Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
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この仕事を受けましたで K12 HD068322 (SCM);R01 CA179921 と P51 OD011092 (AVM);アメリカ心臓協会 (SB) から 14PRE20320014 賞を受賞します。

注: このプロトコルで説明したすべての手順は、BSL 2 の条件下で行わなければならない。
 1。 KSHV 在庫準備 <ol><li>準備 TNE バッファー: ddH 2 O 292.24 mg EDTA を溶解、225 mL にもたらすと pH 8 に調整します。605.7 mg トリス ddH 2 O に溶解、225 mL にもたらす、pH 8 に調整します。EDTA とトリスのソリューションを組み合わせて、4.38 g 塩化ナトリウムを加えて、500 mL に最終的な音量を調整、フィルター、殺菌し、4 ° c . 保存</li>
	<li>文化 KSHV 正、EBV 否定的な一次貯留リンパ腫細胞株 BCBL 1 37 ° C プラス 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) と約 1 に抗菌剤添加 RPMI で 5% CO 2 加湿のインキュベーターで1.2 mL あたり 6 セルを 10 倍にします</li>。
	KSHV 生産を誘導する <li>新鮮な培地で培養 1:2 の分割 20 ng/mL の最終的な集中にホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を追加し、5 日間の文化を孵化させなさい。代わりに、ウイルス複製を誘発する 3 日間の酪 (NaB; 0.1 mM) で細胞を治療します</li>。
	<li>ウイルス粒子を収穫する遠心培養セルをペレットし、新鮮なチューブに上清を転送するために室温で 5 分間 300 x g で上清が最初</li>。
	4 10 分 2,500 × g で遠心分離機細胞の残骸の転送を避けるために上清をさらに明確に <li>° C 
	注: として明確化培養上清の濾過滅菌 0.45 μ m のフィルターを実行することができますを介して高速遠心分離に代わる。ろ過装置を使用して抗体価の有意な低下を観察しています。したがって、我々 日常的に 2 回目の遠心分離のステップ代わりに実行します</li>。
	<li>約 30 ml の明確化培養 6 遠心チューブに上清中の TNE バッファーで 25% ショ糖溶液の 5 mL を次に、オーバーレイします</li>。
	<li>遠心バランス チューブ真空下で 4 ° C で 2 時間 75,000 x g で</li>。
	<li>培養上清をデカントし、可能な限り上清およびショ糖ソリューションを削除する各管の縁をしみ、150 μ L の TNE バッファーに表示できない場合がありますウイルス ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>プールのすべての再停止ウイルス、よく、混合し、-80 ° c . 25 μ 因数を凍結</li>
</ol> 2。EC E6 と E7 ヒトパピ ローマ ウイルス遺伝子の伝達 注: 私たちは日常的に主な理事会の成長のための標準培養フラスコを使用ただし、EC の不十分な成長が得られた場合、商業文化フラスコ使用見なす必要があります。
EC 培地に <ol><li>文化主なひと皮膚微小血管やリンパ管 EC 37 ° C プラス 5% で加湿のインキュベーターで CO 2 (EGM; EC の基本培地 [EBM] [引受を含む EGM 2 BulletKit で補完が含まれていますヒドロコルチゾン、ひと線維芽細胞成長因子 B、血管 EC 増殖因子、インスリン様成長因子-1、アスコルビン酸、ひと上皮成長因子、抗生物質、およびヘパリン]) 約 50% 合流するコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコで</li>。
	<li>の伝達、文化 PA317 LXSN 16E6E7 セルの 37 ° C で加湿のインキュベーターで 24 , 35 プラス 10 %fbs と抗菌剤で DMEM で 5% CO 2T150 細胞培養フラスコまでは約 90% 合流。16 mL の培地で一晩インキュベートし</li>。
	<li>室温で 5 分間 300 × g で遠心分離して PA317 媒体を明確します</li>。
	<li>12 ml の明確化 PA317 培地の EC 文化とオーバーレイ セルから、EGM を削除してインキュベートする 4 h 
	注: は明らかに清 12 mL の慎重にそれに続く除去に邪魔されない小型ペレット 5 分結果の 300 x g で馴化培地の 16 mL を遠心分離。ただし、プライマリ EC 文化への PA317 LXSN 16E6E7 セルの転送 (包装細胞ラインが EC を脱却してすぐに) 重要では場合、転送する前に 0.45 μ m のフィルターを通してエアコン上清の濾過実行できます</li>。
	<li>新鮮な EGM の PA317 媒体の 6 mL を交換し、一晩インキュベートします</li>。
	<li>12 mL で再フィード EC 新鮮な EGM し, さらに 48 h.</li>
	<li>EC は、サブカルチャーに培地を取り除き、12 mL の陽イオン、ない PBS で洗浄しによって (例えば TrypLE) 商業酵素分解溶液 3 mL を追加し、37 ° C で 3 分間インキュベート</li>
	<li>細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送し、室温で 5 分間 300 × g で遠心。新鮮な EGM の結果細胞ペレットを再懸濁し、3 x T75 フラスコ フラスコあたり 12 mL EGM の最終巻に均等に分割します</li>。
	<li>E6 と E7 で導入した EC の選択、2 つの通路、導入された EC の感染症のためメッキまたは液体窒素で凍結後の 200 μ G/ml の最終的な集中に G418 を追加します</li>。
</ol> 3。KSHV と EC の導入の感染 <ol><li>感染前に日に前述のように商業酵素解離ソリューションを使用して酵素消化によって EC を収穫します。EGM の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素の 1/10 倍の希釈液を準備するのにには、セルの 5 μ L を使用します。診断を使用して生きているセルをカウントし、シード 10/6 ウェル プレートのウェル EGM の 2 mL で 5 生きているセル x 2.5</li>。
	<li>感染の日削除 EGM と好評につき、3 ml の PBS のカルシウムとマグネシウムの細胞を洗浄し、追加 2 mL EBM 。
	注意: それは EGM のヘパリンはウイルス粒子の結合とターゲット理事会の後の感染を抑制する、感染、EGM ではなく、EBM を使用するが重要です</li>
	KSHV、細胞に感染する <li>は各ウェルに 5 に 20 μ L ウイルス ストックを加えてミックスするプレートを旋回します。モック感染細胞は、各ウェルに TNE バッファーの等しいボリュームを追加します</li>。
	<li>室温で 30 分間 400 x g でプレートを遠心し 90 分の 37 ° C でプレートをインキュベーションして</li>
	<li>研究の目標は、同期ウイルス感染、例えば、de novo 感染の初期イベントを必要とする初期のイベントを調査する場合は、この時点で接種ウイルスを削除します。2 mL の細胞を再フィードをすすいで新鮮な EGM。そうでなければ、2 mL EGM を追加し、文化を一晩インキュベートします</li>。
	<li>感染と一日おきに、後日 2 mL EGM で細胞を再フィードします</li>。
	<li>細胞が約 90% の合流、前述のように、市販の酵素分解溶液を用いたタンパク質分解酵素で収穫し、合計通路番号と通路の両方に注意、T75 に 3 つの井戸から細胞のプール感染後</li>。
	モック-KSHV-感染と EC 細胞の実験で使用されるまたは液体窒素で凍結する時に、少なくとも 2 つのより多くの文章の 1:3 分割 <li>を展開します 。
	注: E6 と E7 で導入した EC の分割とモックと KSHV 感染細胞のメンテナンス文化を分割する合流 (~ 85 ~ 90%) に達する前に</li></ol>。
 4。 確認感染抗体法による KSHV 注: KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ-1/ORF73) の検出は、感染症の信頼性の高い定量的測定を提供します。反ラナ抗体が市販。
<ol><li>染色、前日あたりでモックや KSHV-感染 EC 1 x 10 の 5 時 24 ウェル プレートに各セル板 2 井戸 1 mL EGM でよくし、一晩インキュベートします</li>。
	<li>500 で 2 回洗浄セル PBS とカルシウムと magniseum μ L。30 の洗浄ロッキング プラットフォーム上の s.</li>
	<li>Ventillated-外部からの発煙のフードでは、室温で 15 分間 4% パラホルムアルデヒドの 500 μ L でセルを修正します</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファー (0.1% トリトン X-100 プラス PBS プラスの陽イオンで 0.02% ヤギ血清) の 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>室温で 30 分間洗浄バッファーで 2% ヤギ血清 500 μ L で細胞をブロックします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>ラベルのモックや KSHV-感染した一次抗体の 200 μ L で EC 希釈 1:10 1 つの井戸ロッカーの部屋の温度で 30 分間洗浄バッファーの 0。200 μ L の洗浄バッファーのみで残りの 2 つの井戸をインキュベートします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>ロッカーの室温で 30 分間洗浄バッファーで希釈した二次抗体 1: 100 の 200 μ L ですべての 4 つの井戸のラベルします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>も取付中含む DAPI と観察の 20 μ L を適用し、倒立蛍光顕微鏡を用いた染色を評価します</li>。
	<li>は、少なくとも 200 セルのラナ陽性核の数を数えることによって KSHV 感染細胞のパーセント感染を決定します。感染組換え KSHV Bac16 は、GFP の表現のための文化の観察を介しても監視できます</li>。
</ol>

発癌は、生物36内で重要な保護手段を回避するマルチ ステップ プロセスです。KS 病変存在真の肉腫に慢性的な炎症のスペクトルに沿って、KSHV を介した特定の病態生理学的プロセスの解明は変換9をサポートする細胞培養モデルにおけるいくつかの研究を実施することが必要です。接触阻害とアンカレッジ依存性増殖、細胞のがん化を示す表現型の損失を容...

カポジ肉腫 (KS) は、高度な免疫抑制1の設定で最もよく開発する多焦点 angioproliferative 腫瘍皮膚や粘膜、内臓のサイトに影響を与えるです。4 疫学的フォームに記載されている: 古典的な地中海および中東遺産の高齢者に影響を与える通常無痛性フォーム医原性、臓器移植後免疫抑制薬による治療に起因伝染病、エイズの定義の癌の場合。風土性、アフリカの風土性の地域で子供たちに共通する HIV に依存しない形式です。HIV の治療のための効果的な組み合わせ抗レトロ ウイルス薬療法の出現で、流行の KS あまり一般的に発展途上国で診断されます。しかし、臨床的に積極的な風土病や伝染性の形態のまま最も一般多くのアフリカ諸国2,3,4で診断された癌。したがって、KS の治療のための効果的な病因標的薬剤の同定は研究の優先順位です。
組織学的, KS 病変は EC 起源の紡錘形細胞が不連続な血管網5を形作るという広範な異常な血管新生によって特徴付けられます。これらの異常な血管 (「血管スリット") は、病変の特徴的な色を与える赤血球漏出を許可します。また、病変は慢性炎症 (すなわち、リンパ球、マクロファージ、形質細胞) を特徴付ける多くの白血球を含みます。KS 病変の免疫再構築、次の回帰を説明したが、KS ハイパー増殖性病変と、真の腫瘍6,7,8,9の両方の機能があることを示唆しています。
KS ヘルペス ウイルス (KSHV)、カンザスの原因となるエージェントは、1994年10で確認されました。以来、多くの in vitro細胞培養モデルが開発されている病態研究を有効にするには、腫瘍生検材料プライマリから仔細胞を含むまたはテロメラーゼ発現 EC 感染 KSHV体外11,12,13,14,15,16,17,18. 現在利用できるモデルのどれも完全に KS 腫瘍微小環境を繰り返すが、すべては KSHV 感染症の病態を理解するための貴重な知識を貢献しています。異なり、他知られている発癌性ヒトヘルペス ウイルス エプスタインバー ウイルス (EBV)、KSHV 容易に変換されません次のde novo感染19,20,21,培養細胞22ですただし、この制限は、E6 と微小血管やリンパ管の起源を混合のいずれかのプライマリ人間 EC を伝達で克服されているとヒトパピ ローマ ウイルスから E7 遺伝子 KSHV23,24 の感染前に 16 を入力。.これらの外因性の遺伝子の発現は大幅に KSHV生体外の変換の可能性をさらに網膜芽細胞腫タンパク質および p5323,24の抑制を提供することによって増加の一部。この EC トランスダクション法が細胞遺伝子発現 KSHV 感染によって引き起こされるが、KS の細胞の生存・増殖25,26を容易にする表示されるホストでのキーの変更を識別するために複数の研究所を許可します。,27,28,29,30,31,32. 記載プロトコルは簡単で、再現性の高い、および KSHV 感染 EC の年齢と経過一致と一次電池よりはるかに長いために培養することができます、モック感染コントロールの世代になりますKSHV で採用されている発癌性発現機構の解明を可能にします。プロトコルには、プライマリ胸水リンパ腫細胞株 BCBL-1 E6 E7 不死化 EC から KSHV が非常にしやすいも野生型の製造方法が含まれていますが、遺伝子組換えバクミドの感染は KSHV BAC1630を派生します。BAC16 の準備のためのプロトコルは別の場所で説明33,34。

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

カポジ肉腫 (KS) ですが KSHV、血管内皮細胞 (EC) の感染によって開始され、免疫抑制の設定で最もよく開発する異常な腫瘍増殖の紡錘形細胞から成る。研究の数十年にもかかわらず KS の最適な治療の定義が不十分なままし、臨床転帰、リソース制限の設定に特に有利です。KS 病変、病的血管新生、慢性的な炎症と発癌、によって駆動され、これらのプロセスを研究する様々 な生体外で細胞培養モデルが開発されました。EC 系細胞は紡錘細胞前駆体の最も適切な体外サロゲートを提供するので、KS は内皮由来の KSHV 感染細胞から発生します。ただし、EC体外限られた寿命を持っているので、KSHV で採用されている発癌機構が他の発癌性ウイルスのものより効率が悪い、それされているプライマリの変換のプロセスを評価することは困難またはテロメラーゼ不死化理事会したがって、新規 EC 文化モデルは容易に KSHV 感染、次の変換をサポートする開発されました。ヒトパピ ローマ ウイルス 16 型の E6、E7 遺伝子の異所性発現の年齢と経過一致モックと KSHV-感染 EC 拡張の文化を可能にし本当に変形の開発をサポートしています (つまり、発癌性) 感染細胞培養における表現型.KS のこの扱いやすい再現性の高いモデルは、臨床の現場への翻訳の可能性が高いいくつかの本質的なシグナル伝達経路の発見を促進しています。

主な EC の形態は古典的な「石畳」として記述されて、ヒトパピ ローマ ウイルス E6 および E7 遺伝子 (図 1 a) の式によってこの形態は変わらない。単独での E6、E7 遺伝子の発現を変換された表現型; 誘発しません。したがって、細胞は抑制に連絡を受けやすい、分割文化の合流点に到達すると停止します。しかし細胞は増殖し、trypsinization とモック感染コ?...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV が宿主細胞を変換するメカニズムを研究するため一意に適しています。

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K ビュー.  University of Minnesota Medical School. カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV が宿主細胞を変換するメカニズムを研究するため一意に適しています。

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

免疫・感染学

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

生物学

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

急性上皮単純ヘルペスウイルスI型感染の ex vivo器官角膜モデル

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

神経科学

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

がん研究

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

モデル星細胞腫発症機序<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

カポジ肉腫ヘルペスウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

要約

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カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

急性上皮単純ヘルペスウイルスI型感染の ex vivo器官角膜モデル

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

モデル星細胞腫発症機序

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

要約

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カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

急性上皮単純ヘルペスウイルスI型感染の ex vivo器官角膜モデル

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

モデル星細胞腫発症機序

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

カポジ肉腫ヘルペスウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル