この方法は、どの受容体が細胞間接触の接着または認識を媒介するか、特定のリガンドがそれらの相互作用を引き起こすかどうかなど、細胞間相互作用分野の主要な質問を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞の固定または破壊を必要としない生細胞で直接そのような相互作用を調査することができるということです。この方法は、培養細胞間の相互作用を調べるのに使用されるが、それはまた、他のシステム単膜小胞または小さなモデル生物に適用することができる。
一般に、この方法の初心者は、細胞の動きと遅い信号変動を注意深く検査することによって、数分間にわたって取得できるほど安定していることを確認する必要があります。まず、トランスフェクションの前日に6ウェルプレートの少なくとも4つのウェルに適切な数の細胞を播種する。10%FBSおよび1%L-グルタミンを添加したDMEM培地中の37°C5%の二酸化炭素で細胞を培養する。
目的のタンパク質に対するトランスフェクトプラスミドの基本的な実験を行うために、緑色または黄色の蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質を別々のウェルに融合させた。4時間後、成長培地を取り除き、洗浄中の細胞の剥離を防ぐために、ウェルエッジにPBSを落とすマグネシウムとカルシウムを添加したPBSの1ミリリットルでそれぞれを穏やかに洗います。その後、PBSを削除します。
細胞の剥離を容易にするために各井戸に約50マイクロリットルのEDTA溶液を滴下する。摂氏37度で2分間インキュベートした後、ゆっくりと6ウェルプレートを横に振って細胞を取り外します。次に、各ウェルに950マイクロリットルの成長培地を加え、上下に数回ピペットして細胞を再中断し、すべての細胞をウェルボトムから取り外します。
再懸濁後に大きな細胞集合体が存在しないかどうかを視覚的に確認して、セルが適切に再懸濁され、互いに切り離されていることを確認します。1つのウェルのセル溶液を対応するウェルに移します。上下に数回ピペットを入れ、やさしく混ぜます。
その後、混合細胞を35ミリメートルのガラス底皿に種を入れ、播種した細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で1日培養します。レーザー走査型共焦点顕微鏡ソフトウェアで、光路を設定します。スペクトルクロストークを回避するには、mEGFP または mEYFP と mCherry または mCardinal を順番に励起して検出する 2 つの別々のトラックを選択し、すべてのラインをトラック切り替え を選択します。
検出には、両方のチャネルに適切なフィルタを使用します。混合細胞を含む皿をサンプルホルダーに置きます。温度の平衡を確保し、焦点ドリフトを減らすために10分待った後、位置指定メニューの透過光を使用して細胞に焦点を合わせます。
互いに接触している赤と緑のセルのペアを検索します。次に、[切り抜き] ボタンを使用して、セル間接触に垂直なスキャン パスを選択します。ズームして 50 ~ 200 ナノメートルのピクセル サイズを達成し、[スキャン モードでライン] を選択します。
フレームサイズを 128 x 1 ピクセルに設定します。スキャン速度を最大許容値に設定します。次に、サイクルを 100,000 から 500,000 に設定します。
この後、適切なレーザーパワーを選択します。検出器をフォトンカウントモードに設定します。[実験の開始] を押して、取得を開始します。
生データ ファイルを生データ形式で RGB TIF イメージにエクスポートします。このファイルには、画像のGとRというチャンネルに緑色と赤のチャンネルデータをそれぞれ含むキモグラフが含まれます。次に、適切な解析ソフトウェアを使用して TIF ファイルをインポートし、分析を実行します。
500 ~ 1000 行のブロックでセグメント単位の時間平均を実行して、ラインを整列します。各ブロックの膜位置を決定します。次に、すべてのブロックを同じ横位置にシフトします。
時間軸に沿ってすべての直線を合計し、ガウス関数を使用して平均強度プロファイルに適合します。膜位置のプラスマイナス2.5シグマ内のすべてのピクセルとして膜に対応するピクセルを定義し、各行のこれらのピクセルの強度を合計して各時点の蛍光シグナル値を取得します。写真の漂白が観察される場合は、二重指数関数を有する膜蛍光時系列を適合させ、適切な補正式を適用することにより、漂白補正を適用する。
適切な方程式に従って、自動相関関数と相互相関関数を計算します。分析の信頼性を向上させ、アーティファクトを回避するために、合計測定の10〜20等分のセグメントの計算を実行します。各セグメントの蛍光時系列と相関関数を検査し、明らかに歪んだセグメントを除去します。
最後に、歪みのないセグメントをすべて平均します。データを分析する際は、各セグメントの強度時系列と相関関数を慎重に検査して、膜周辺の細胞内小胞による歪みを避けます。ミリストル化パルミトレート-mEYFPまたはmCardinalを発現するHEK 293T細胞の強度画像をここに示す。
ゼロに近い相対相互相関が観察され、自己相関関数は、血漿膜中のミリストリ化パルミトレートmEYFPおよびmCardinalの拡散に対して10〜20ミリ秒の特徴的な減衰時間を示す。膜固定ヘテロダイマーを発現するHEK293T細胞のsFCCS測定の相互相関関数は、有糸球体-mCardinal-mEYFPは正の振幅を有し、自己相関関数と同様の減衰時間を示した。APLP1-mEYFPとAPLP1-mCardinal発現細胞の間の細胞間接触に対するsFCCS測定は、0.45の正の相対相互相関をもたらした。
細胞と細胞の接触でのAPLP1クラスタ全体の測定値から得られたsFCCS相関関数は、大きなラグタイムにおける振動の大きな減衰時間から明らかなように、ダイナミクスを大幅に減少させた。亜鉛イオン添加の際、相対相互相関は平均値0.8に増加した。さらに、分子の明るさは、小さなオリゴマーから各細胞上の10〜50個のモノマーからなるより大きなマルチマーに有意に増加した。
一時的な不安定性は負の値を持つ相互相関関数、または高い偽陽性の相互相関をもたらす可能性があります。対応する相関関数は、通常、大部分のセグメントの相関関数とは大きく異なります。sFCCS相互相関数と明るさを補完するアプローチとして、タンパク質とタンパク質の相互作用を検出するために使用することができます。
この手順を試みる間、トランスフェクトされた細胞の混合は重要なステップであることを覚えておくことが重要です。細胞を穏やかに混合し、トランスフェクション効率を最適化して、接触する赤と緑の細胞を見つける機会を増やします。その開発後、この技術は、免疫学的シナプスにおけるシグナル伝達分子の相互作用を探求するために免疫学の分野の研究者によって使用されています。
