この方法は、末梢器官へのホーミングに必要な免疫細胞の接着カスケードに関する基礎免疫生物学および炎症性腸疾患研究の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、フロー条件下での細胞接着のコンテキストで機能的な質問に答える便利でわかりやすいアプローチであるということです。この方法は炎症性腸疾患における細胞ポワチン抗インテグリン抗体のメカニズムを探索するために開発されたが、他の炎症性疾患の設定で同様の問題を分析するために変更することができる。
小さいはさみで片側にゴム製のチューブを伸ばし、管に約0.5センチメートルの長方形の毛細管を挿入できるようにすることから始めます。その後、パラフィンフィルムとの接続をシールします。目的のアドレス20マイクロリットルでキャピラリーをコーティングし、37°Cで少なくとも1時間インキュベーションのプラスチックパラフィンフィルムでチューブに接続されていない側を密封します。
インキュベーションの最後に、プラスチックパラフィンフィルムを取り出し、液体をキャピラリーからペーパータオルに浸してチューブを空にします。その後、37°Cで少なくとも1時間、20マイクロリットルのブロッキング溶液でキャピラリーをブロックします。コード化されたタンパク質の機能性を損なう可能性があるため、コーティングを取り除いた直後に毛細管にブロッキングを適用することが非常に重要です。
毛細血管がブロックされている間に、 50 ミリリットルチューブから抗凝固全人間の血液 18 ミリリットルを加え、PBS で合計 35 ミリリットルの血液を希釈します。血液溶液下の密度勾配培地の層10ミリリットルを、密度勾配遠心分離によって末梢血単核血球を単離する。分離の終わりに、末梢血単核細胞を密度勾配媒体の界面から新しい50ミリリットルチューブに移す。
そして、新鮮なPBSで50ミリリットルまでのチューブ内の総体積を持って来ます。遠心分離後、ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSでカウントし、メーカーの指示に従って適切な細胞追跡染料で細胞を染色します。染色インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、完全なRPMI培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に1.5倍10回でペレットを再懸濁する。
その後、条件がある48ウェルプレートの多くの井戸に細胞の1ミリリットルを播種します。そして、37°Cで1時間インキュベーションのために適切なウェルに抗インテグリン抗体の適切な量を追加します。次に、P1000ピペットを使用して細胞を数回再懸濁してから、細胞を個々の2ミリリットルチューブに移します。
PBSを1ミリリットルずつよくすすい、適切な2ミリリットルのチューブにスリーチをプールします。カウント後、ペレット細胞を遠心分離し、適切な量の接着バッファーで細胞をリサスペンし、ミリリットル懸濁液当たり10〜6番目の細胞を1.5倍得た。次に、適切な量の塩化マンガンを各チューブに1ミリモルの最終濃度に加えます。
細胞の準備ができたら、顕微鏡をオンにし、適切なフィルターとレーザー、目的および取得モードを選択します。毛細血管の先端からプラスチックパラフィンフィルムを取り出し、毛細血管を小さなチューブに接続できるように、はさみを使用して5センチメートルのゴムチューブを伸ばします。毛細管とチューブの間の接続をプラスチックパラフィンフィルムで密封します。
そして、固定トレイに毛細血管を取り付けます。毛細管が焦点を合わせるように、顕微鏡のトレイホルダーにトレイを置きます。そして、ゴムチューブを蠕動ポンプの対応するノッチに挿入します。
チューブの未接続の端部を、細胞懸濁液を含む最初のサンプルチューブに入れる。そして、毛細血管の反対側の短いチューブを15ミリリットルのチューブに挿入して、流れを収集します。細胞懸濁液がキャピラリーに近くなるまで、チューブを毎分500マイクロリットルの流量で満たします。
次に、1分間に100マイクロリットルの流量で毛細管を充填させます。毛細血管が細胞で満たされたら、流量を毎分10マイクロリットルに調整し、2秒ごとにアコティンコーティングされた壁の内側に沿って毛細血管をゆっくりと移動する細胞のタイムラプス画像を合計3分間キャプチャします。細胞懸濁液が毛細管の内側に達すると、静的インテグリンアカテイン相互作用が測定に偏る可能性を招く可能性を招くため、フローの中断を避けるのが重要です。
マイクロスコープの接眼部を通して毛細管全体を廃棄する前に、画面で観察されたセクションが代表的であることを確認する。ポンプからチューブを解放し、残りの流体を2ミリリットルチューブに戻します。次に、キャピラリーとチューブを固定トレイから取り外し、ちょうど実証したように次の毛細管を画像化します。
タイムラプスの記録を評価するには、適切な解析ソフトウェアの最初のシーケンスを開き、最初と最後の3つの画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。ImageJ で 3 つの開始イメージを開き、イメージ、タイプ、および 32 ビットを選択して、イメージを 32 ビットに変換します。次に、画像、カラー、およびマージチャネルを選択して画像を1つの画像にマージし、合成画像をRGBに変換してTIFFファイルとして保存します。
最後の 3 つの画像を同じ方法で変換した後、合成画像の先頭と末尾に表示される白いセルを数えます。終了画像の白いセルの数から、開始画像の白いセルの数を減算します。ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1でコーティングされた毛細血管の灌流は、人間のPBMCを有するイソタイプFcキメラではないが、3つのアカチンのいずれかが存在すると顕著な接着をもたらす。
対照的に、中和抗体を用いたインテグリン・アカテニン相互作用の阻害は、典型的には、アイソタイプ対照抗体が添加された場合に存在しない動的接着の著しい減少をもたらす。さらに、特定のケモカインを有するCD4ヒトT細胞の治療は、未治療のヒト細胞と比較してアカチンへの接着性の増加をもたらす。この手順を試みる間、このアッセイでは完全に再現できない生体内の動的細胞接着に様々な要因が寄与することを覚えておくことは非常に重要です。
しかし、非常に複雑な質問に対処するためにアッセイを調整することが可能です。試験細胞タイプの差付着挙動に関する追加の質問に対処するために、異なる細胞追跡色素で標識された異なる細胞タイプで競合接着アッセイを行うことも可能である。その開発後、この技術は、炎症性腸疾患の治療のために使用または現在開発中の異なる抗インテグリン抗体の効果を探求することを可能にしました。
