この領域は、この培養物が形成した多能性および分化能の向上によるヒト多能性幹細胞の3D培養において興味深いと考えられる。我々は、ヒト多能性幹細胞スフェロイドの再現性のある形成をもたらす我々のカプセル化戦略を説明した。一旦封入されると、これらの幹細胞スフェロイドは、マルチウェルプレートまたは撹拌バイオリアクターのいずれかで、培養に適している。
私たちのカプセル化戦略は、スフェロイド形成の疫病の生存性と高効率を最適化することです。カプセル化されたスフェロイドは、攪拌または揺動に関連するせん断または機械的エネルギーから保護される。細胞療法から誘導された幹細胞の開発は、スケーラブルで効率的かつ費用対効果の高い方法で所望の細胞産物を生成する能力に部分的に依存する。
ここで説明するカプセル化技術は、この方向への一歩を表しています。ここで説明するカプセル化技術は、おそらく他の細胞から他の多能性幹細胞まで様々な細胞型の3D培養に適用できるだろう。まず、4.8グラムの35キロダルトンPEG、10.2ミリリットルの密度勾配媒体、および19.8ミリリットルのDMEM/F-12媒体を混合することによって、30ミリリットルの2倍のコアストック溶液を調製することから始めます。
次に、このコア溶液を0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してろ過します。次に、48.5ミリリットルの鉱物油と1.5ミリリットルの界面活性剤を混合することによって、50ミリリットルの鉱物油と3%の界面活性剤を調製する。次いで、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターに通すことによって溶液を滅菌する。
次に、テキスト原稿に記載されているように、1モルDTT、1モルTEA、および1%PF127溶液を調製する。次いで、4.5ミリリットルの鉱物油を3%の界面活性剤および300マイクロリットルの1モルDTTと混合することによって架橋剤エマルジョンを調製する。溶液を2分間ボルテックスした後、摂氏20度の超音波浴中で45〜60分間超音波処理し、27ゲージ針で5ミリリットルのシリンジにロードする。
次に、鉱物油に0.5%の界面活性剤を27ゲージ針を備えた5ミリリットルのシリンジに装填して遮蔽油溶液を調製する。シェル溶液を調製するために、400マイクロリットルのDPBSに32ミリグラムのPEG4マレイミドを加える。次いで、6マイクロリットルの1モルTEAを加える。
溶液を2分間渦巻きにし、スピンフィルターを通して遠心分離する。溶液をロッカーの暗闇に30分間保持してから、27ゲージの針で1ミリリットルのシリンジにロードします。最後に、2,000万hPSCを200マイクロリットルの媒体に再懸濁し、30マイクロリットルの1%PF127および200マイクロリットルの2倍コア溶液と混合することによって、最終的なコア溶液を調製する。
小さなスターラーバーを1ミリリットルのシリンジに挿入します。次に、コア溶液を含むセルを27ゲージの針でシリンジにロードします。まず、結合されたPDMS液滴装置、長さ20センチメートルの4本、長さ5センチメートルの入口マイクロチューブ1本、出口チューブ1本、および0.5センチメートルのフィッティングチューブ6個を殺菌光源の下に30分間置いて滅菌します。
次に、長さ20センチメートルの入口マイクロチューブ4本を、鉗子を使用してシェル、オイル、架橋剤エマルジョン、および解離装置入口に合わせます。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液とともにシリンジ針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスコア入口と解離デバイス出口とを5センチメートルのマイクロチューブで接続する。
1本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバに入れます。次に、デバイスを顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動きを避けます。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。
各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します。メーカーのプロトコルに従って各ポンプをテキスト原稿に記載されている流量にプログラムし、すべてのポンプでフローを開始します。各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。
カプセル形成が安定したら、収集チューブの反対側の端を、5ミリリットルのmTeSR媒体を含む新しい円錐形チューブに入れます。十分なカプセルが集められたら、それらを10分間インキュベートする。油相に存在するカプセルはチューブの上部にあり、チューブを軽く叩くと底に沈降します。
カプセルを取り出すには、まず回収チューブから油を取り除きます。次に、100マイクロメートルの孔径のセルストレーナーにカプセルを置き、大量の培地でストレーナーを洗浄します。6ウェル培養プレートのウェルの上にフィルターを反転させ、フィルターに2ミリリットルの培地を通すことによってマイクロカプセルを集める。
幹細胞カプセルを6ウェル培養皿に入れ、摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートする。1日おきに、カプセルをセルストレーナーフィルターで回収し、余分な培地で洗浄し、2ミリリットルの培地を含む6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁することによって、培地を交換します。2マイクロリットルの滅菌DPBSに4マイクロリットルの2マイクロモルのエチジウムホモダイマー−1および1マイクロリットルの4マイクロモルのカルセイン−AM溶液を加えることによって生存率アッセイを行う。
完全な混合を確実にするための渦。セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから媒体拡散できるようにします。エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAMを含む調製溶液1ミリリットルを用いて、それらを12ウェル培養プレートに再度収集し、摂氏37度で20分間インキュベートする。
蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルは、シェル中のPEG4−マレイミド含量の関数としてのカプセル形態に違いを示した。明るいエッジを有する滑らかなカプセルは、所望の機械的完全性に関連する。
カプセルの中央におけるビーズの凝集は、コアが水性であり、ビーズが自由に動き回っていたことを示している。蛍光環状はヒドロゲルシェルの存在を示し、シェルの厚さを決定するために使用した。H9細胞を封入してから6時間後の生染色または死染色は、細胞が封入実行中に日常的に95%以上の生存率を達成したことを示した。
カプセル化スフェロイドと非カプセル化スフェロイドの増殖速度および分化能を比較した。カプセル化のプロセスはhPSCに悪影響を及ぼさないことが決定された。コアシェルとオイルストリーム間の最適な流量比を確立することが重要です。
これを行わないと、カプセルが機械的に強くならず、取り扱い中に破裂する可能性があります。このカプセル化技術は、ヒト多能性幹細胞以外の細胞型に対するものであったことを指摘しておきたい。我々は、同様の戦略を用いて、主に仮説上の癌細胞株および間葉系幹細胞をカプセル化した。
現在、私たちのチームは次世代のマイクロキャプチャを開発しています。これらのマイクロキャプチャーは生理活性であり、幹細胞のカプセル化された分化のための交差因子を負荷してもよい。
