このプロトコルは、空間的にマッピングし、分子レベルでのローリング接着を定量化する以外に、分子力と細胞転動挙動の間の接続を確立するのに役立ちます。この技術は、実際の細胞転動中の個々の接着事象を研究し、生理学的関連分子接着力を直接測定することを可能にする。各工程で適切な濃度とインキュベーション時間を使用した表面調製は、高品質の表面機能化を実現するために重要です。
バイオコンジュゲーションの品質と適切な条件も重要です。視覚的なデモンストレーションは、研究者がこのプロトコルを複製するのを助けるために重要です。特に、フローチャンバアセンブリや後処理画像などのステップは、視覚的なデモンストレーションから大きなメリットを得られます。
カミソリの刃で両面テープの両側に少量のエポキシを薄く広めることから始めます。レーザーを使用して、エポキシコーティングされたテープをカットして4つのチャンネルを作成します。4ホールスライドとPEGカバースリップの間にエポキシテープを挟んでフローチップを作成します。
ピペットチップを使用して、チャネルの長さに沿って穏やかな圧力をかけて良好なシールを作成し、エポキシを最低1時間硬化させます。各チャンネルの開口部がアダプタの中心に配置されるようにチップを位置合わせします。その後、チップの上に2つの透明なアクリルスペーサーを置きます。
ブロックの中央にしっかりした圧力をかけ、各スペーサーの端にねじを付けます。入口をブラケットの反対側のネジ穴にねじ込み、透明なアクリルブロックを通してシール状態を監視します。200マイクロリットルの洗浄バッファーをチャンバに流し、漏れを確認します。
気泡がチャネルに形成される場合は、積極的に気泡を除去するために、洗浄バッファーの追加の200マイクロリットルを押します。非特異的結合を防止し、湿度室で10分間インキュベートするために、40マイクロリットルのBSAをフローチャンバーに加えます。インキュベーション後、フローチャンバーにTween 20で40マイクロリットルを加え、再び10分間インキュベートして非特異的結合をさらに低減する。
次に、200マイクロリットルの洗浄バッファーでチャネルを洗浄し、すべてのパッシベーション剤を除去します。チャンバー表面機能化のために、ストレプトアビジンを40マイクロリットルの流れチャンバに加え、20分間インキュベートしてから、200マイクロリットルの洗浄バッファーでチャンバーを洗浄します。次に、40マイクロリットルのハイブリダイズプロテインG-TGTをフローチャンバーに加え、20分間インキュベートします。
洗浄バッファーで洗浄した後、40マイクロリットルのプロテインG-TGTトップストランドを加え、20分間インキュベートして、表面上の任意の未ハイブリッド化TGT底鎖を完了し、洗浄バッファーで洗浄します。最後に、40マイクロリットルのP-セレクチン-Fcをフローチャンバーに加え、洗浄バッファーで洗浄する前に60分間インキュベートします。5ミリリットルのガラス注射器にローリングバッファーを充填し、シリンジの側面をタップして取り外し、先端に向かって浮かぶように気泡を押し出します。
ポリエチレンチューブの200ミリメートル部分に滅菌針を挿入した後、ガラス注射器に針を接続します。シリンジをシリンジポンプに固定し、気泡がチャネルに入るのを防ぐためにプランジャー側が上昇するようにシリンジポンプを傾けます。チューブの端部を流れチャンバの入口に挿入します。
ポリエチレンチューブの別の200ミリメートル片の一方の端を出口に挿入し、もう一方の端を廃棄物ビーカーに浸します。細胞懸濁液サンプルと遠心分離機の1~2ミリリットルを細胞にペレットに取る。培地を取り出し、500マイクロリットルのローリングバッファーで細胞を静かに再懸濁します。
慎重に流入口とフローチャンバーに細胞懸濁液の出口とピペット40マイクロリットルからチューブを切断します。前述のとおりにチューブを再接続し、フロー チャネルに気泡が入らないようにします。所望の流速でシリンジポンプを開始して細胞の転がり実験を開始します。
10Xの目的を持つ暗視野顕微鏡を使用して細胞の転がりを観察する。実験が完了したら、表面が細胞フリーになるまで1時間あたり100ミリリットルでローリングバッファーを注入することによってチャネルから細胞を取り除きます。DNA-PAINTによるローカルトラックのイメージング用に、DNA-PAINTバッファで作製した40マイクロリットルのDNA-PAINTイメージャー鎖をチャネルに加えます。
本文原稿に記載された条件を用いて、全内部反射蛍光顕微鏡を行う。スーパー解像度イメージをローカライズしてレンダリングします。永久的なラベル付けによって長いトラックを撮像するために、永久的なイメージャーの鎖を加え、T50M5の緩衝装置の120秒のインキュベート。
次に、200マイクロリットルの洗浄バッファーを注入してチャネルを洗浄します。励起レーザーをオフにして画像を記録し、カメラの背景ノイズを取得します。TIRF顕微鏡法によるグリッドパターンの大きな領域を画像化します。
400 x 50画像の領域をスキャンし、ImageJプログラムを使用して最大10,000枚の画像を含む個々のTIPファイルに生データを分割するように顕微鏡をプログラムします。照明プロファイルを使用してすべての画像を平坦化し、画像をステッチするMISTプラグインを使用します。タンパク質G ssDNAバイオコンジュゲーション特性の結果は、タンパク質GのssDNAおよびイミダゾール溶出緩衝液スペクトルが生体共役生成物スペクトルに適合するためのssDNAに対するタンパク質Gの1つの比率にほぼ1つであることを示した。
ネイティブPAGEは、単量体タンパク質Gバンドと一致する明るい緑色のバンドを示すバイオコンジュゲーションを確認するために使用され、良好な収率を示した。シングルモードファイバから導入されたTIRF照明プロファイルは、一般的に視野の中央で明るく、エッジの周りに暗くなります。不均一な照明を補正し、定量的な分析のために画像を平らにするために、照明プロファイルは、個々のフレームの数千を平均することによって決定しました。
平坦化された画像は、生プロファイルと照明プロファイルの両方からカメラノイズを引き出し、照明プロファイルによって正規化することによって生成されました。生のステッチは、未修正の画像に対応する明確な周期パターンを示し、平坦化された画像からステッチされた同じ視野は平らな背景を生み出した。ランプアップフロープロファイルを使用して、典型的な単細胞接着フットプリントを見ることができる細胞転がりおよび収量蛍光トラックをもたらすせん断応力の範囲を決定しました。
コントラストが不十分な蛍光トラックの最適で最適な結果、過度のトラック密度、最適なトラック密度とコントラスト、回折限定およびDNA-PAINTイメージングが示されています。60分以上のインキュベーション時間は、表面の機能化を確保し、適切なチャンバー構造は、機能化された表面を損傷する気泡の通過を防止します。この手順は、圧延接着に関与する分子力の定量的分析に適用され、研究者は異なる細胞タイプの圧延挙動を理解することができます。
この技術により、研究者は、単一分子およびメカノ生物学研究のさらなる進歩につながる高速接着事象に関する新たな疑問を探求することができます。
