この研究室は、保健研究、カナダ自然科学工学研究評議会、およびカナダの多発性硬化症協会（MSSC）のカナダの協会によって支えられてきた。 GSTSはMSSCから博士課程学生の身分の受け手だった。我々は、この原稿で多くの有用な議論とコメントの博士ジョアンボッグス（小児病院、トロント）に感謝しています。我々は、追加のNucView 488カスパーゼ3の彼らの寛大な贈り物用Biotiumに感謝しています。

1。解凍と培養細胞<ol><li>長期的な液体窒素の店から冷凍不死N19 -オリゴデンドログリア細胞の株式を取得する。 </li><li>細胞懸濁液が完全に融解するまで37℃のウォーターバスを細胞を含む浸しバイアル。 </li><li> 10cmの培養皿に10％FBS（ウシ胎児血清）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEM中の7 mLの（ダルベッコ変法イーグル培地）を追加します。 </li><li>細胞懸濁液をプレートに滴下し、穏やかに攪拌し、均一に細胞を分散させるためにペトリ皿を揺するを追加。 </li><li> 34 ° C / 5％CO 2インキュベーターで培養細胞。 </li><li> 4時間後、プレートから吸引メディアは、凍結保護剤として使用されていた残りのDMSO（ジメチルスルホキシド）を削除する、および（10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足した7 mLのDMEM高グルコース培地）を新鮮な培地と交換してください。 </li></ol> 2。継代細胞<ol><li> 70から80パーセントで合流点は、（4-7日間の成長）、細胞から培地を吸引除去する。 </li><li>プレートに0.25％トリプシン液1mLを追加。細胞を（約5分）デタッチするピペットトリプシン。 </li><li>実験条件と通過するための適切な希釈細胞密度劣らずその0.1 × 10 6細胞/ mLで、将来の実験のための追加の10cmのプレートを作る。 </li></ol> 注：この実験のためにそれらを使用する前に、融解後の少なくとも二回通過して細胞をしてください。 3。細胞をカウントし、めっき<ol><li>生細胞イメージングのためのプレートの細胞に、前述のようにトリプシン処理。 </li><li>細胞の約30μLを削除し、haemocytometerを使用して数える。 </li><li> 6ウェルプレートにコーティングされていないガラスのカバースリップを置きます。 34で10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン、° C / 5％CO 2を添加した2 mLのフェノールを含まないDMEM高グルコース培地で0.1 × 10 6細胞/ mLの密度、にウェルにセルを追加。 </li><li>許可34で（16〜20時間）一晩増殖する細胞° C / 5％トランスフェクションの前にCO 2。 </li></ol> 4。トランスフェクション<ol><li> 100μLの無血清培地、プラスミドDNAを精製0.5から4μgの、および4μLトランスフェHD（Roche）を組み合わせる。渦は、静かに混和する。 </li><li>簡潔に再びボルテックスし、室温で5分間複合体にDNAを可能にし、培養細胞に直接トランスフェHDのDNAの混合物を追加。穏やかに混合するためにプレートを傾けて。 </li><li> 34 ° C / 5％、治療前や実験へのCO 2でさらに48時間培養では細胞。 </li></ol> 5。ライブセルイメージングのための準備細胞（LCI） <ol><li>あなたが実験を開始する前に、LCI Chamlide生細胞計測器制御ボックスに少なくとも1時間を切ります。コントロールボックスには、LCI Chamlide内の温度と湿度を調節し、プレミックス、5％CO 2の流れを調整する。 </li></ol> 注：これは、にお勧めですステージ全体が34に達することを保証するために実験を開始する前に、最大3時間までコントロールボックスをオンに℃をこのステップは、撮像中に、それは温めとしてfluxulationと金属のステージの熱膨張によって引き起こされる焦点ドリフトを、減らすことができます。 <ol start="2"><li>フローフードでの作業、70％エタノールで、Chamlide磁気型培養チャンバー、およびピンセットをスプレーし、それらを5分間乾燥させます。 </li><li>インキュベーターから細胞を取り出して、それらが健康であることを確認してください。彼らは、接着表示され、多数の膜プロセスとカバーガラスでよく広げてください。トランスフェクションから強調している細胞は、実験には適していない、およびプロセスの拡張子の数を減らす必要があります、としばしば不規則な形状の核を持っている。 </li><li> 6 - ウェルプレートを傾けて、ピンセットでカバーを取り外します。迅速に培養チャンバーの底板にカバーガラスの細胞の側を上に置きます。カバースリップを乾燥させないでください。 </li><li>磁気メインを取り付けます培養チャンバーの本体とカバースリップの上にオリジナルの6ウェルプレートから培地を500μLを加える。再使用してこのメ​​ディアは、環境の変化によって引き起こされる細胞にかかる負荷の量を減少し、また、細胞外分泌因子を評価するのに役立ちます。 </li><li>培養チャンバーのガラスカバーを置きます。 </li><li>顕微鏡と干渉するカバーの底からの残留物質を除去するために70％エタノールでスプレーキムワイプを、使用してください。 </li><li> 34に培養チャンバーを配置° C / 5％CO 2インキュベーターで30分間。このステップでは、チャンバー自体が金属のウォームアップとして° Cはカバースリップのシフト減らすために34に温まることが保証されます。 </li></ol> 6。顕微鏡の設定画像は複数の車輪のカートリッジのロードのためにカスタムのリレーレンズと発光フィルターホイールハウジングとライカDMIRE2倒立顕微鏡を使用して、ここで取得しました（クォーラムTechnologies社、Guelph、ON）。 <ol><li>明視野 - 240ミリ秒〜2.5 Vと露光時間のランプのセット。 </li><li>赤色蛍光タンパク質（RFP） - 200ミリ秒140で設定されたゲイン。 </li><li>緑色蛍光タンパク質（GFP） - ゲインは500 ms、140に設定。 </li><li>当社の顕微鏡は、調光可能なランプではなく、細胞に利用できる光の量を制御するための回転ディスクを持っています。我々は、ランプの最大強度の90％の光を私たちの実験を実行する。 </li></ol> 7。アポトーシス誘導因子とNucView 488カスパーゼ3基質と細胞の治療<ol><li>濃度は、実験間の一貫になるように、前もって時間のアポトーシス誘導剤の大規模な在庫を準備し、アリコートでそれらを凍結することが重要です。 </li><li> NucView 488基板は、光に敏感です。アルミ箔で覆われ、-20℃で凍結/解凍、およびストアチューブを減らすために15μLのアリコートを準備します。 NucVの露出を減らすために可能な限り低い周囲の部屋の照明で働くiew 488基板は、その使用前に、点灯する。 </li><li>細胞が温度の減少にさらされないようにすぐにインキュベーターから培養チャンバーを取得します。顕微鏡の環境室に培養チャンバーを配置し、移動から培養チャンバーを維持するためにクランプを使用してください。この時点で、部屋の照明を落とすこともすべき。 </li><li>デュアルレギュレータ、5％混合CO 2タンクをオンにします。 </li><li> 10倍対物レンズを用いて、明視野顕微鏡を使用してコンピュータのモニタ上で細胞を見つけるために焦点を当てる。 メモ ：露光時間を減らすために所望の倍率で客観的で最大の開口数を使用するとよいでしょう。 </li><li>細胞（私たちのケース80mMのカリウム、または100 mMのグルタミン酸で）にアポトーシスの誘導を実現する、次のいずれかの方法を使用することができます。私たちは、典型的な培養培地で10倍濃縮液として溶存KClを用いて、例として、80mMのカリウムの配信を使用します。 <ol><li> メディア交換BYが遅いとローカル潅流： - 80 mMリン酸カリウムを含む新しい培地で培養チャンバーにメディアを交換する蠕動ポンプを使用してください。 - チューブの一端には、フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの株式を10 mLをお届けします、、チューブのもう一方の端は、チャンバーからメディアを削除します。 - あなたは、チャンバー内に残っているメディアは、カリウムの正しい濃度を持っていることを保証するためにメディアの少なくとも10倍の交換をしたい。 -メディアが交換された後、チャンバー内のメディアにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。 </li><li> 80mMのK +および培養チャンバー内のメディアへNucView 488基板の直接添加する 。 - フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの10倍のストック溶液を調製する。 - 10倍の80mMのカリウムの50μLにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。培養チャンバーに500μLのフェノールを含まないDMEMに追加します。 注：この方法はあなたが成長または元のメディアに存在するかもしれない他の分泌因子を維持したり、評価する上で興味があれば望ましい。我々はNucView 488基板は限り36時間を持続させる実験のために細胞培養で安定していることを発見した</li></ol></li></ol> 8。ライブセルイメージング<ol><li>トランスフェクションされた細胞を表示するには、赤チャンネルをクリックしてください。 </li><li>選択して、いくつかのトランスフェクションされた細胞が存在するダースのフレームの周りに保存し、これらの&quot;XYステージのポイントを&quot;保存。コンピュータのメモリの量によっては、あなたが取得できるようになるステージのポイントの数に制限される場合があります。 </li><li>これらの保存された段階で、顕微鏡のキャプチャ画像（明視野、赤チャンネル、緑チャンネルに）持っていることは、すべての6分を指しています。 </li><li>実験の初期段階で表示されている緑色の染色は、おそらくすでに通常トランスフェクションおよび/または環境ストレスによるアポトーシスを、受けている細胞を示す。 Apopt実験的な治療に起因するOSISは実験の後のタイムポイントで検出されます。 </li></ol> 9。統計的分析<ol><li>各実験では、我々は効率的に大きなデータセットを収集するために複数のXYポイントを獲得するために顕微鏡をプログラムする。各実験は、重複または三重に実行され、データが異なる日に行わ別々の実験からコンパイルされます。各データセットから、我々は、ビューの15のフィールドまで分析して、カスパーゼ陽性細胞（ビュー/カスパーゼ陽性細胞の総数のフィールド内のセルの合計数）にカスパーゼ陰性細胞の比率を比較する。 </li><li>各データセットから記録された測定は、より大きなサンプルのセットにグループ化され、そして、1つANOVA表（P = 0.05）を使って他と比較されます。我々は、各実験の平均値（SEM）の標準誤差を示し、次にWHを決定するためにテューキーの方法の比較試験（P = 0.05）を実行することで、平均の差を比較するICHの治療法は、互いに大きく異なっている。 </li></ol> 10。代表的な結果我々はNucView 488基板は高い細胞外カリウム濃度と治療後のN19 - OLG細胞培養のアポトーシスの増加率を示すことができる方法を示すために実験を記載している。 N19 -細胞はRFPでトランスフェクトした、とのどちらか3μLNucView 488基板（コントロール）、または3μLNucView 488基板と80mMの[K +]（治療）で処理した。細胞は、モニターし、画像は神経傷害（ 図1A）を対象とした研究に適している12時間の時間経過、以上を取得した。コントロール条件では、80 mMのと比較してアポトーシスを大量に観察されなかった[K +] 12時間（ 図1B）の後に約45％の細胞死を示した処理培養物（ハッシュ化されたボックス）、。背景の緑色の信号が観察制御条件のdは、細胞外カリウムを添加することなくアポトーシスを受けている細胞を示す。他の状況での実験が長く実行するために必要なことかもしれないが、12時間の時点で対照実験の展示アポトーシスにおける細胞の事実上どれも、。画像は10倍対物レンズを用いて取得しました。バー= 100μmの。 <img alt="図1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="図1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> 図1。 （A）N19 OLGの文化の12時間のタイムコース実験を48時間トランスフェクション後NucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLと一緒にRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現する。培養物は、いずれの80mMの[K +]（左パネル）、またはコントロール（右パネル）などの無治療の最終濃度で処理した。画像は6分間隔で取得され、そして切断されたカスパーゼ-3（緑信号）の有意な活性化は観察することができますD 80 mmに処理した培養物の[K +]対照実験と比較して細胞核（ハッシュ化されたボックス）内で。によって、ビューのフィールド内のセルの合計数を割ることによって計算された、切断されたカスパーゼ-3の細胞（の（B）の割合カスパーゼ陽性細胞の合計数）。条件を制御するための比較では、我々はKで12時間で+ -治療後の約45％の細胞死を観察 Sビデオ（1）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野像と三方と一緒に、NucView 488基板の3μL（グリーンチャンネル）でRFP - MBP（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後マージされた画像、80mMのでは、次の治療[K +]。 Sビデオ（2）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野IMAGとともにNucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLとRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後、ESとスリーウェイマージされた画像。何の治療は、文化に適用されていないとN19 - OLGsは、80mMの[K +]（Sビデオ1と比較）で処理した細胞培養とは対照的に顕微鏡のフィールドを介しての移行を見ることができます。

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著者らは開示する利害の衝突を持ちません。

これはアポトーシスの検出に使用できる唯一の蛍光製品ではありませんが、NucView 488基板を使用するいくつかの重要な利点があります。主な利点のひとつは、大部分の代替製品はどちらの細胞溶解を必要とするか、悪い細胞の透過性を持っているのに対し、リアルタイムで生きた細胞のアポトーシスをフォローする機能です。他の利点は、カスパーゼ-3の認識、高い細胞透過性、低細胞毒性、およびアポトーシスの進行との干渉のための高感度が含まれています。それが切断されるとバックグラウンドの蛍光を除去する核を、入るまで、基板はまた、低バックグラウンドの蛍光を持っています。カスパーゼ-3認識配列は、3つの負電荷とDNA結合色素が含まれていますつの正電荷2を持っています。 DEVD - NucView 488分子は、このようにカスパーゼがアクティブでない細胞のDNAに色素の活性化との結合を防止する正味の負電荷を持っています。 MA実験間のintaining一貫性が複製の間に意味のある比較を描画できるようにするためです。それがトランスフェクションの速度に影響を与えるとしての一貫性を保つために主なパラメータの一つは、細胞密度です。不死N19 - OLG細胞培養で高いトランスフェクション率を得ることが我々の経験12、13に、このようなHeLa細胞またはHEK293など、他の一般的な細胞株と比べてより困難である、と密度に大きく依存している。これらの細胞のための私達の最高のトランスフェクション効率は、トランスフェHD（ロシュ）で取得し、通常は約15％ですが、構造に応じて、30％以上に到達することができますされています。慎重な細胞計数は、一貫性のあるトランスフェクション率を得ることに役立ちます。アポトーシスのレートを測定する場合は特に、さまざまな治療法から環境ストレスの同程度に細胞を公開することも重要です。特に、細胞をトランスフェクション試薬にさらされている時間の長さ、または光暴露量は、重要な環境変数です。ablesは考慮して、実験に渡って一定に保持する必要があります。私たちのアプリケーションの場合、我々はフィールドオブビューの多数を収集する統計的に有意な比較を行うために十分に大きなサンプルサイズを提供することを発見した[ 同上 ]。

特定の試薬と機器の表<table border="1"><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>生細胞用NucView 488カスパーゼ-3アッセイキット</td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td>トランスフェHDトランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地</td><td> GIBCO </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン</td><td> GIBCO </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> GIBCO </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> ＃1.5〜25ミリメートルのガラスカバースリップ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0715 </td></tr><tr><td>磁気Chamlide CMB さ25mm培養チャンバーカバースリップ</td&gt; <td>クォーラムテクノロジーズ</td><td> CM - B - 40 </td></tr><tr><td> Cellstart組織培養10cmの皿</td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BDファルコン6ウェル組織培養皿</td><td> VWR </td><td> CA62406 - 161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

中枢神経系は、最終的にニューロンの人口や機能の低下につながる数多くの副作用を持つことがストレスと神経学的侮辱の数を、体験することができます。損傷した軸索は、順番に、アストロサイトやオリゴデンドロサイト、8,16などのサポートグリア細胞への更なる侮辱と怪我を作り出すことができる細胞外マトリックス、にカリウムやグルタミン酸を含む興奮性分子を解放することができます。侮辱が続く場合は、細胞が十分に確立されたシグナル伝達カスケード14の数によって調節し、活性化されるプログラム細胞死（アポトーシス）を、受けることになる。アポトーシスと組織の壊死は、外傷性脳損傷、脳虚血、および発作の後に発生する可能性があります。アポトーシス調節の古典的な例としては、システインに依存するアスパラギン酸特異的プロテアーゼ、またはカスパーゼの家族です。カスパーゼを含む活性化プロテアーゼは、慢性的な神経に応答して細胞死に関与しているアルツハイマー病、ハンチントン病、および多発性硬化症4、14、3、11、7を含む変性疾患。 このプロトコルでは、このような高濃度のような別の細胞外ストレスへの暴露後に、不死化N19 -オリゴデンドロサイト（OLG）細胞培養15、5におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの割合を測定するためにNucView 488カスパーゼ3基質の使用を記載しカリウムやグルタミン酸。条件付きで不死化N19 - OLGの細胞株は、（O2Aの前駆細胞を表す）博士はアンソニーCampagnoni（神経科学のためのUCLAセメル研究所）15、5から得られた、と以前にミエリンの遺伝子発現とつながるシグナル伝達の分子メカニズムを研究するために使用されていますOLG分化（例えば、6、10）。我々は、外因性のミエリン塩基性タンパク質（MBP）とトランスフェクションを基準にして堅牢なものになるようにこの細胞株を発見したRFPまたはGFP（赤色または緑色蛍光タンパク質）13、のどちらかに融合構築12。ここで、N19 - OLG細胞培養は、80 mMの塩化カリウムまたは9アポトーシス誘導する細胞外マトリックスへの軸索漏れを模倣する100mMのグルタミン酸ナトリウムのいずれかで処理した。我々は、DEVD（ASP -グルタミン酸- VAL - ASP）カスパーゼ-3認識サブユニットとDNA結合色素2を含む二官能性カスパーゼ-3基質を使用。基板は、すぐにそれが細胞内のカスパーゼ3により切断される細胞質に入ります。染料、NucView 488が解放され、それがアポトーシスをシグナル伝達、488nmでDNAと蛍光グリーンを結合する細胞核に入る。 NucView 488カスパーゼ3基質を使用すると、リアルタイムの1、10の生細胞イメージングを可能にする。このビデオでは、我々はまた、不死化N19 - OLGの細胞だけでなく、ライブセルイメージング技術の培養とトランスフェクションについて説明します。

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

使用して不死化N19 -オリゴデンドロサイトの培養細胞におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの生細胞イメージング<em&gt; NucView</em&gt; 488カスパーゼ3基質。この手法は、細胞の種類や組織の様々なリアルタイムでのプログラム細胞死のアッセイに適用可能です。

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K ビュー.  University of Guelph. 使用して不死化N19 -オリゴデンドロサイトの培養細胞におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの生細胞イメージング NucView 488カスパーゼ3基質。この手法は、細胞の種類や組織の様々なリアルタイムでのプログラム細胞死のアッセイに適用可能です。

ビデオ: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

神経科学

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

神経活動と Spm と頭蓋内脳波データを使用した接続の分析

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

STED顕微鏡によるニューロンのミトコンドリア超微細構造の解明

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

著者スポットライト:ミトコンドリア老化の解読 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...