この作品は、国立衛生研究所（助成08UDE017788-05）によってサポートされていました。 EBPはまた、科学技術のためのスペイン財団（FECYT）からの支援を認めるものです。著者は、原稿の重要な読書のためにShonda T.ゲイロードとPratyusha Mogalisettiに感謝します。

<img alt="図1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> 図1。唾液プロファイリングに光ファイバー微小球抗体アレイを適用するためのワークフロー （1）マイクロスフェアが内部二つの蛍光色素を用いて符号化され、（2）符号化されたマイクロスフェアは、外部タンパク質特異的モノクローナル抗体で修飾され、（3）多重化されたマイクロスフェアが混合され、 （5）唾液タンパク質は、サンドイッチイムノアッセイを介してマイクロスフェアに捕捉される、および（6）蛍光顕微鏡を用いて定量し、（4）ランダムに光ファイバ束の近位端にエッチングしたマイクロウェル内に堆積。 1。マイクロスフェアエンコーディング<ol><li>琥珀色のガラスバイアル中でナトリウムユウロピウム（III）thenoyltrifluoroacetonate三水和物（EU-TTA、MW = 869.54グラム/モル）を計量し、テトラヒドロフラン（THF）に200 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に確認してください染料が完全に溶解する。 </li><li>琥珀色のガラスバイアル中のクマリン30（C30、MW = 347.41グラム/モル）を計量し、THF中の12 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に色素が完全に溶解していることを確認します。 </li><li> 表1に記載されている最終濃度に達するためにストック溶液及びTHFを使用して、各微小球タイプのワーキング溶液700μLを準備します。 </li><li>マイクロスフェア（10％W / V）がよくボルテックスで懸濁した後、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに60μlの懸濁物を転送していることを確認してください。 </li><li>微小球懸濁液を600μlのPBSを加え、20Xピペッティングして混ぜる。 3分間10,000 rpmでチューブを遠心分離し、上清を注意深く除去します。微小球を洗浄するためにこのプロセスを別の2倍を繰り返します。 </li><li>ステップ1.5と同様の手順を使用して、THFでミクロスフェアペレット3回洗浄します。 </li><li> 3分間、10,000 rpmで、微小球/ THF懸濁液遠心し、上清を除去し、600μlのペレットを再懸濁作業溶液は、 表1に記載されている。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに混合物を転送します。 </li><li>パラフィルムでマイクロチューブを密封し、振とう機の上に置きます。 3,000 rpmで振ると24時間インキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用してセットアップを覆うことにより、光から保護します。 </li><li>ペレットを形成するために3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。 </li><li> 、上澄み色素溶液を除去600μlのメタノールでマイクロスフェア6Xを洗った後、0.01％のTween-20、別の6X、ステップ1.5で説明したようにを含む600μlのPBSで。 </li><li>使用するまで4℃で0.01％のTween-20を含む600μlのPBS中で符号化された微小球を保存する、光から保護します。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> マイクロスフェア型名： </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </強い&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> EU-TTA（MM） </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30（MM） </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> 表1。のEu-TTAやC30ワーキング溶液の濃度。 2。タンパク質捕捉ミクロスフィアの調製<ol><li> MES緩衝液調製[2 - （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、0.1MのNaCl 0.9％SDS、0.01％、pHが5.7]、およびPBS / SDS緩衝液（リン酸ナトリウム、0.01MのNaCl 0.154Mの、SDS、0.01％、pHが7.4）を室温で事前に。 </li><li>セーフロック1.5mlのマイクロチューブに（〜2mgのマイクロスフェアを含む）200μlの符号化された微小球懸濁液を追加します。なお、ステップ2.6でのインキュベーションの間にこぼれを回避するために、マイクロチューブのこのタイプを使用することが重要である。 </li> &lt;李&gt;ステップ1.5で説明したように3倍のバッファ600μlのMESで微小球を洗浄します。ミクロスフェアペレットに700μlのMESを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。 </li><li>調製0.105グラム/ mlの1 - エチル-3 - [3 - ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC、MW = 191.7グラム/モル）および0.163グラム/ mlのスルホ-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS、MW = 217.13グラム/モル）別々のチューブ内のMES緩衝液中の溶液。 </li><li>たて微小球懸濁液にドロップによる EDC溶液降下を用意し150を添加する。 EDCは、従って、それが固定化効率を確保するために新たに調製した溶液を用いることが必須であり、非常に迅速に加水分解する。すぐにEDCを加えた後、マイクロスフェアに150μlのスルホ-NHS溶液を加え、ピペットでよく混和し、懸濁液が均質であることを確認します。 </li><li>チューブに蓋をパラフィルムでそれを封印し、シェーカー上に置きます。 4時間1,500 rpmで振る、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。 </li><li>微小球suspensを遠心分離ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでイオン。ステップ1.5で説明したように500μlのPBS / SDS緩衝3Xで微小球を洗浄します。 </li><li> 、ペレットに200μlのPBS / SDS緩衝液を追加するだけでなく、微小球を混ぜて60μgの捕獲抗体を含有する300μlのPBS / SDS緩衝液にソリューションを移す。これは、最初のマイクロスフェアペレットを一時停止した後、抗体溶液に微小球懸濁液を添加することが重要である。 </li><li>アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、シェーカー上、4時間1,500 rpmで振とうすることにより、抗体 - マイクロスフェア混合物をインキュベートする。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。 500μlのStartingBlock（TBS）ステップ1.5で説明したように、バッファ3回ブロッキング微小球を洗浄します。 </li><li>ブロッキングバッファーのTBS 1mlの微小球を混合し、シェーカー上で1時間、1,500 rpmで微小球をインキュベートし、箱の入り江を利用し、光から保護するアルミホイルで赤い。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去するために3分間7,000 rpmで微小球懸濁液を遠心分離する。ステップ1.5で説明したように、ブロッキングバッファー500μlのTBSでペレット3回洗浄します。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去し、3分間7,000 rpmでマイクロスフェア溶液を遠心分離する。ブロッキングバッファー500μlのTBS系を加え、ピペッティングにより混和する。 </li><li>光から保護し、使用するまで4℃で修正された微小球懸濁液を格納します。 </li><li>対応する抗体を使用したマイクロスフェアの他のタイプを作るために、この手順を繰り返します。 </li></ol> 3。光ファイバーマイクロアレイアセンブリ<ol><li>新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質捕捉マイクロスフェアの各タイプの50μLを混合します。遠心分離機株式マイクロスフェアは、3分間7,000 rpmでプール、残りの容量は、約100μLになるように上清を除去します。 </li><li>長さは約5cmにハンドカット光ファイババンドルと順次フィルムラッピング30、15、9、6、3、1、0.5、および0.05ミクロンサイズのダイヤモンドを使用した研磨機で両端を磨く。任意の粒子を除去するために2分間の脱イオン水に磨かバンドルを超音波処理。 </li><li> 0.5mlのマイクロ遠心チューブに小さな磁気撹拌バーを入れ、タンパク質を含まないPBS緩衝液400μlを添加し、気泡を除去するために30分間、磁気撹拌プレート上で撹拌する。 </li><li> 150秒10,16のための0.025 N HCl溶液中で洗練された繊維束の一端をエッチングする。すぐに1分間の脱イオン水にエッチングされた端を水没し、超音波処理。圧縮空気で繊維束を乾燥させます。 </li><li>ファイバホルダに繊維束をマウントし、1時間気泡のない、タンパク質を含まないPBSバッファにエッチングされたエンドをブロックします。 </li><li>光ファイバ束のエッチングされた端に格納されたミクロスフェア懸濁液の預金1μlの分量。アルミホイルの箱の光からセットアップを保護し、15分間待ちます。懸濁液の体積ます蒸発によって減少し、エッチングされたマイクロウェルにマイクロスフェアを強制。この装填工程をもう一度繰り返します。 </li><li>マイクロウェルにトラップされていない微小球を除去するために試料溶液を飽和させた綿棒を使用してください。タンパク質マイクロアレイが使用できるようになりました。唾液分析用に4.1をすぐにステップ移動します。 </li></ol> 4。微小球マイクロアレイを用いた唾液サンプルの分析<ol><li> 200μlの試料溶液（ブロッキング緩衝液。唾液上清の収集プロトコルは以前に10公開されているStartingBlock T20（PBS）等容量の希釈した100μlの唾液上清）を追加する。 0.5ミリリットルオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブに。溶液中に繊維上にロードされたタンパク質マイクロアレイを浸し、2時間600rpmで振とう機上でインキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。 </li><li> PBS、マイル19.6ミリリットル中に200μlの10％BSA溶液及び200μlの10％のTween-20を添加して20ミリリットルの洗浄緩衝液を調製静かに振とうすることにより十分にX。 </li><li> 200μlの洗浄緩衝液を含む新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質マイクロアレイを浸し、2分間600rpmで振とうする。この洗浄3回繰り返します。 </li><li>抗VEGF、IP-10、IL-8、EGF、MMP-9を5μg/ mlを含む検出抗体カクテル100μlの溶液中にマイクロアレイをインキュベートし、StartingBlock T20におけるIL-1βのビオチン化検出抗体（PBS）をブロッキング緩衝液600rpmでシェーカー上で室温で30分間、アルミホイルで覆われたボックスを使用して、光から保護する。 </li><li>ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ3回洗浄します。 </li><li>アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、10分間シェーカー上600rpmで、PBS中20μg/ mlのストレプトアビジンR-フィコエリスリン複合体（SAPE）溶液200μlに、マイクロアレイをインキュベートする。 </li><li>ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ5Xを洗浄します。 </li><li>ファイバー離れて（ すなわち 、最後の先端部を清掃してくださいマイクロスフェアからの）無水エタノールで飽和綿棒でバンドル。 </li><li>圧縮空気が繊維の両端を乾燥させる。光ファイバの遠位端を通って落射蛍光顕微鏡画像上に繊維をマウントします。 </li><li>のEu-TTA、C30、およびSAPE蛍光発光強度に対応したマイクロスフェアの画像を取得。のEu-TTA、C30、およびSAPEの蛍光撮像用の光学フィルタのセットアップおよび曝露時間は、 表2に示されている。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> チャンネル </td><td> EU-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td>励磁機</td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td>ビームスプリッタ</td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td>エミッター</td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td>露光時間</td><td> 1秒</td><td> 0.3秒</td><td> 1秒</td></tr></tbody></table> 表2。マイクロアレイの3蛍光画像用のパラメータ。

<ol>
	<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarray. , (2004).</li><li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1/Th2+cytokines+using+microarrays.">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines.">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li><li>de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers.">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li><li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis.">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li><li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva.">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+to+drool+for.">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li><li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies,+proteomics+and+genomics.">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li><li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics:+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better.">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li><li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li><li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics.">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li><li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+nanowell+arrays.">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarrays. , (2005).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

研究者は、次の手順に特別な注意を払う必要があります：より良いデコード精度のためには、マイクロスフェアが均一にすべてのインキュベーションに懸濁し、検証し、マイクロスフェアの符号化手順の間にステップを洗浄する必要がある。また、符号化されたマイクロスフェアは、実験全体を通して、光から保護される必要がある。適切な符号化及び記憶手順に従って、我々は、全体の復?...

1990年代半ばにマークSchenaとその共同研究者によって報告される最初のマイクロアレイので、この強力なツールは、生物学的研究1の多くの分野で利用されている。同時に、血液などの体液の診断、内の複数のタンパク質を検出する抗体マイクロアレイは、臨床診断やバイオマーカーのスクリーニング2月10日の重要な用途がある。唾液は、血液と同じ分析物の多くを含む、唾液の収集は、安全で非侵襲的であるため、血液の好ましい代替手段として考えられており、最小限の訓練を受けた医療従事者11-13によって行うことができる。現在、唾液サンプルを用いて多重化されたタンパク質の分析は、標的分析物14の濃度が低いと、異なるバイオマーカー15の広い濃度範囲を含むいくつかの重要な要因によって制限される。 。 ここで、我々は、6つのタンパク質の解析を実証する：ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-8（IL-8）、上皮成長因子（EGF）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP-9）、インターロイキン-1β（IL-1β） 。方法の性能は、最初に標準溶液組換え被分析タンパク質を構成し、ブロッキング緩衝液を使用して確認した。別の慢性呼吸器疾患の患者さんだけでなく、健常対照から収集された実際の唾液サンプルにも十分な性能を試験した。プロトコルは、他のタンパク質分析物と他のマイクロスフェアベースのアッセイに適用可能であるべきである。それは、ANと比較して、高速、正確、かつ広いダイナミックレンジを有するいくつかのタンパク質の低濃度の再現性の同時分析、最小限の非特異的相互作用、還元試料消費、および低コストを可能にするように、このプラットフォームは、分析化学の分野にかなりの利点を提供する類似酵素免疫測定法（ELISA法）。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eu-TTA dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42319-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34865-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 30 dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>PC05N/6698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tw-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BupH MES buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS256-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR labshop</td>
			<td>53511-997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IP-10 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MMP-9 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-1&#946; capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock (TBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard solution 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGF 165</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IP-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>266-IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human MMP-9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>911-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>201-LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker BSA in PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated VEGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IP-10 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-8 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated EGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated MMP-9 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-1&#946; detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-phycoerythrin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-21388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent microarray for human salivary protein analysis using polymer microspheres and fiber-optic bundles

ここで、我々は、同時に光ファイバー微小球ベースの抗体アレイを用いて唾液中に6つのタンパク質を測定するためのプロトコルを記載している。採用免疫アレイ技術は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスフェアベースのサスペンションアレイ製造の利点を兼ね備えています。ビデオプロトコルに記載のように、市販さ4.5μmのポリマーミクロスフェアは、物理的に微小球の内部に閉じ込められた二つの蛍光色素の濃度によって区別7種類、に符号化された。表面にカルボキシル基を含有する符号化されたマイクロスフェアは、EDC / NHSカップリング化学を介してモノクローナル捕捉抗体で修飾した。タンパク質マイクロアレイを組み立てるために、符号化及び官能化ミクロスフェアの異なる種類を混合し、無作為に化学的に光ファイバ束の近位端にエッチングされた4.5μmのマイクロウェル内に堆積される。光ファイバ束は、キャリアの両方としておよびmを画像化​​するために使用したicrospheres。一旦組み立てられると、マイクロアレイは診療所から収集された唾液上清中のタンパク質を捕捉するために使用した。検出は、ストレプトアビジン結合蛍光プローブ、R-フィコエリスリンと異なる分析物について、ビオチン化検出抗体の混合物を用いたサンドイッチ免疫測定法に基づいた。マイクロアレイは、微小球の登録およびアッセイシグナルのための1のための3つの異なるチャネル、2に蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光顕微鏡写真は、次いで、デコードされMATLABに自家製のアルゴリズムを用いて分析した。

光ファイバ束の小断面を示すつのチャネルからの蛍光画像は、 図2A-Cに示されている。 （ディスカッションセクションにおいてより詳細に記載されるように）これらの画像は、MATLABで記述されたアルゴリズムを用いて分析した。分析は、マイクロスフェアを復号するためのEu-TTA符号化画像（ 図2A）からの情報及びC30符号化画像（ 図2B）の両方を採用し、?...

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Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.6K ビュー.  Tufts University. 私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用?...

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Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, have high porosity, high surface-to-volume and strength-to-weight ratio. Unfortunately, common approaches for preparation of metallic nanostructures render materials with highly disordered architecture, which might have an adverse effect on their mechanical properties. Block copolymers have the ability to self-assemble into ordered nanostructures and can be applied as templates for the preparation of well-ordered metal nanofoams. Here we describe the application of a block copolymer-based supramolecular complex - polystyrene-block-poly(4-vinylpyridine)(pentadecylphenol) PS-b-P4VP(PDP) - as a precursor for well-ordered nickel nanofoam. The supramolecular complexes exhibit a phase behavior similar to conventional block copolymers and can self-assemble into the bicontinuous gyroid morphology with two PS networks placed in a P4VP(PDP) matrix. PDP can be dissolved in ethanol leading to the formation of a porous structure that can be backfilled with metal. Using electroless plating technique, nickel can be inserted into the template&#39;s channels. Finally, the remaining polymer can be removed via pyrolysis from the polymer/inorganic nanohybrid resulting in nanoporous nickel foam with inverse gyroid morphology.

This article describes the preparation of well-ordered nickel nanofoams via electroless metal deposition onto nanoporous templates obtained from self-assembled diblock copolymer based supramolecules.

ジブロック共重合体超分子からジャイロイドニッケルナノ構造

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

化学

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.
The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

リン酸化ペプチドの強化充実のためのマクロポーラスポリマーモノリスの高度に多孔性配位高分子コーティングの製造

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous solution. In a carbon nanotube/PEO105-PPO70-PEO105 (poloxamer 407) aqueous solution, the amphiphilic poloxamer 407 adsorbs onto the carbon nanotube surfaces and self-assembles into continuous layers, driven by intermolecular interactions between constituent molecules. The addition of 5-methylsalicylic acid changes the self-assembled structure from spherical-micellar to a cylindrical morphology. The fabricated poloxamer 407/carbon nanotube hybrid particles exhibit thermo-responsive structural features so that the density and thickness of poloxamer 407 layers are also reversibly controllable by varying temperature. The detailed structural properties of the poloxamer 407/carbon nanotube particles in suspension can be characterized by small-angle neutron scattering experiments and model fit analyses. The distinct curve shapes of the scattering intensities depending on temperature control or addition of aromatic additives are well described by a modified core-shell cylinder model consisting of a carbon nanotube core cylinder, a hydrophobic shell, and a hydrated polymer layer. This method can provide a simple but efficient way for the fabrication and in-situ characterization of carbon nanotube-based nano particles with a structure-tunable encapsulation.

A method for the functionalization of carbon nanotubes with structure-tunable polymeric encapsulation layers and structural characterization using small-angle neutron scattering is presented.

小角中性子散乱による熱可逆性ブロック共重合体と特性を持つ単層カーボンナノチューブの機能化

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

サーモ可逆架橋ゴム経由アルダー化学の合成と性質

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

マイクロ流体ドライ回転と再生絹フィブロイン繊維の特性

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

電気化学インピー ダンス分光電気化学定数推定法のためのツールとして

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

時間分解光物性評価のトリプレット収穫有機化合物無酸素環境使用、iCCD カメラ

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

サイクリックボルタンメトリー、紫外-可視-近赤外、および EPR 分光電気化学を使用して有機性化合物を分析するには

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

タンパク質吸着とポリマー力学の石英結晶マイクロバランス測定におけるサンプル調製

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...