著者らは、この作業を可能にしたすべての同僚、特にマヤBalamane、エリザベス·ジョンストンホワイト、シャロンSjoblom、グレッグディングZakh​​ona Gumede、Xolile Kineri、Phindile Mabaso、Lungisa Ndwandwe、ジェームズ·ガーベイ、ギャビンコブ、Senzo Maphanga、Terusha Chettyを承認したいと思います、Keviナイドウ、アンドリューSkingsley、キャサリン·ストット、およびLungani Ndwandwe。著者はまたHlabisa、HIV治療とケアプログラムを働く保健省とアフリカセンター職員のすべての職員に感謝したいと思います。

<ol>
	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohort+profile:+Hlabisa+HIV+treatment+and+care+programme.">Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).</li><li>Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+coverage+of+ART+associated+with+decline+in+risk+of+HIV+acquisition+in+rural+KwaZulu-Natal.">High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal.</a> South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).</li><li>Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increases+in+adult+life+expectancy+in+rural+South+Africa:+valuing+the+scale-up+of+HIV+treatment.">Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment.</a> Science. 339, 961-965 (2013).</li><li>Montaner, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+expanding+access+to+highly+active+antiretroviral+therapy+to+curb+the+growth+of+the+HIV+epidemic.">The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic.</a> Lancet. 368, 531-536 (2006).</li><li>Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+voluntary+HIV+testing+with+immediate+antiretroviral+therapy+as+a+strategy+for+elimination+of+HIV+transmission:+a+mathematical+model.">Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model.</a> Lancet. 373, 48-57 (2009).</li><li>Johnson, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+expectancies+of+South+african+adults+starting+antiretroviral+treatment:+collaborative+analysis+of+cohort+studies.">Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies.</a> PLoS Med. 10, (2013).</li><li>Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+impact+of+antiretrovirals+in+resource-poor+settings:+preventing+HIV+infections+whilst+controlling+drug+resistance.">Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).</li><li>Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+antiretroviral+drug+resistance+in+drug-naive+persons.">Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).</li><li>Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+with+reduced+sensitivity+to+zidovudine+(AZT)+isolated+during+prolonged+therapy.">HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy.</a> Science. 243, 1731-1734 (1989).</li><li>Erice, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+primary+infection+with+zidovudine-resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1.</a> N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).</li><li>Williams, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=British+HIV+Association+guidelines+for+the+treatment+of+HIV-1-positive+adults+with+antiretroviral+therapy.">British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy.</a> HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).</li><li>Vandamme, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+recommendations+for+the+clinical+use+of+HIV+drug+resistance+testing:+2011+update.">European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update.</a> AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Department+of+Health.">Department of Health.</a> Clinical guidelines for the management of HIV &amp; AIDS in adults and adolescents. , (2010).</li><li>Conradie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2012+southern+African+ARV+drug+resistance+testing+guidelines.">The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines.</a> S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).</li><li>Manasa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Drug+Resistance+in+South+Africa:+Data+from+10+Years+of+Surveys.">Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).</li><li>Tshabalala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+transmitted+antiretroviral+drug+resistance+among+HIV-1+infected+women+attending+antenatal+clinics+in+Chitungwiza,+Zimbabwe.">Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug+resistance+surveillance+among+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+individuals+in+Angola:+evidence+for+low+level+of+transmitted+drug+resistance.">Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+genetic+diversity+and+transmitted+drug+resistance+in+health+care+settings+in+Maputo,+Mozambique.">HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+in+antiretroviral-naive+individuals+in+sub-Saharan+Africa+after+rollout+of+antiretroviral+therapy:+a+multicentre+observational+study.">HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study.</a> Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Drug+Resistance+Mutations+Are+Present+in+Six+Percent+of+Persons+Initiating+Antiretroviral+Therapy+in+Lusaka,+Zambia.">HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).</li><li>Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+transmitted+genetic+drug+resistance+in+a+cohort+of+HIV+infected+naive+patients+entering+antiretroviral+treatment+programs+at+two+sites+in+northern+South+Africa.">Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa.</a> J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).</li><li>Iweriebor, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+HIV+in+two+highly+endemic+areas+of+northeastern+South+Africa.">Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa.</a> Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).</li><li>Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiretroviral+drugs+in+newly+diagnosed,+young+treatment-naive+HIV-positive+pregnant+women+in+the+province+of+KwaZulu-Natal+South+Africa.">Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa.</a> J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).</li><li>Nwobegahay, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+antiretroviral+drug+resistance+mutations+and+HIV-I+subtypes+among+newly-diagnosed+drug-naive+persons+visiting+a+voluntary+testing+and+counselling+centre+in+northeastern+South+Africa.">Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa.</a> J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).</li><li>Nwobegahay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+drug-resistant+mutations+in+newly+diagnosed+drug-naive+HIV-1-infected+individuals+in+a+treatment+site+in+the+waterberg+district,+limpopo+province).">Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province).</a> S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).</li><li>Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+net+cost+of+incorporating+resistance+testing+into+HIV/AIDS+treatment+in+South+Africa:+a+Markov+model+with+primary+data.">The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data.</a> J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).</li><li>Dalai, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+molecular+epidemiology+of+subtype+C+HIV-1+in+Zimbabwe.">Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe.</a> AIDS. 23, 2523-2532 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+human+immunodeficiency+virus-1+genotype+resistance+testing+to+determine+highly+active+antiretroviral+therapy+resistance+mutations+in+Hong+Kong.">In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong.</a> Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).</li><li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-house+HIV+genotyping+assay+for+the+detection+of+drug+resistance+mutations+in+Southeast+Asian+patients+infected+with+HIV-1.">An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1.</a> J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).</li><li>Aitken, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pragmatic+Approach+to+HIV-1+Drug+Resistance+Determination+in+Resource-Limited+Settings+by+Use+of+a+Novel+Genotyping+Assay+Targeting+the+Reverse+Transcriptase-Encoding+Region+Only.">A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only.</a> J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+low+cost+and+broadly+sensitive+genotyping+assay+for+HIV-1+drug+resistance+surveillance+and+monitoring+in+resource-limited+settings.">Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Technologies.">Life Technologies.</a> Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , (2012).</li><li>Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+HIV-1+diversity+in+Africa:+a+decade+in+review.">Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review.</a> AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).</li></ol>

<div>保健システムの強化とHIV治療失敗（HIV-：この作品は、ウェルカムトラスト（082384/Z/07/Z）、欧州連合（サンテ2007 147から790）によってサポートされていました、病気のための米国センターはCAPRISA（プロジェクトタイトルを経由して制御しますTFC））、およびスイス南アフリカ共同研究プログラム（SSJRP）と題する研究助成金「スイスのProt /南アフリカ：タンパク質バイオインフォマティクス人材育成は重要な健康関連の病原体」。RLがウェルカムトラストによってサポートされている（認可番号090999 / Z / 09 / Z）。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割も持っていなかった。著者らは、競合の金融利益を宣言していません。 </div>

いくつかの低コストのインハウスの方法は、33、34、36 HIV薬剤耐性遺伝子型決定は、より手頃な価格で提供しようとする努力に記載されている。資源が限られた設定で、抗レトロウイルス療法を受けている人々のためのケアの連続に薬剤耐性検査を統合する必要性に疑問の余地はない。しかし、報告された方法のほとんどは、集団レベルでの薬剤耐性のサーベイランスにおける薬剤耐性遺伝子型決定の適用に焦点を当てる。土星/ライフテクノロジーズの遺伝子型判定法は、薬剤耐性のサーベイランス及びモニタリングのための完全に統合されたプロトコルです。この方法は、臨床管理のための報告書の薬剤耐性と世代の解釈の大部分はオープンソースとオープンアクセスのバイオインフォマティクスのリソースを実装する手頃なプロトコルとして設計されました。 これは、ようにするViroseq遺伝子型判定法を承認したFDAとの比較により示された正常に増幅された実験室用パネルサンプルの100％において、ANRS技能試験試料のパネルからの薬剤耐性変異の同定に正確。精度もサブタイプCウイルス、南部アフリカで最も優勢なサブタイプの臨床サンプルを評価した。それは本方法はCRF02_AGが流行している世界の他の部分で使用される場合は、方法日時プライマーの改変が必要であるサブタイプAおよびBにあったような方法は、サブタイプCサンプル上で正確であったCRF02_AGを有することが示されたパネル試料の一つを増幅するのに失敗しました。あるいは、すべての基Mに感受性のプライマーの縮重セットは、サブタイプの分布が38より不均一である場合は、領域36で使用することができる、33ウイルス。 逆転写およびPCRの感度は、例えば、500ミリリットル、プラズマの高いボリュームからRNAを抽出することにより増加させることができる。プラズマはcentrifすることができますをQIAampウイルスRNA抽出ミニキットに記載されているように、プロトコルを実行する前に、ウイルス粒子を濃縮するために90分間21000×gでuged。 図示のように、新しい方法は、個々の患者管理のための包括的なレポートを生成する追加の利点を有する。これらのレポートは、RegaDBから遺伝子型の統合、免疫学的およびウイルス学的監視データだけでなく、臨床および治療の歴史である。これは、同じように、詳細な患者の病歴の見直しだけでなく、治療勧告が続く抵抗プロファイルの詳細な実験室での解釈を伴う。レポートを確認し、患者のための治療勧告を提供するために、専門の医師の使用はますますタスクシフティングのためのWHOの勧告の一部として南アフリカでARTを提供している看護実践だけでなく、経験の浅い臨床医のための待望の指導を提供します。これらの臨床レポートには、薬剤耐性管理のほとんど、またはまったく経験の臨床医のための効果的な教材であることが示されている。患者の視点から、私たちの方法は、専門家のHIVサービスにアクセスするために、集中サイトに移動する必要がなくなります。 このように、全体として説明されたプロトコルは、HIVの薬剤耐性管理がARTを失敗、HIV感染者のケアの連続に、低コストで、統合することができるような優れたプラットフォームを提供します。生成されたデータは、コミュニティ内の薬剤耐性の発生および送信を評価するために、疫学的目的に使用することができる。生成されたPOL断片の大きさは、集団レベルでの流行のよりよい理解を生成し、より複雑な系統解析には十分である。

南部アフリカにおけるHIVの流行は、特に南アフリカ2、3に、抗レトロウイルス療法（ART）を個人の付随指数関数的な増加と共に急速に1を進化されています。発症4を削減し、資源の限られた設定で、平均寿命（RLS）を5増加させるのに大規模な治療プログラムの疫学的影響に関するエビデンスとして蓄積し続け、ARTのカバレッジを向上させる努力が強化されます。テスト対象の予防ツール6、7のような処理の使用に向けたガイドラインの進化とプログラムを扱うには、治療上の個人の絶対数がさらに増加することを意味します。 ARTを個人の平均寿命は、HIV感染していない人口8のそれに近づくように多数の個体は、より長期間の技術になります。 HIVの薬剤耐性の発生および伝達がALWAを有するYS ART 9月12日の業績への脅威と考えられて。したがって、より多くの個人がARTに開始される、より厳格な監視と薬剤耐性の監視が必要とされている。 遺伝子型薬剤耐性（GRT）試験は、監視のためだけでなく、ARTを受ける個体におけるHIV-1薬剤耐性の両方の監視、先進国で成功裏に使用されている。これらの設定では、GRTは、HIV-1感染者のケアの連続体に統合されました。ほとんどの国際ガイドラインはレジメン小児患者は、母子感染（PMTCT）の防止にさらされ、大人やアート（第一ラインと第2ラインの）13〜15を失敗小児患者のためにGRTをお勧めしますが、その後16を感染させ、との設定で急性感染した個体間で送信される13-15薬剤耐性の高レベル。しかし、コスト、技術、およびインフラストラクチャの要件は、インプリメンが限られているRLSにおける薬剤耐性のモニタリングと同様のアプローチテーション。 南アフリカHIV治療とモニタリングのガイドラインは、現在のファーストラインは17をレジメン失敗個人のARTの選択を導くのにGRTを使用することをお勧めしません。個人は、主にウイルス学（HIV-1 RNAウイルス量）のパラメータに基づいて切り替えられる。しかし2012年に、南部アフリカのHIV臨床医協会は、第一南部アフリカARV薬剤耐性検査の指針18を発表した。これらのガイドラインは、第一ラインと第2ラインのアートを失敗し、すべての大人のためとPMTCT 18にさらされ、感染した幼児や子供のためにGRT検査をお勧めします。アフリカ南部19-29の透過薬剤耐性の高いレベルには現在の証拠がないので、GRTは、急性感染者のための18をお勧めしません。それは、これらの勧告のいくつかは、国家TREに時間をかけて統合されることが期待される地域の様々な国のガイドラインをatmentおよび監視。すでに、2013年南アフリカの治療ガイドラインに大人のためのセカンドラインに障害が発生した時には、子どもたち30の第一選択または第二選択のPIベースのレジメンの失敗時のGRTの勧告は今そこにある。 それは南アフリカの治療ガイドラインにGRTを組み込むことは、潜在的にコスト中立的になることが示されている。真の二次治療に切り替えられる必要がある患者を同定するGRTを用いて、比較的より高価な第一選択薬よりもセカンドラインレジメン薬のコストを考慮すると、プログラムに追加のコストを生じない。また、GRTも、失敗の他の理由を特定し、治療の選択肢を節約し、新たな耐性パターン31についての情報を生成することができます。したがって、さらに、アクセス、ANケアの質を向上させるために、薬剤耐性の監視方法のコストを低減することが必要であるDの成果。 ここでは、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および配列決定した（ 表1）、ならびに薬剤耐性の解釈のために主にオープンソースソフトウェアのための一般的な（オープンソースの）プライマーを使用するように設計GRT法を提案する。臨床管理のために、プロトコルは、国の治療ガイドラインに密着した研究室で薬剤耐性のレポートの専門家の解釈を包括的レビューおよび報告の方法によって補完されている。プロトコルは、4つの異なる成分に分割され、1）HIVリボ核酸（RNA）の抽出、2）逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ウイルス標的の増幅、3）配列決定クロマトグラム、アラインメントの分析のため4）バイオインフォマティクス法キュレーションとシーケンスデータの解釈。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1薬剤耐性は真剣に抗レトロウイルス療法（ART）の有効性および耐衝撃性を損なう可能性を秘めている。サハラ以南のアフリカのアートプログラムは拡大を続けているため、ARTを個人が密接に薬剤耐性の出現を監視する必要があります。 ARTにすでに耐性ウイルス株の伝播を追跡するため送信された薬剤耐性の監視も重要である。ジェノタイピングは高価であり、洗練された実験室およびデータ管理インフラストラクチャを必要とするため、残念ながら、薬剤耐性検査は、まだ限られたリソースの設定中に容易にアクセスすることはできません。個人を管理し、送信された薬剤耐性を評価するためのオープンアクセスの遺伝子型薬剤耐性監視方法について説明する。この方法は、薬剤耐性パターンの解釈と個々の患者のレポートの生成のための無料のオープンソースソフトウェアを使用しています。遺伝子型決定プロトコルはavを有する血漿サンプルについて、95％以上の増幅率を有しているIRALロード&gt;千のHIV-1 RNAコピー/ mlである。感度は、ウイルス負荷&lt;千HIV-1 RNAコピー/ mlのために著しく低下する。ここで説明する方法は、米国食品医薬品局（FDA）、Viroseqジェノタイピング法によって承認されたテスト結果にHIV-1薬剤耐性の方法と比較して検証した。ここで説明する方法の限界は、それが自動化され、それは同じパネルからサブタイプAおよびBを増幅したものの、それはまた、サンプルの検証パネルからの循環組換え型のCRF02_AGを増幅するのに失敗したことがないという事実が挙げられる。

検証方法は、以前に報告された方法20の修正だった。 FDAによって承認されているViroseq遺伝子型決定法は、検証中の参照方法として使用した。エイズの研究とウイルス性肝炎（ANRS）フランス国立機関から取得した技能試験サンプルのパネルは2つの方法の間、一次比較に使用した。 2遺伝子型決定法は正常に両方の方法により増幅したサンプルについて、HIVDBプログラムによって解釈されるすべての臨床的に重要な薬剤耐性関連変異を同定することに100パーセント一致した。 表6に示すように、三対のヌクレオチド配列は99.5％同一であった。予測されるアミノ酸配列は100％同一であった。 5のうち一つのサンプルは正常にViroseqにより増幅することができませんでした。 Viroseqによって増幅されていない試料に加えて、社内の方法が示された第二の試料を増幅するのに失敗したViroseqによって循環組換えウイルス（CRF02_AG）されるように。両方の方法論を用いて増幅3のサンプルは、サブタイプB（2サンプル）およびサブタイプA（1サンプル）となりました。 <img alt="図5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> 図5。シーケンスの品質保証の一環として行わHKY近隣参加ツリーの使用。非常に短い遺伝的距離との配列の4組/クラスターがあります。 RES655とRES655_1（別の日に、配列決定同じサンプル）間の遺伝距離は0.003である。それらの遺伝的距離が異なる疫学的にリンクされていない個人からのサンプルのために（0.075）が短すぎるようRES637_1/RES638ペアとの潜在的なエラーです。 RES638_1に比べて0.075の距離がツリー上の別のRES637があります。 CQ01/CQ02クラスタは、二つのサンプルを示唆しているパネルでも同様のサンプルの重複があります。彼らはREGAサブタイピングツールによって割り当てられ、サブタイプを確認するサブタイプB参照配列と一緒にクラスタ化する。 REGAのサブタイピングツールは、それぞれAとCRF02_AGとしてそれらを分類し、一方、CQ05とCQ04は、それぞれのサブタイプAおよびGとクラスター。のHIVサブタイプとの再結合のための別の有用なツールがhttp://www.datamonkey.orgで入手可能ですSCUELです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> 5つのサンプルのパネルは、社内方法の精度を評価した。十複写遺伝子型が5つの試料のそれぞれについて生成された。 16キャピラリジェネティックアナライザーを用いて、50の遺伝子型の48は同じ日に調製した24ラン、から生成した。すべての5つのサンプルについて、予測されたアミノ酸配列が反復の間で100％一致した。核酸配列は、目のためのERE&gt; 99％対ごとの類似性があった。 このメソッドの使用の最初の2年間に、60サンプルが配列決定にRNA抽出からランダムに繰り返した。シーケンス品質スコアと複製物との間に混合塩基の数の間には統計的に有意な差は認められなかった。 60組のヌクレオチドおよびアミノ酸対比較の両方が99％以上同一であった。したがって、すべての対に対する薬剤耐性変異は100％一致した。 コスト削減 RT、PCRおよび配列決定のための反応量は、生成シーケンスの品質に妥協することなく、独自の方法20、32と比較して、少なくとも半分に短縮されました。これは、RTおよびPCR段階用の50％のコスト削減を可能にした。 新方式は、元々の配列に6配列決定プライマーで動作するように設計されました<html>プロテアーゼ遺伝子および逆転写酵素遺伝子20、32の最初の300コドンの全てのコドン99。同様の方法はまた、六から八プライマー33、34を使用しています。時にはseprately 35、36、プロテアーゼおよびRT遺伝子の配列を決定するが、いくつかの最近発表された方法には、6個未満のプライマーを使用している。我々は、（ 図6）、六から四配列決定プライマーの数を減らすことが求められて<img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> 図6。全99 HIV-1プロテアーゼコドンおよび逆転写酵素遺伝子の最初の300コドンをカバーする1197 bpのpol配列の生成のための6つの4対配列決定プライマー由来の連続配列の比較。242/51242fig6highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 17サンプルのセットからの配列は、2つのプライマー（MAW46とRTY）を除外した後に生成された配列と比較した6のプライマーから生成された。サブタイプは、シーケンスの品質スコアに有意差はなかった14のサブタイプCつのサブタイプB、一つのサブタイプA.あった。再度、核酸の17対の間の平均ペアワイズ同一性は、アミノ酸レベルで99％および100％であった。したがって、六から四配列決定プライマーを低減ほぼ3分のシーケンシングコストの低減をもたらした。 このプロトコルで使用される唯一の独自のソフトウェアツールは配列アセンブリのGeneiousであった。薬剤耐性解釈ツールならびにレポート生成ツールは、すべて無料で、オープンアクセスツールです。これは、独自のソフトウェアの使用に伴うコストをなくすことによって、コストをさらに低減する。さらに、collectivEネゴシエーションは、このプロトコルのための試薬 ​​はライフテクノロジーズから簡単にアクセスするためのキットにパッケージ化と土星/ライフテクノロジーズは、メソッド37の遺伝子型を特定として提供されてすることができた。また、土星のメンバーは割引価格での試薬にアクセスすることができます。 臨床背景 記載されているプロトコルは、クワズールナタールの農村コミュニティの監視や薬剤耐性のサーベイランスに実装されています。 604遺伝子型の合計&gt;千RNAコピー/ mlのウイルス量の試料の95％の増幅率で2010年12月と2013年5月の間、臨床サンプルから生成した。この臨床HIVの薬剤耐性の研究はクワズールナタール大学（参考のBF052/10）の生物医学研究倫理委員会と健康のクワズールナタール局（参照HRKM 10分の176）の健康の研究委員会によって承認された。個々の患者のレポートが生成され、診療所に送り返されました患者管理のため。 72個（72）の遺伝子型はまた、送信された薬剤耐性の研究の調査の一部として生成大規模な前向き集団ベースのHIVサーベイランス調査内にネストされた。主なサンプルは、EDTAマイクロチューブに集め、針を刺す全血だった。ジェノタイピングで79％で19の増幅率があった。調査研究からのサンプルの遺伝子型判定のための倫理承認はクワズールナタール生物医学研究倫理委員会（参考文献BE066107）の大学から入手した。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>プライマー名</td><td>シーケンス</td><td>長さ</td><td>方向</td><td> HXB2ポジション</td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td>フォワード</td><td> 2028-2050 </td><td>第一回目のPCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td>リバース</td><td> 3539-3509 </td><td>第一回目のPCR </td></tr><tr><td>プロ1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td>フォワード</td><td> 2147-2166 </td><td>第二ラウンドのPCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td>リバース</td><td> 3462-3441 </td><td>第二ラウンドのPCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td>フォワード</td><td> 2486-2508 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td>リバース</td><td> 2630-2604 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td>フォワード</td><td> 2956-2994 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td>リバース</td><td> 3129-3101 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RT-Y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td>リバース</td><td> 2967-2946 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td>フォワード</td><td> 2251-2277 </td><td>シークエンシング</td></tr></tbody></table> 表1。 、、PCRを逆転写し、すべての99のHIV-1プロテアーゼコドンと逆trascriptase遺伝子の最初の300コドンをカバーする1197 bpのPOLフラグメントの生成に使用されるカスタムプライマーの配列を決定する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21（5pmol/ml） </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>のdNTP（10 mM）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> 表2。のdNTP /プライマーは、逆転写反応混合する。 <table border= &quot;0&quot; CELLPADDING = &quot;0&quot; CellSpacingの &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>濃度/反応</td></tr><tr><td>第一鎖バッファー（10×） </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム（25ミリモル） </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT（0.1M） </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNアーゼOUT（40単位/ ml） </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td>上付きIII逆転写酵素（200U/ml） </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。酵素は、逆転写反応混合する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>最終濃度/反応</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> PCRバッファー（10×） </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（50 mM）を</td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPミックス（10 mM）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>偏屈なプライマー（5ピコモル/ ml）を</td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td>リバースプライマー（5ピコモル/ ml）を</td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ（5単位/ ml） </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td>小計</td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表4。ネステッドPCR用マスターミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>濃度/反応</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td>シークエンシングバッファー（5X） </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>プライマー（3.2ピコモル/ ml）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td>ビッグダイターミネーターシーケンミックス</td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td>合計</td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> 表5。シークエンシング反応用マスターミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4">社内</td><td rowspan="2"> ％のNa類似性</td></tr><tr><td>検体ID </td><td>サブタイプ</td><td>品質スコア</td><td> PR変異</td><td> RT変異</td><td>サブタイプ</td><td>品質スコア</td><td>広報の変異</td><td> RT変異</td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L、I54L、V82、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V、V82F、I84V </td><td> M41L、L74I、L210W、T215Y、V108I、Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> 表6。比較resulViroseqのジェノタイピング法とANRSによって提供されたサンプルのパネルを使用して、社内の方法との間に並列解析からのTS。

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

抗レトロウイルス療法（ART）を失敗して、HIV-1感染者のための薬剤耐性検査は、将来の治療法を導き、治療成績を向上させることができます。高いHIV感染率が、リソースが制限された設定の最適化、個々の人口健康の結果は、最終的には手頃な価格でアクセス可能な薬剤耐性遺伝子型解析と解釈の方法が必要になります。

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K ビュー.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa. 抗レトロウイルス療法（ART）を失敗して、HIV-1感染者のための薬剤耐性検査は、将来の治療法を導き、治療成績を向上させることができます。高いHIV感染率が、リソースが制限された設定の最適化、個々の人口健康の結果は、最終的には手頃な価格でアクセス可能な薬剤耐性遺伝子型解析と解釈の方法が必要になります。 

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

医学

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

マウスリンパ腫モデルで腫瘍の進行と治療効果を監視するための生物発光に基づく腫瘍の定量法

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

膵管注入:薬物およびウイルス送達の有効かつ選択的な方法

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...