多重免疫蛍光プロトコルの開発最適化と転送は複雑で困難であるため、このプロトコルは重要です。多くのラボでは、最適化されたプロトコルのつま先ホールドは非常に貴重です。マルチスペクトル免疫蛍光は、腫瘍内および腫瘍の周囲の複数の細胞タイプの位置と同一性の両方を評価することを可能にする。
これは免疫腫瘍学研究における情報の強力な組み合わせです。多重免疫蛍光の最も魅力的な使用は、免疫腫瘍学です。しかし、setuで複数の免疫細胞タイプを調査する能力は、すべての自己免疫療法および炎症性療法で活用することができます。
固形細胞とその周辺の免疫細胞の位置と表現型を知ることは、腫瘍特異的免疫療法に対する予後および予測可能な応答の両方である。プロトコルの最適化と検証は、急ぐべきの重要なステップです。新しい開発者は、マルチスペクトルイメージングに関連する新しい種類のアーティファクトに慣れる必要があります。
基本マルチプレックスプロトコルを見つけるには、それを自動染色器にプリロードします。プロトコル画面で優先されるのではなく、すべてでフィルタリングします。変更を加える前に、元のプロトコルを保存し、プロトコルタブをクリックし、コピーを選択するOpal 6多重を右クリックします。
新しいウィンドウで名前を7多重プロトコル1'に変更し、正しいデバイスに関連付けられているタブを選択します。補足テーブルS1'にプロトコルを一致させ、試薬を追加して10分間のパロキシディス阻害ステップを加え、ペルオキシダーゼ阻害剤を試薬として選択する。ブロッキングステップがプロテインキナーゼ阻害剤遮断緩衝液を利用していること、各初代抗体が適切な試薬を指していること、二次抗ボディステップが西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーを利用していること、およびマルチスペクトル自動化キットを備えたスペクトルダピが利用されていることを確認する。
プロトコルにペルオキシダーゼ阻害剤が含まれていることを確認し、続いてタンパク質遮断ステップ、一次抗体、二次抗体、チラミド床、抗原検索を含む6つの逐次染色が続いて、抗体を除去する。ドロップコントロールを追加するには、7多重プロトコル1'nameをコピーし、7多重プロトコル1 CD68ドロップに変更します。CD68抗体試薬をマウスIgGに変更し、プロトコルを保存します。
次に、ドロップコントロールごとに 1 つずつ、完全な iso 型制御用に、同じ方法で 6 つの新しいプロトコルを作成します。ここで示したのと同じ方法で、各ターゲットのドロップ制御プロトコルを作成します。研究検出キットを作成するには、1X トリスバッファー塩水用にマークされた 30 ミリリットルのオープンコンテナに 1X トリスバッファ付生理食塩水を充填し、マルチプレックス リサーチ キット 1 のハンドルから最も遠い位置にコンテナを配置します。
2つの30ミリリットル開いた容器muli-spectralブロック'とマルチスペクトル二次にラベルを付け、マルチスペクトル染色キットから30ミリリットルのブロッキング緩衝液抗体希釈剤をムトリスペクトルブロック容器に充填する。マルチスペクトル染色キットから抗マウス抗狂犬病二次抗体ポリマーを30ミリリットルのマルチスペクトル二次容器に充填し、600マイクロリットルの抗体希釈液を10個の7ミリリットルの開いた容器のそれぞれに加えます。次に、濃縮された一次抗体を表に示されたボリュームの適切なチューブに加え、穏やかなピペットで混合します。
3ミリリットルの二重蒸留水に加え、スペクトルダピ12滴を1つの7ミリリットルのオープンコンテナに加え、3ミリリットルのペルオキシダーゼブロックを2番目の7ミリリットルのオープンコンテナに加えます。75マイクロリットルのジメチルスルホキシドで各リアタール化床を再中断し、ピペットで混合します。その後、タイラミド信号増幅床の在庫を摂氏4度で準備完了まで保管します。
個々のTSA床希釈液を準備しながら。すべての試薬をオート染色器に登録し、各容器を試薬ラックに入れ、すべての試薬を自動染色器に積み込みます。染色剤は、存在を検出し、各試薬の体積を確認します。
すべての試薬がロードされたら、プロトコルを起動して一晩実行します。染色手順の最後に、カバースリップでサンプルを取り付け、スキャン用にマルチスペクトルイメージングプラットフォームスキャナにサンプルをロードします。すべてのサンプルがスキャンされると、画像は qptiff ファイルとしてフォーマットされます。
適切な qptiff 分析ソフトウェア プログラムを開き、[Load Slide] をクリックして、目的のスライドの 5 つのフィルター全体のスライド スキャンを開きます。ログインしてスタンプツールを使用して、マルチスペクトルイメージング用の5つの領域を選択します。[選択対象:フィールドのサイズで取得]を選択:1x1を選択し、フィールド解像度の下で0.5マイクロメートル20xを選択します。
このサイトケラチン染色に基づいて、細胞ケラチン陽性腫瘍組織の両方を有するいくつかの領域を選択し、かつ全体的なスキャンから画像化されるサイトケラチン陰性間質組織を選択する。すべてのマルチスペクトル画像が選択されたら、Vectraソフトウェアに切り替え、各スライドのスキャンからマルチスペクトルイメージングにタスクを変更します。次に、スキャンをクリックして、マルチスペクトルイメージング収集を実行します。
マルチスペクトル画像の取得が完了したら、スペクトルを混合解除するソフトウェアを使用して、マルチスペクトル画像フォルダ内のファイルを開きます。[イメージ形式] で[マルチスペクトル'アンダーサンプルフォーマット'選択蛍光'とスペクトルライブラリソース'選択するinForm'床を選択するには、6つのフロアすべてを選択してロードし、サンプルライブラリスライドからdapiを選択し、すべてを準備をクリックします。スペクトル非混合ソフトウェアは、提供されたスペクトルプロファイルを使用して、すべてのオープン画像でスペクトルアンミックスを実行します。
自動蛍光スペクトルプロファイルを識別し、そのプロファイルにアソインストレーターを付けます。自動蛍光機能を確認して、混合解除後にオート蛍光チャネルに完全にキャプチャされていることを確認し、許容可能に除去されるまで異なるサンプリングをテストしてください。次に、同じ標的の染色パターンを、同じ組織の順次スライドで病理医と評価する。
各チャンネルの蛍光強度を評価するには、カウントツールを使用して、開いている画像を調査します。次に、染色プロトコルに戻り、TSA濃度を調整して、許容範囲を超えたか、または許容範囲に達しない正規化されたカウントに対処します。この代表的な分析では、扁桃組織は扁桃表面内で明確に定義されたサイトケラチン染色を実証し、陰窩骨の網状上皮において明らかなサイトケラチンおよびPDL-1染色を有するリンパ球組織の背景を持たない扁平上皮を示した。
濾胞性胚葉センターは容易に認識でき、Ki-67陽性リンパ球が豊富であった。胚中心内に存在するマクロファージは、生殖中心の外側にも観察されたいくつかのマクロファージを用いてCD-68発現によって同定された。T細胞分布とPD-1発現を有するCD-8染色リンパ球は、生殖中心の周辺に集結した小リンパ球を強く染色し、ならびに濾胞領域全体に散在した。
扁桃組織制御で期待される染色パターンが確認された後、同じ染色を肺癌サンプルで評価することができた。アイソタイプの陰性コントロールとドロップコントロールも評価する必要があります;背景や自動蛍光の検出だけでなく、傘の効果やスペクトルブリードについても評価する必要があります。ドロップコントロールは、新しいマルチプレックスパネルの最適化中にマルチプレックス免疫蛍光法による染色における潜在的なアーチファクトを評価するために重要です。
各ドロップコントロールは、各特定のコントロールで除去されるべき単一の一次抗体を除いて、完全なマルチプレックスパネルと同じ染色パターンを示す必要があります。マルチスペクトル免疫蛍光による免疫プロファイリングは、免疫基準による腫瘍および領域の階層化を可能にし、ゲノム、トランスクリプトーミック、プロテオミクスの研究によって解析することができます。私は、多プレックス免疫蛍光を使用して、がん学や自己免疫疾患の作用機序を調べ、セトゥの単一のセクションで免疫細胞と病原性細胞の同定と特性評価を可能にしました。
ヒトタンパク質、チラミド、ダピに対する抗体を扱う場合は一般的な予防措置を講じる必要がありますが、このプロトコルの試薬や材料は特に危険であることが知られていません。
