我々は、CRCと正常な腸粘膜の新鮮なサンプルを収集するためのロイヤルプリンスアルフレッドとコンコードの送還病院の解剖学的病理学研究所のスタッフに感謝。仕事は癌研究所ニューサウスウェールズ州トランスレーショナルプログラムの助成金によって賄われていた。

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="図1" /> CRCの手術標本からの生細胞の懸濁液の調製のための図1。作業の流れ。 1。臨床サンプルの分解すべてのサンプルはプロトコルナンバーX08 - 164の下のインフォームドコンセントとロイヤルプリンスアルフレッド病院（キャンパー、NSW、オーストラリア）とコンコードの送還病院（コンコード西、NSW、オーストラリア）から採取された。 <ol><li>新鮮な大腸癌（CRC）または腺腫の標本、および正常な腸粘膜腫瘍から10cm以上を収集。切除後最大12時間で4ハンクス平衡塩溶液のpHは7.3（HBSS）° Cで保管してサンプル。 </li><li>生物学的安全キャビネットクラスIIのすべての臨床サンプルを処理する、人間の病原体に対する安全規制に従ってください。 twoメス刃を用いてシャーレ内2mmの立方体にサンプルを分析する。 </li><li> 37℃で60分間、時折穏やかに混合しながら別のエッペンドルフチュー​​ブに腫瘍と正常組織をインキュベート℃で2％（v / v）のコラゲナーゼタイプ4（ワーシントン、レイクウッド、ニュージャージー州、米国）および0.1を含むRPMI 1640培地の等量とCウシpancreaseから％（w / v）のデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI、Sigma - Aldrich社）。 </li><li>力を10mLのシリンジからプランジャーを用いて微細なワイヤーメッシュのストレーナを介して組織を半消化、HBSSによるを通して洗浄細胞。 </li><li>細胞凝集体を除去するためには200μmと50μmのFilconフィルタ（BD Biosciences社）を介して得られた細胞懸濁液を渡します。 DNA、粘液や細胞凝集体のほとんどは、ろ過のこのシリーズでは削除されます。 </li><li> 5分間20℃で400 xgで細胞懸濁液を遠心してください。 </li><li> 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）を含む熱不活化FCSに再懸濁し、細胞ペレットは、-80℃でcryovialsとストアに徐々に凍結する。凍結処理は、サンプル中の粘液を減少させる傾向があり、赤血球を溶解。 </li></ol> 2。セルキャプチャ用のサンプル調製<ol><li> DMSOを洗い流すためにすぐにHBSSを10mLの37℃の水浴と再懸濁し、細胞のサンプルを解凍する。 </li><li> 5分間20℃で410 xgで細胞懸濁液を遠心してください。 </li><li>上清をデカントし、HBSS500μlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 0.1％（w / v）の室温で20分間DNase Iでサンプルを処理する。 </li><li>トリパンブルーを等量でそれぞれの細胞懸濁液の10μLを混合し、血球計数器に混合物10μLをロード。死細胞は色素を取る間、100倍の倍率で光学顕微鏡を使用して、、トリパンブルー排除による明確な表示、生細胞を、数える。最小4 × 10 6生存細胞をマイクロアレイ上での細胞のキャプチャに必要です。 </li><li> DNase処理に続いて、5分間20℃で410 × gで10 mLのHBSSと遠心機で細胞懸濁液を懸濁します。 </li><li> 200μLの最終容量にRPMI 1640で上清と再懸細胞ペレットをデカント。 </li></ol> 3。抗体マイクロアレイのセルキャプチャ<ol><li>リン酸塩にニトロセルロースのセクションを浸漬することによりDotScan抗体マイクロアレイを湿らせ、約20秒間緩衝食塩水（PBS）慎重にニトロセルロースのセクションに触れて避け、折られたキムワイプでマイクロアレイのガラスのエッジを拭いてください。 </li><li>湿度の高い部屋を提供するために、マイクロアレイのインキュベーショントレイに水を追加。チャンバーにマイクロアレイを置き、湿ったニトロセルロースセクションにRPMI 1640で細胞懸濁液をピペットで。ピペットでも細胞の広がりを確保するためにニトロセルロースの各コーナーにドロップします。 </li><li> 1時間、37℃でマイクロアレイをインキュベートインキュベーションは、細胞がマイクロアレイ上の抗体と接触して解決してくることができます。彼らはに着陸抗体に対応する表面抗原を発現する細胞がキャプチャされます。 </li><li>インキュベーション後、未結合の細胞を（洗浄あたり20秒）洗い流し少なくとも15 mLのPBSを備えた三谷に静かにして垂直にマイクロアレイをディップ。 </li><li>架橋によって細胞と抗体を固定するためにPBS中3.7％（w / v）のホルムアルデヒドを準備します。ゆっくりとマイクロアレイのニトロセルロースのセクションをカバーするために約1 mLをピペットで。室温で20分間インキュベートする。 </li><li>次ディップマイクロアレイPBS（15mLを、30秒ごと）の3変化に過剰なホルムアルデヒドを洗い流すこと。 </li><li>エッジとキムワイプでスライドガラスの裏面を拭くとDotScanスキャナの間を使用してマイクロアレイをスキャンする、ニトロセルロースのセクションでは、湿ったです。光学スキャンは、混合細胞集団、例えばCRC細胞、白血球や腫瘍の他の間質細胞の抗原の発現パターンが用意されています。 </li></ol> 4。多重蛍光<ol><li>スキャナからマイクロアレイを削除し、ブロッキングバッファー（2％w / vのBSA、2％熱不活化ヒトAB血清、PBS、pH7.3）を200μLを適用します。 20分間室温でマイクロアレイトレイでそれをインキュベートする。 </li><li> multipを準備アルミ箔で覆われてエッペンドルフチュー​​ブにレクサーソリューション：20μLフィコエリスリン、抗CD3（ベックマンコールター、Gladesville、NSW、オーストラリア、＃IM12824、1/7.5最終希釈）、10μLのAlexa Fluor ® 647 -抗EpCAM（Biolegend、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、1月15日希釈）、熱不活化ヒトAB血清（Sigma - Aldrich社、キャッスルヒル、NSW、オーストラリア）とブロッキングバッファー118μLの2μL。 </li><li>マイクロアレイから過剰なブロッキングバッファーを切ると均一に広がり、ニトロセルロースのセクションの上に多重化ソリューションをピペットで。室温で暗所で30分間インキュベートします。 </li><li> 15ミリリットル新鮮なPBSの三谷に垂直にマイクロアレイを浸し、（30秒ごと）。 </li><li> 4℃で暗所や店舗でマイクロアレイを乾燥させて·スライドボックスでC。マイクロアレイは、蛍光を損失することなく、最大3ヶ月間、暗所で保存することができます。 </li><li> 50（532 nmのレーザー、PEの580 BP30発光フィルター。633nmのレーザーとAlexa 647のための670 BP30エミッションフィルタ）に設定された解像度で台風FLA 9000スキャナ（GEヘルスケア、Rydalmere、NSW、オーストラリア）を使用して乾燥したマイクロアレイをスキャン。マイクロアレイは、ガラスのスキャナのトレイ上に下向きにニトロセルロース側でスキャンされます。 </li><li> 17にTIFFファイルのような蛍光画像と使用してPhotoshopのセットの画像サイズを保存する× 25センチ、解像度72ピクセル/ cmまで。ドットの強さを分析するDotScan解析ソフトウェアに画像をインポートします。 </li><li> DotReaderは、ドットの結合パターンのデジタル画像をキャプチャし、8ビットのgreynessのスケール上の各抗体のドット（1〜256 U）の細胞結合の密度を定量化する。時折以外の特定のアイソタイプコントロールのバインディングは、対応する免疫グロブリンのアイソタイプを持つ抗体の結合値から差し引かれた。各マイクロアレイ用ドット蛍光強度は100％の強度で設定された明るいドットに対して正規化された。信号/スポット強度。xmlファイル（生データ）に記録されているか。pdfファイル（最終報告）の棒グラフで表された</li><li>マイクロアレイheatsmapsと階層的クラスタリングは、TM4マイクロアレイソフトウェアスイート（から複数実験ビューア（MeV）のバージョン4.4を使用して行った<a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a> ）。階層的クラスタリングは、完全な連鎖解析と中性子を用いてバックグラウンド調整データに基づいて行った。ユークリッド距離を類似度のために使用されていました。等分散の2 -スチューデントのt検定は、結果の統計的有意性を決定するために使用された。 </li></ol> 5。代表的な結果： DotScanのマイクロアレイの結果から、重複して配列の間で一貫性のある細胞の結合パターンを示す必要があります。強力なアラ​​インメントドット結合（CD44/CD29）は、配列の領域にわたって配置されるグリッドが可能になります。図2は、最適なセルのキャプチャと多重化の例を示しています。図3は、細胞の捕獲と考えられる解決中に発生するいくつかの一般的な問題を示しています。 マイクロアレイのセルの結合の結果は、1から256までgreynessの尺度で表現ドット強度を測定することによって定量することができます。図4は、階層的クラスタリングとヒートマップとしてEpCAM -アレクサ647抗体で染色した58外科CRCのサンプルから数値データを、示しています。サンプル数が限られているにもかかわらず、同じステージのCRCは同じグループ内のクラスタに傾向がある。 <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。臨床大腸癌の腫瘍（オーストラリアクリニック-病理学的病期分類、ACPステージB1）のセルの結合パターン。重複してマイクロアレイ（概説）の左半分のために抗体の位置を示す（A）DotScanの抗体のキー。上部のセクションでは、DotScan白血病のマイクロアレイのオリジナル82抗体が含まれています。特定の表面抗原に対応する追加40抗体は、CRC&quot;衛星&quot;マイクロアレイとして追加され、文献でアップレギュレートであることがわかった。下のセクションでは、アイソタイプコントロール抗体マイクロアレイへの結合CRC細胞の（b）光のイメージで構成されています。 T -細胞を示す（C）CD3蛍光画像。 CRC細胞を示す（d）はEpCAM蛍光イメージ。 <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。貧しいDotScan結果と可能な解決策の例。 （a）低細胞結合、解決策は：、：最小化するためにマイクロアレイ上でインキュベーションする前に、サンプルに熱不活化ヒトAB血清を追加するソリューション少なくとも4x106生存細胞は、（b）に結合アイソタイプコントロールのバインドと非特定のセルが配列上にあることを確認してくださいアイソタイプコントロールのバインド。時折、ニトロセルロースへの細胞の非特異的結合の少量は、CRCのサンプルで発生し、大きく結果には影響しません。 （C）ニトロセルロースは、インキュベーション中に乾燥、溶液：試料が全体のニトロセルロースのセクションをカバーし、マイクロアレイは、平らな表面上でインキュベートされていることを確認します。 （d）高バックグラウンドのアーティファクト。ソリューション：確認してくださいマイクロアレイは、徹底的に、以下のインキュベーションを洗浄する。 <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。DotScan解析ソフトウェアは、1から256までgreynessスケールでの細胞結合密度を表す棒グラフを生成した。軸上の数字は、CD抗原を参照してください。 κ、λ、免疫グロブリン軽鎖; SIG、表面免疫グロブリン、DCC、大腸癌の蛋白質で削除、EGFR、上皮成長因子受容体、FAP、線維芽細胞活性化タンパク質、HLA - A、B、他の略語は、TCR、T細胞受容体です。 、B、CをそれぞれC、HLA - DR、ヒト白血球抗原DRと、MICA、MHCクラスI鎖関連タンパク質、MMP - 14、行列のmetallopeptidase 14; PIGR、高分子免疫グロブリン受容体、TSP - 1、トロンボスポンジン-1;役割を持つ、ヒト化抗CD20。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">拡大画像を表示するにはここをクリック</a> 。

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利害の衝突は宣言されません。

このビデオでは、我々はDotScan抗体のマイクロアレイは、CRCの組織からの細胞集団のために表面抗原のプロファイルを研究するために、単純な、半定量的な方法で使用することができる方法を示します。 エネルギー依存性のプロセス（例えば、キャッピング抗原および/または偽足形成が）、インキュベーション中の抗体のドットの全細胞の強固な結合に必要であるように...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬や機器の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H6136 - 10X1L </td><td> 25mMのHEPES（シグマ＃H3375）でバッファ</td></tr><tr><td> Airpure生物学的安全キャビネットクラスII </td><td>ウェスティングハウス</td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td>外科ブレード</td><td>リビングストン</td><td> 090609 </td><td> 100枚入りパック</td></tr><tr><td> 2 mMのHEPESをRPMI 1640 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R4130 - 10X1L </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプ4 </td><td>ワージントン</td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ1 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> DN25 - 1G </td><td></td></tr><tr><td>テルモシリンジ（10mL）を</td><td>テルモ</td><td> SS 10 L </td><td> 100のボックス</td></tr><tr><td> Filconフィルター（200μm以下） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filconフィルター（50ミクロン） </td><td> Filconフィルター（50ミクロン） </td><td> Filconフィルター（50μm）をFilconフィルター（50ミクロン）340603 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> 5810 Rを遠心</td><td>エッペンドルフ</td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td>ヒルシュマン</td><td>利用できません</td><td></td></tr><tr><td>光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコンTMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovialチューブ</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td>クライオ凍結contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan抗体マイクロアレイキット</td><td> Medsaic </td><td>利用できません</td><td></td></tr><tr><td> DotScanマイクロアレイの洗浄トレイ</td><td> Medsaic </td><td>利用できません</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリークラーク</td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F1635 - 500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td>利用できません</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9418 - 10G </td><td></td></tr><tr><td>熱不活化AB血清2パーセント</td><td>インビトロジェン</td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td>フィコエリスリン標識CD3 </td><td>ベックマンコールター</td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 -共役EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td>台風FLA 9000 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9558-08 </td><td> 532nmのレーザー、PEの580 BP30発光フィルター。 Alexa647のための633nmのレーザー、670 BP30発光フィルター</td></tr><tr><td>複数実験ビューアv4.4の</td><td> TM4マイクロアレイソフトウェアスイート</td><td>オープン - ソースソフトウェア（文献11） </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

CRCの現在の予後との分類は、病理組織学的および臨床所見を統合するシステムをステージングに依存しています。しかし、CRCのケースの大半で、細胞の機能不全は、蛋白質の発現と翻訳後修飾1を修正する多数の突然変異の結果である。 分化（CD）抗原のクラスターを含む細胞表面抗原、、の数は、CRCの潜在的な予後や転移性のバイオマーカーとして同定されている。これらの抗原は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および腫瘍関連マクロファージ（TAMS）のような他の細胞型で腫瘍の進行や相互作用とその発現しばしば変更、として理想的なバイオマーカーを作る。 癌のサブ分類と予後のための免疫組織化学（IHC）の使用はいくつかの腫瘍タイプ2,3のために確立されます。しかし、単一の&quot;マーカーは、&quot;臨床病理病期分類よりも大きな予後的意義を示していないか、すべてのCRCケースのルーチン病理報告で使用するために広く受け入れられています。 疾患の表現型の予後の層別化により最近のアプローチは、複数の&quot;マーカー&quot;を使用して表面のタンパク質プロファイルに依存しています。 such iTRAQとしてproteomic手法を用いて腫瘍の発現プロファイリングがbiomarkers4の発見のための強力なツールですが、それは検査室で日常的に使用するための最適ではありません及び混合集団で異なる種類の細胞を区別することはできません。さらに、腫瘍組織の大量のこれらの方法によって精製の細胞膜糖タンパク質のプロファイリングに必要とされています。 このビデオでは、DotScan CRCの抗体のマイクロアレイを用いた非集計CRCのサンプルから生細胞の表面にプロテオームのプロファイリングのためのシンプルな方法を説明した。 122 -抗体のマイクロアレイは、CRCのための40潜在的に予後マーカーの検出のための衛星地域と一緒に、系統特異的白血球マーカー、接着分子、受容体と炎症と免疫応答5のマーカーの範囲を認識し、標準の82 -抗体の地域で構成されています。細胞は、それらが対応する抗原を発現するための抗体に捕捉されています。光学走査によって決定されるドットあたりの細胞密度は、その抗原を発現する細胞の割合は、抗体6の抗原と親和性の発現のレベルを反映している。 CRCの組織または正常な腸の粘膜の場合は、光学スキャンは、細胞の混合集団の免疫表現型を反映している。蛍光多重化は、アレイ上に捕捉された目的の細胞の選択したサブ集団をプロファイルするために使用することができます。例えば、アレクサ647 -抗上皮細胞接着分子（EpCAM、CD326）は、フィコエリスリン、抗CD3、使用されている間、、CRC細胞とまた正常な腸粘膜の上皮細胞を検出するために使用されたパン上皮分化抗原であるT -細胞7浸潤を検出する。 DotScan CRCマイクロアレイは、解剖学的にベースのCRCのステージングシステムへの診断の代替のためのプロトタイプにする必要があります。

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

我々は、その後、表面抗原（DotScan CRCマイクロアレイ）を認識するカスタマイズされた抗体のマイクロアレイ上に捕捉されている実行可能な単一の細胞を、生成するために大腸癌（CRC）の分解のために手順を説明した。マイクロアレイに結合した細胞のサブ集団は、蛍光色素でタグ付けされたモノクローナル抗体を用いた蛍光多重化によってプロファイル化することができます。

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

colorectal-cancer-cell-surface-protein-profiling-using-an-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K ビュー.  University of Sydney. 我々は、その後、表面抗原（DotScan CRCマイクロアレイ）を認識するカスタマイズされた抗体のマイクロアレイ上に捕捉されている実行可能な単一の細胞を、生成するために大腸癌（CRC）の分解のために手順を説明した。マイクロアレイに結合した細胞のサブ集団は、蛍光色素でタグ付けされたモノクローナル抗体を用いた蛍光多重化によってプロファイル...

ビデオ: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

免疫・感染学

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular localization can provide insights into the functional role of bacterial proteins. Surface localization of bacterial proteins is a key step towards identification of virulence factors involved in mechanisms of pathogenicity. 
Methods for fractionating leptospiral membranes 2-5 may be selective for a certain class of outer-membrane proteins (OMPs), such as lipoproteins vs. transmembrane OMPs, and therefore lead to misclassification. This likely is due to structural differences and how they are associated to the outer membrane. Lipoproteins are associated with membranes via a hydrophobic interaction between the N-terminal lipid moiety (three fatty acids) and the lipid bilayer phospholipids 6, 7. In contrast, transmembrane OMPs are typically integrated into the lipid bilayer by amphipathic &beta;-sheets arranged in a barrel-like structure 8, 9. In addition, presence of a protein in the outer-membrane does not necessarily guarantee that the protein or its domains are exposed on the surface. Spirochetal outer membranes are known to be fragile and therefore necessitate methods involving gentle manipulation of cells and inclusion of sub-surface protein controls to assess the integrity of the outer membrane.
Here, we present an immunofluorescence assay (IFA) method to directly assess surface exposure of proteins on intact leptospires. This method is based on recognition of leptospiral surface proteins by antigen-specific antibodies. Herein, antibodies specific for OmpL5410 are detetcted aftero binding to native, surface exposed epitopes. Comparison of antibody reactivity to intact versus permeabilized cells enables evaluation of cellular distribution and whether or not a protein is selectively present on leptospiral surface. The integrity of outer membrane should be assessed using antibody to one or more subsurface proteins, preferably located in the periplasm.
The surface IFA method can be used to analyze surface exposure of any leptospiral protein to which specific antibodies are available. Both the usefulness and limitation of the method depends on whether the antibodies employed are able to bind to native epitopes. Since antibodies often are raised against recombinant proteins, epitopes of native, surface-exposed proteins may not be recognized. Nevertheless, the surface IFA method is a valuable tool for studying components of intact bacterial surfaces. This method can be applied not only for leptospires but also other spirochetes and gram-negative bacteria. For stronger conclusions regarding surface-exposure of OMPs, a comprehensive approach involving several cell localization methods is recommended 10.

An efficient method to assess surface-exposure of leptospiral proteins is described. The method is specifically designed to avoid disruption of the fragile outer membrane of leptospiral cells. This technique requires employment of several negative controls to assess the integrity of the outer membrane and specificity of antibody reaction.

レプトスピラ表面に露出したタンパク質の免疫蛍光アッセイ

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

蛋白質のマイクロ アレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム ・ ディフィシル感染症の血清学的定量

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.