この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。

1。全血から赤血球を分離<ol><li> EAS - 45溶液を調製。 表Iからすべての成分を秤量し、純水の100〜200ミリリットルに溶解する。千ミリリットルソリューションを作成し、pHを8.0に調整するために水を加えます。 50ミリリットルでフィルタと注し。ストレージ用に-20℃で凍結する。 </li></ol>注：ステップ1.2は、プロトコルを承認された治験審査委員会で、このような看護師として訓練を受けた医療専門家が行ってください。 <ol start="2"><li> EDTAを含有する10mlのチューブに肘正中皮静脈からの血液の3〜5ミリリットルを描き、優しく直ちにEDTAと血液を混合し、完全に凝固しないように。 </li><li>プロセスの血液サンプルをできるだけ早く。遠心分離以外のすべての次の手順は、準備が無菌に保つためにフードの下で行われる必要があります。 、50ミリリットル遠心管に血液を移す5分@ 1000rpm、4℃で寒さと無菌1077 Histopaqueと遠心10mlのを追加します。二回繰り返します。 </li><li> 10を加算mlの冷と滅菌PBS、5分@ 1000rpmのための遠心、4℃上清を取り除く。 4回（5回の合計）を繰り返します。 </li><li>二回滅菌EAS - 45（5分@ 1000rpm、4℃）で洗浄する。最後の洗浄の移動の赤血球中に新しい滅菌15ミリリットルチューブに。 </li><li>再懸濁し、赤血球in10ml EAS - 45。 </li></ol> 2。赤血球のビオチン化<ol><li>ステップ1からの赤血球とチューブを取る。 5分@ 1000rpm、4℃で遠心分離後上清を取り除くいくつかのバイアルの各々に赤血球ペレット10μlを入れ、（6種類の赤血球のビオチン濃度の調製例については、 表IIを参照）各バイアルにPBSの対応する量を加える。 </li><li> 表IIによれば、新鮮なBiotin-X-NHS/DMF 1:10、1:100希釈を行う。 </li><li>各バイアルに0.1Mホウ酸緩衝液10μlを追加します。 </li><li>すぐに計算された各バイアルにビオチン溶液の量（例として表IIを参照）、ボルテックスを追加。 </li><li>各赤血球のバイアルを配置50ミリリットルコニカルチューブと室温で30分間ローテーターでインキュベート内側。 </li><li> 2分@ 2000rpm用EAS - 45の800μlに各バイアルを3回洗浄。 </li><li> 4の各バイアルと店舗℃にEAS - 45の100μLを加える最終的なソリューションの各1μlのに今赤血球の〜1mlnでなければなりません。 </li></ol> 3。赤血球にビオチン架橋配位子の*を官能<ol><li>製造元の指示に従って、2mg/mlストレプトアビジン溶液を調製します。 Aliqouted溶液を-20℃で保存することができます</li><li>すぐにストレプトアビジン溶液を、ボルテックスでステップ2.7（10μL）から赤血球の同量を混合し、4℃で30分間ローテーターでインキュベート℃に</li><li> 2分@ 2000rpm用EAS - 45の500μLで3回洗浄する。 15μlEAS - 45ストレージ用/ 1％BSAを追加。 </li><li>すぐに20μg/mlリガンド溶液、渦とステップ3.3（10μL）から赤血球の同量を混合し、室温で30分間ローテーターでインキュベートする。 </li><li>の500μLで2回洗浄するEAS -2分@ 2000rpmは45 / 1％BSA。ストレージ用EAS - 45 / 1％BSAの15μlを追加。 </li></ol>目的タンパク質は、タンパク質のビオチン化のための市販のキットのいずれか（例えば、サーモサイエンティフィック＃21955 EZ -リンクマイクロNHS - PEG4 -ビオチン標識キット）を使用するか示すように中間ステップとして、ビオチン化捕捉抗体を使用できる、ビオチンのリンクがない場合*ビデオインチ 4。受容体とリガンド密度の定量化<ol><li>それぞれのモノクローナル抗体の飽和濃度の異なるバイアル、受容体を有する細胞において、室温で30分間、ステップ3からリガンドでコーティングされた赤血球をインキュベートし。制御とは無関係アイソタイプ適合抗体で別々のバイアルの細胞でインキュベートする。一次抗体が蛍光標識されていない場合は、製造元の指示に従って蛍光標識二次抗体でインキュベートする。 </li><li>対応する蛍光CALとフローcytometeryでステップ4.1で調製したサンプルを分析するibrationビーズ。図に示すように密度を計算する。 1。 </li></ol> 5。マイクロピペットおよびセルチャンバーのための準備<ol><li> PN - 30ナリシゲ&quot;磁気ガラス管微小電極水平プラーまたはサターインスツルメンツマイクロピペットプラーを使用して、キャピラリーチューブからマイクロピペットを引き出します。 </li><li>希望のサイズ（通常は1 -5μm以下から必要な直径の範囲の研究で使用するセルのサイズに依存）に引っ張らマイクロピペットの先端を調整するマイクロフォージでマニピュレータを使用してください。 </li><li>希望のサイズに顕微鏡のカバーガラスを切断することにより、セルチャンバーを準備。実験中に浸透圧を変更するには培地の蒸発を防ぐために両側からミネラルオイルを使用してチャンバーを密閉する。 </li><li>チャンバーへの受容体とリガンド有利子細胞を追加。 </li></ol> 6。マイクロピペットの接着周波数分析<ol><li>それぞれのピペットで相互作用する細胞を吸引し、コンピュータにプログラムさpiezoelectrを使用してください<html> ICのトランスレータは、制御された接触面積と時間で他の細胞と接触してアウトのRBCを駆動する。細胞の分離時にRBCの伸長を観察することによって、接着事象を検出する。 </li><li>所定の接触時間、接触収縮のサイクルを50〜100倍を繰り返します。 Excelスプレッドシートの列のない接着用接着または&quot;0&quot;のために&quot;1&quot;を追加して観測された付着のイベントを記録します。あなたは、顕微鏡画像については、例えば、デジタルメディアやビデオテープを記録装置を使用することができます。 </li><li>接着周波数に対する平均値とSEMを取得するには、各接触時間のために少なくとも3つの異なるセルのペアを使用して接触時間曲線を記録します。 </li><li>無関係のリガンド（例えばBSA）および/またはそれらの特定の機能的な封鎖のモノクローナル抗体を用いてリガンドまたは受容体を遮断することでコーティングされた赤血球を使用して、コントロールのための非特異的結合曲線を記録します。各接触時間の時点で特定の接着周波数は非特異的な接着周波数1を除去することによって計算することができます。 </li></ol>ove_title&quot;&gt; 7。データ解析<ol><li>特定の接着周波数を合わせるP前方に二階と一階受容体の単一種と配位子1の単一種の間に逆、シングルステップの対話を記述する確率モデル（式1）により、対の接触時間 t のデータ： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> 2D効果的な結合親和性であるここで、K、kは オフオフレートである、M RとM Lは、手順4で測定されたそれぞれの受容体とリガンド密度、c は接触面積である。カーブフィットは、CとKの2つのパラメータ、C K AとK から 、ひとまとめにし、効果的な2Dの親和性と総称と呼ばれるている。オフレートとその製品は、効果的な2次元上のレートです。 </eM&gt; C K 上 = A C K x kでオフ 。 特定の接着周波数Pの合計を測定接着（P 測定 ）1,21をから非特異的接着の割合（P 非特異的 ）の減算によって計算される。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> 好中球上のインテグリンαLβ2サイトの密度の1決定図 。好中球は、最初に図3,4にまたはE -セレクチン- Igをせずに使用される実験条件に一致する10分のためのE -セレクチン- Igの1μg/mlのとインキュベートし、その後、PE標識抗の飽和濃度（10μg/ml）とされたヒトCD11aモノクローナル抗体（クローンHI111、 特定の表を参照してください試薬と装置）や制御のための無関係のマウスIgG1は、洗浄し、直ちに分析した。サンプルは標準QuantiBRITE PEのキャリブレーションビーズのBD LSRのフローサイトメーターで読み取った。パネルは、E -セレクチン- Igの処理（青色）または未処理の細胞（緑色）のものと一緒にキャリブレーションビーズの蛍光ヒストグラム（ピンク）を示します。特定のCD11aモノクローナル抗体の染色が実線で示されており、無関係なアイソタイプ適合コントロール抗体の染色は点線の曲線で示さ​​れています。未処理の細胞との比較から見て、E -セレクチン- Igは（すべての洗浄ステップでとFACS緩衝液中の存在）で処理した細胞はCD11aの密度に影響を与えなかった。パネルBは、密度の定量化のプロセスを示しています。 LOG10は、パネル（ピンクの円）とビーズあたりのロット別のPE分子（メーカーから）のための4つのキャリブレーションビーズのヒストグラムの各ピーク値の平均蛍光強度（FI）を算出した。 LOG10 fluorescに対するビーズ当たりLOG10 PE分子の線形回帰リファレンスはプロットした。 respectivly、E -セレクチン処理した細胞に対して特異的mAbおよびコントロール抗体のための3.99（青実線丸）と2.23（青白丸）に等しいLOG10 FI（y）の値。我々はPEとしては、x（値はパネルBの緑と青の円としてプロットされている）X = LOG10 PE /セルの線形方程式を解くと：モノクローナル抗体の比は1:1であった、好中球上のαLβ2の合計数があった9587として算出。面密度は、好中球の直径22として8.4μmを使用して、43分子/μm2であると計算された。 ICAM - 1の密度も同様に65モル/μm2のに匹敵PE -抗ヒトCD54モノクローナル抗体を、使用してフローのcytometeryによって測定した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> 図2 マイクロピペットのシステムの回路図 。私たちのマイクロピペットシステムは、家の中で組み立てられ、3つのサブシステムで構成されて：イメージングサブシステムを一つ、RECを観察できるようにするORDとマイクロピペット - 吸引された細胞の動きを分析し、一つのマイクロピペットに細胞を吸引できるように、セルチャンバーから細胞を選択するときは、1つ、および圧力のサブシステムを有効にするためにマイクロマニピュレーションのサブシステムを。イメージングシステムの中心部分は、100倍の油浸1.25 NAの目的で顕微鏡（オリンパスIMT - 2 IMT2を）反転されます。画像は、電荷結合デバイス（CCD）カメラを介してビデオカセットレコーダーに送信されます。ビデオのタイマーは時間を追跡するシステムに結合されている。各マイクロピペットを顕微鏡に装着され、細かく三軸油圧マイクロマニピュレーターと位置付け、機械的駆動によって操作することができます。ニューポートからの機械的なマニピュレータも使用可能です。マイクロピペットホルダーの一つは、圧電変換器にマウントされている、のドライバは、ピエゾアクチュエータに電圧​​アンプ（自家製）を介してDAQボードを介してコンピュータLabVIEWコード（リクエストを承ります）と信号の変換によって制御されます。このllows接着試験サイクルで正確にかつ繰り返ピペットを移動一つ。圧力調整のサブシステムは、実験中に吸引を制御するために使用されます。油圧ラインが流体リザーバへのマイクロピペットホルダーを接続します。微細な機械的な位置決めは、貯水池の高さを正確に操作することができます。 マイクロピペットはKIMAXの融点のホウケイ酸ガラス毛細管（1.0の外径± 0.07 mmと0.7の内径± 0.07 mmを使用して生成されます。まず、キャピラリーチューブからマイクロピペットをナリシゲ&quot;磁気ガラス管微小電極水平プラーPN - 30を使用して引っ張られている（サッターインスツルメンツマイクロピペットプラーは、別の引き手のオプションです）。第二に、マイクロフォージシステムは、（家の中で構築された）目的のサイズの開口部にマイクロピペットをカットするために使用されます。マイクロフォージシステムの商用モデルもご用意しています。 実験、microsc中にマイクロピペットの振動を避けるためにOPE、マニピュレーターと共に、エアサスペンションのテーブルの上に置かれている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> ICAM - 1（）またはhIgG（Bでコーティングされた赤血球の間で繰り返される接着試験サイクルから測定された（）と非特異的な（B）1S（赤）と10秒（青）で結合接触時間のための接着の周波数 f i を実行して図3 ）ヒト好中球はインテグリンαLβ2を表す。F I =（X 1 + X 2 + ... + X iを持つ）/ I（1≤i≤nの）、 私は、テストサイクルのインデックスです、X iは &quot;1&quot;となります（付着）または&quot;0&quot;（無接着）。F n回 （n = 50）が付着確率のための最良の推定値として使用されました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> 4カイネティクスを図好中球のインテグリンαLβ2（にICAM - 1結合<img alt="スクエア" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ）。各接触時に3つの細胞ペアのために、図3に示すように測定された付着確率を平均し、接触時間に対してプロットされる。チャンバーの培地は、αのLのβ2の結合をアップレギュレートするために1mMのCa 2 +の各+およびMg 2 +二量体のE -セレクチン- Igのプラス1μg/mlのとHBSSいました。 、赤血球にICAM - 1 - Igを捕捉するための中間ステップは、ストレプトアビジンのインキュベーションステップの後に10μg/ml捕捉抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトFc抗体、eBioscience社）で赤血球をインキュベートするために追加されました。非特異的結合2つの異なる条件を制御するために使用されていました：1）赤血球は、抗ヒトFcを捕捉抗体を塗布し、ヒトIgGの代わりにICAM - 1 - Igは（O）と2でインキュベート）でコーティングされていない赤血球への結合好中球（Δ）抗体を捕捉。 10μg/mlヒトIgGは、Eの結合を最小限に抑えるために培地に添加した赤血球表面上に捕捉抗体の溶液中で-セレクチン- Igは。ヒトIgGの制御曲線として記録された非特異的結合は、特定の付着確率曲線を（得るために使用された<img alt="スクエア" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ）を算出する。 2。式とのフィッティング特定の付着確率の曲線。 1（実線）は、効果的な結合親和性は 、K = 1.4•10 -4μm4 と k オフ = 0.3秒-1を返しました。 <table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th> MW（g /モル） </th><th>濃度（mM）を</th><th>量（g） </th></tr><tr><td>アデニン</td><td> 135.13 </td><td> 2 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> D -グルコース（ブドウ糖） </td><td> 180.16 </td><td> 110 </td><td> 19.82 </td></tr><tr><td> D -マンニトール</td><td> 182.17 </td><td> 55 </td><td> 10.02 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td> 58.44 </td><td>50 </td><td> 2.92 </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム HPO ） </td><td> 141.95 </td><td> 20 </td><td> 2.84 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 146.15 </td><td> 10 </td><td> 1.46 </td></tr></tbody></table> 表1。EAS - 45バッファー調製（1L）。 <table border="1"><tbody><tr><td> DMF 550μlの25 mgのビオチン- XHS </td><td> 0.1Mビオチン溶液</td></tr><tr><td> 0.1ビオチンのw / DMFの10倍希釈</td><td> 0.01Mビオチン溶液</td></tr><tr><td> 0.1ビオチンのw / DMFの1:100希釈</td><td> 0.001Mビオチン溶液</td></tr></tbody></table> 表2。ビオチン溶液の調製。 <table border="1"><tbody><tr><th> ビオチンの最終濃度（μM） </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td>赤血球ペレット株式（μL） </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1X PBS（μL） </td><td> 179.2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176.8 </td></tr><tr><td> 0.1Mホウ酸緩衝液（液） </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.01Mビオチン溶液（μL） </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0.001Mビオチン溶液（μL） </td><td> 0.8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表3。赤血球のビオチン化。

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	<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette.">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li><li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+(CD16).">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG.">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li><li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+binding+to+multiple+ligands:+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2.">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li><li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics.">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li><li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin/carbohydrate+ligand+interactions.">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li><li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations.">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li><li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+interactions.">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li><li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+formation,+not+bond+kinetics,+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain.">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li><li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1:+divalent+ion+effects.">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li><li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1/ICAM-1+catch+bonds.">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li><li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region.">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li><li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane.">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li><li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1.">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li><li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 .</li><li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li><li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination.">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li><li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion.">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li><li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+leukocytes+in+capillaries:+role+of+cell+size+and+deformability.">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li><li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+(CD16a)+binding+to+IgG+ligands.">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li><li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces:+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods.">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li><li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin:+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis.">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li><li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells,+particles,+and+membrane+capsules.">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li><li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors.">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li><li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+modeling+of+rosette+formation.">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li><li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge.">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li><li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear.">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li><li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments.">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li><li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 - リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17 - 517Q </td><td>使用前に脱イオン水で1Xに希釈する</td></tr><tr><td>バキュテイナEDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 10771 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2786 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -グルコース（ブドウ糖） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -マンニトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6360 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7653 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム＆＃X2082; HPO₄） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S374 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5763 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>ビオチン- X - NHS </td><td>カルビオケム</td><td> 203188 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド（DMF） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 20673 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液（0.1M） </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 11455〜90 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21125 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0336 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> Quantibrite PEビーズ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 340495 </td><td>密度の定量化</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Immunocytometryシステム</td><td> BD LSR II </td><td>密度量子tification </td></tr><tr><td>毛細管 0.7〜1.0ミリメートル× 30&quot; </td><td>キンブルグラス株式会社</td><td> 46485から1 </td><td>引っ張りマイクロピペット</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2629 - 1 </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12から544 - G </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td> PEα-ヒトCD11a クローンHI 111 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12-0119-71 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td> PE抗ヒトCD54 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から0549 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>マウスIgG1アイソタイプコントロールPE </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から4714 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>油圧マイクロマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td> MO - 303 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>メカニカルマニピュレータ</td><td>ニューポート</td><td> 461 - XYZ - M、SM - 13、DM - 13 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>圧電変換器</td><td> Physik Instrumente </td><td> P - 840 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> LabVIEWの</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>バージョン8.6 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> DAQボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> USB - 6008 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>動力学システム</td><td> 5200シリーズ</td><td>マイクロピペットシステム</td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。 アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています- 19。 メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。 方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。 法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 - リガンド相互作用の研究が可能になります。 マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM - 1）の動態の測定を示す。

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 - リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K ビュー.  Georgia Institute of Technology. 両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 - リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

用アメロゲニン - キトサンハイドロゲルの開発<em&gt;体外</em高密度インターフェイス付き&gt;エナメル再成長

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

オレイン酸のトリペプチド安定ナノエマルション

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

神経のインプラントの軟化挙動を予測する環境の動的機械分析

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

生体膜力プローブ分光法による分子ばね定数解析

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

用接着周波数アッセイその場で速度論解析