイのために、プロトコル4の指示に従って進んでください。 </li><li>感染性試験のみ。解析対象となる化合物を用いた37℃で3時間培養した後、最低インキュベーターからプレートを取り外します。 注：これは、化合物がHIVベクターで感染の前に細胞に取り込まれることを可能にする。 </li><li>ウイルス33のストック希釈液を調製、34（通常は約1:3）、未処理細胞で0.2から1.5の相対ルシフェラーゼ量（RLU）との間のルシフェラーゼシグナルを生成すること。プレート全体はDILU、約10ミリリットルがかかりますテッドウイルス。 8または12マルチチャンネルピペッターのいずれかを使用して、各ウェルに100μlのウイルスを追加します。ネガティブ/背景コントロールウェルにウイルスを追加しないでください。 48時間、37℃のインキュベーターにプレートを返します。 注意：ウイルスの1時03分株式の希釈上清中のウイルス濃度は1.0ミリリットル中に約500 NGであることを示すP24アッセイに基づく0.2 -1.5のRLUの間のルシフェラーゼシグナルを生成し、典型的な希釈である。 </li></ol> 5。準備と96ウェルプレートに細胞毒性と感染性の測定<ol><li>井戸から培地を吸引除去する（メディアにおけるフェノールレッド、ルシフェラーゼ信号に干渉することができます）。端に取り付けられた200μlのピペットチップでガラスピペットを使用してください。メディアのトップでスタートし、徐々に井戸の底の角に向かって働いています。井戸の底にあまりにも多くの時間を費やすことはありませんか、細胞がうまくから削除することができます。 </li><li> 100μlのPBSを追加する0.5メートルで補充各ウェルに、MのMgCl 2。これは、細胞が乾燥しないように培地を除去した直後に行われる必要がある。 </li><li>唯一の細胞毒性アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光ATP検出アッセイから基板緩衝液5mlを加える。 Oneバイアルを96ウェルプレートに十分である。 <ol><li>発光ATP検出アッセイからの各ウェルに細胞溶解緩衝液50μlを追加します。コンパクトサーモミキサーを用いて室温で5分間700rpmで96ウェルプレートを振る。 </li><li>ネガティブコントロール/バックグラウンドウェルを除く全てのウェルに再構成された発光ATP検出アッセイ試薬50μlを加える。コンパクトサーモミキサーを用いて5分間室温で700 rpmで振とうする。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でプレートをインキュベートする。 </li><li>マイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。 注意：ソフトマックスプロマイクロプレートルミノメータープログラムを開きます。必ずルミノメーターがルミを測定するように設定されていることを確認5回/ウェルの感度でnescence。 </li></ol></li><li>唯一の感染性​​アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光レポーター遺伝子アッセイから基質緩衝液10ミリリットルを追加。 Oneバイアルを各96ウェルプレートに十分である。 <ol><li>各ウェルに再構成された発光レポーター遺伝子アッセイ試薬を100μlを加える。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でインキュベートする。 </li><li>セクション5.3.3で実行されるようなマイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。 </li></ol></li></ol>化合物について、CC 50およびIC 50値の6。決定<ol><li> Excelスプレッドシートにマイクロプレートルミノメーターからのルシフェラーゼデータを転送します。 <ol><li>平均と背景の両方の三重/制御信号データ中のルシフェラーゼのデータ。全濃度範囲の平均三重の信号から平均バックグラウンド/制御信号を差し引く。 </li> &lt;李は&gt;背景は、それが阻害パーセントを決定するために任意の化合物の非存在下で、細胞毒性または感染性であるかどうか、活動に対する濃度範囲の平均信号を補正する標準化する。 注：パーセント阻害は、100を乗じた薬物の非存在下でのルシフェラーゼ活性で割った薬剤の存在下でのルシフェラーゼ活性として定義される。 </li></ol></li><li> CC 50およびIC 50値を得るためにKaleidagraphのソフトウェアプログラムを使用し<ol><li>経験的に決定された濃度範囲およびカレイダグラフにルシフェラーゼ活性の阻害率の両方を転送します。 </li><li> x軸とy軸上のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント上の濃度範囲でデータをプロット。 </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、細胞毒性およびWTおよび薬剤耐性HIV-1の両方の複製を阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用することができ、迅速、効率的、かつ再現可能なアッセイを記載している。迅速な化合物を同定し、それらの有効性及び細胞毒性を試験する能力は、HIV-1に対する新規かつ改良された薬物の開発に重要である。リード化合物が同定されると、リード化合物の類似体が生成され、同じアッセイを用いて試験することができる。このアッセイは、比較的簡単である。ユーザーは最も一般的な問題（毒性化合物、ベクターストックに関する問題）を診断することを可能に正と負の両方のコントロールがあります。添加していない化合物を三連のウェルのセットの使用は、ウイルス感染が発生したことを示している。細胞毒性は独立したアッセイで測定されているという事実は、ウイルス複製の特定の効果として、細胞毒性に起因するルシフェラーゼの減少を誤解避けることができます。 重要なステップ細胞が均一にウェルのそれぞれに同じ量のウイルスを加え、にルシフェラーゼ活性を測定し、ウェルを試験されるべき化合物の適切な濃度を有することを、ウェル中に分配されるようにプロトコルでプレートを準備しているCC 50およびIC 50値を決定します。 アッセイは、安全で、定量的、かつ再現性がある。ベクターが複製欠陥があるので、このアッセイは安全です。それが正確かつ簡便にアッセイすることができるルシフェラーゼを発現する単一ラウンドベクターに基づいているので、このアッセイは、定量的および再現可能である。マルチラウンドのウイルス複製アッセイにおいて、測定されたIC 50は、ウイルスのライフサイクルの数に依存する;アッセイは、WTと有意に異なる複製能力を有することができる薬剤耐性ウイルスの両方を含むとき、これは特に問題である。 いくつかの酵素アッセイはそれができ、以前にも報告されているIN阻害剤をスクリーニングするために使用される。統合されたDNAを測定するために、リアルタイムPCR技術を伴うアッセイは、より労働集約的であり、36、37高価で、精製された組換えタンパク質（複数可）を必要とし、一般的である。それは、他のウイルス酵素（RTおよびプロテアーゼ）に対する化合物の影響を測定する酵素アッセイを使用することが可能であるが、各酵素は、独自のアッセイシステムを必要とする。一周ベクターアッセイは、記載されるように、RT阻害剤をスクリーニングするために、修正することなく、使用することができる。同様のアッセイは、プロテアーゼインヒビターをスクリーニングするために使用することができる;しかしながら、プロテアーゼ阻害アッセイにおいて、化合物は、ベクターを製造するために使用される細胞に添加されなければならない。関連アッセイは、異なる細胞およびベクターを用いて、エンベロープ（ENV）及びHIV侵入融合阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。最後に、このアッセイは、自動化されたロボットのディスペンサーで、大規模に使用することができる。従って、アッセイは、WTおよびmに対する化合物の大きなライブラリーをスクリーニングするために使用することができるutant HIV。しかしながら、実際のアッセイでは、データの解釈に制限はウイルスのライフサイクルポイントの異なる段階で作用するHIV複製の阻害剤を検出することができる。単体でアッセイは、ライフサイクルのステップは化合物によりブロックされているかを定義していません。この疑問が生じた場合には、添加アッセイの38時間を使用することによって解決され、精製された組換えウイルスタンパク質に対して化合物を試験することにより得ることができる。 残念ながら、抗HIV薬の成功にもかかわらず、抵抗および毒性の両方に問題が残っています。有効な抗HIVワクチンの非存在下で、既存の薬物耐性変異体に対して有効であるだけでなく、ウイルスの拡散を低減することができる予防的な薬剤を開発するための新しい治療薬を開発するだけでなく、必要とされている。抗HIV薬の予防的使用は、感染していない人々の治療をincusの複数形の場合、このアプローチはリットルを有する薬物の開発に特別な負担を配置するittleあるいは全く長期の毒性。

HIV-1ウイルスの生活環のいくつかの重要なステップを標的とする薬物の利用可能性が大幅にHIV-1感染の治療、および長期生存を改善した（高活性抗レトロウイルス療法、またはHAARTと呼ばれる）併用薬物療法につながっている患者の。典型的には2つのヌクレオシド系逆転写酵素（RT）阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシドRT阻害剤のいずれかの組み合わせを使用してHAARTは、現在、生涯条件1-5に致命的な疾患を変換した。しかし、ウイルス複製の持続抑制におけるHAARTの多くの成功にもかかわらず、それには限界がある。 HAARTは、HIVを根絶しないため、患者は治癒しないと治療が人生長いです。薬物毒性を持つと薬剤耐性株の出現には問題がある。抵抗は、HIVインテグラーゼ（IN）を対象に新たに承認された薬を含む承認された抗HIV薬、のすべてに発生する可能性があります。薬剤耐性はおそらくBECAを生じウイルス複製（3×10 -5の変異/塩基/複製サイクルの誤り率）6中に生じる自然突然変異の使用。変異が抗レトロウイルス薬のターゲットをコードする遺伝子で発生した場合、これらの変異の小さなサブセットは、薬剤へのウイルス株の感受性の減少につながる。薬剤耐性の発生を回避するために、薬物濃度は、完全にHIVの複製を抑制するレベルに維持されなければならない。治療計画への密着不良が問題を悪化させ、抵抗7-9の急速な発展につながることができます。薬物濃度が原因で、異なる吸収、代謝、分布、および排泄レベルに患者で異なりますが、高い薬物濃度は、毒性が10につながることができます。治療は、患者の生活のために続けているため、抗レトロウイルスの長期毒性について深刻な安全上の懸念がある。一般にHAARTで使用される抗レトロウイルスが有害作用を有することができるND副作用は人生は11から15を脅かしてきた発生率があった。患者が抵抗性と毒性の開発で発生する問題を効果的にほとんど、あるいは全くの長期的な毒性を持つウイルスの一般的な薬剤耐性株の複製を阻止する新薬を開発する必要性の根底にある。 これにより、迅速にウイルスの生活環に必須の手順を遮断する化合物をスクリーニングすることができるアッセイが必要とされている。ここでは、化合物および迅速かつ効率的にWTおよび薬剤耐性HIV株の両方の複製をブロックする能力の細胞毒性を評価するために使用することができる効率的なアッセイを記載している。我々が使用するアッセイは、患者16〜18から分離されたウイルスに薬剤耐性をスクリーニングするために開発されたアッセイに似ています。 アッセイは、HIV逆転写を遮断することができる化合物をスクリーニングするために改変することなく使用することができるが、我々はDESCRうIBE阻害IN評価するアッセイを使用して。 INは、細胞ゲノムへのウイルスDNA 19を挿入必須ウイルス酵素である。阻害剤で有望なの数が開発されていますが、そのうちのいくつかは現在、アイセントレス20、21（これもラルテグラビルやRALとも呼ばれます）の臨床試験を受けているし、最近では、Elvitegravirは（EVG）22とDolutegravir（DTG）23があったFDAが承認した。これらの化合物は、25 HIVおよびB細胞培養物中の患者24における非Bサブタイプの両方に対して活性である。ただし、RALを用いた治療は、薬剤耐性HIV-1変異体では、Y143R、N155H、およびG140S/Q148H 24、26〜31を含むために選択されます。 N155HとG140S/Q1​​48Hはまた、これらの耐性変異に対して有効である鎖転移阻害剤（INSTIs）の第二世代を設計し、開発する必要性を強調しているEVGの有効性を減少させる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

抗HIV薬の番号が承認されているが、毒性および薬剤耐性の問題が依然として存在する。これは、最小限の毒性で共通の薬剤耐性HIV-1株による感染を阻害することができる新しい化合物を同定する必要性を示している。ここでは、急速にWT及び突然変異体ウイルス株に対する化合物の細胞傷害性および有効性を決定するために使用できる効率的なアッセイを記載している。 所望の標的細胞株を96ウェルプレートに播種され、24時間のインキュベーション後、試験すべき化合物の逐次希釈液を添加する。これ以上の操作は、細胞性細胞傷害アッセイのために必要ありません。抗HIVために、ルシフェラーゼを発現するWTまたは薬物耐性HIV-1ベクターを細胞に添加されるか、所定量のアッセイ。細胞毒性は、ATP依存ルミネッセンスアッセイを用いて測定され、感染性に対する化合物の影響はlucifeの量を決定することによって測定される存在または推定阻害剤の非存在下で、RASE。 このスクリーニングアッセイの完了には4日かかり、多数の化合物を並行してスクリーニングすることができる。化合物は三連でスクリーニングされ、データは、標的化合物の非存在下での感染力/ ATPレベルに対して正規化される。この技術は、潜在的な抗HIV化合物の有効性および毒性の迅速かつ正確な測定を提供する。

アッセイ（ 図1、ステップ1と2）が正常に実行された場合、ルシフェラーゼ値を表2に示したデータ似る必要な濃度範囲にわたってスキャンし;潜在的に強力な化合物は、左から右にルシフェラーゼ活性を増加させることが明らかになり、制御が最も高いルシフェラーゼ活性を有するべきである。ルシフェラーゼ活性は、濃度範囲にわたって0.1相対ルシフェラーゼ単位（RLU値）を超えない場合、これは通常、化合物は細胞を死滅させていることを示している。ルシフェラーゼデータは以上全ての連続希釈を横切る2.0のRLUに等しい場合、化合物は、試験した濃度でHIV-1感染を阻害することができなかった。 カレイダグラフ（ 表3、パートA）中のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント対化合物の濃度をプロットし、線形回帰分析を実行した後、トンのに同様の結果を生成する<html> 表3に示すホース、パートB. <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> 図1 HIV-1ウイルスストックおよび細胞傷害性およびシングルラウンド感染性アッセイのセットアップの調製ステップ1で、293T細胞がpNL4.3ΔEnv.LUCとVSV-Gでトランスフェクトするとウイルス34を生成するために48時間培養。それは感染性アッセイで使用されるまでウイルス（アリコートで-80℃で凍結）を採取し、格納されている。ステップ2では、HOS細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートした。次いで、細胞を3時間試験されるべき化合物の連続希釈物と共にプレインキュベートし、次いでウイルス（WTまたは薬剤耐性のいずれか）に感染している。 48時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ活性を測定する。 le1.jpg &quot;幅=&quot; 300 &quot;/&gt; 表1。シリアル希釈プロトタイプをスクリーニング医薬品。より厳格なスクリーニングは、通常10μMで開始し、0.0005μMで終了11段階希釈を必要とする。連続希釈10倍を用意している。細胞100μl、各ウェル中のウイルスの100μL）があります。このボリュームで、これらの計算に続いて、段階希釈は、全体の96ウェルプレートの3行には十分でしょう。細胞毒性アッセイは、同様に調製される;しかし11段階希釈は、250μMで開始し、0.05μMで終了。希釈液のわずか11μLの細胞100μlを含んでいるプレートのウェルに添加されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="表2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; 表2。ルシフェラーゼ信号データの読み出し、ルシフェラーゼ活性の阻害率の決定。データテーブルは、成功した化合物について、ルシフェラーゼのデータの代表的なセットを示しています。表には、ルシフェラーゼ活性の阻害率とCC 50およびIC 50値を決定するために必要な追加の計算を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="表3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> 表3。線形回帰分析データ表 。パートA。カレイダグラフにおけるルシフェラーゼ活性の阻害パーセントに対して使用される濃度範囲をグラフ化すると、適切な阻害曲線を生成する。パートBは 、阻害曲線をパラメトリック3によって定義されるシグモイド関数と線形回帰によってデータへのフィットが18を分析します。このデータテーブルは、その後、 例えば IC 50およびCC 50を 50％のウイルスの統合と細胞傷害性を阻害するのに必要な薬物濃度を計算するためには、Microsoft Excelと組み合わせて使用します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K ビュー.  National Cancer Institute. ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。 

ビデオ: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

免疫・感染学

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.