我々は有用な議論アルト研究室のメンバーに感謝。我々はまた、技術的な専門知識とアドバイスを博士クリス·ギルピン、トムJanuszewski、とローリーミューラー具体的には、UTの南西医療センターの分子細胞イメージング施設に感謝します。また、原稿の批判的な読みのために博士Xionanドンに感謝します。この作品は、NMAにNIHの助成金AI083359でサポートされています

1。哺乳動物細胞培養<ol><li>正常ラット腎（NRK）、不死化子宮頸癌（HeLa細胞）、または他の適切な哺乳動物細胞株を37℃で培養される℃、5％CO 2は 、セル料理を生きるために貼付フォトエッチングガラスグリッド化されたカバースリップ上で（任意の試薬 ​​については、 表1を参照するか、 DMEM中でこのプロトコルに使用される装置）+ 10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。哺乳類培養細胞を扱うときの注意事項は、無菌環境を維持するために取られるべきである。 </li><li>あなたの実験のタイムライン（0-5時間対 1から2日後に注射）に応じて細胞の密集度は約50％に調節したり、それぞれ、25％〜すべきである。 </li></ol> 2。マイクロインジェクション<ol><li> 〜50μlの最終体積に、細胞培養への従順さに応じて、バッファのあなたの選択で目的のタンパク質、DNA、または小分子を準備します。例えばテキサスレッドまたはカスケードブルーなどの不活性の蛍光色素マイクロインジェクション、細胞をマークするために含まれており、注射染料と蛍光プローブの選択は非重複励起および発光波長を持つ必要があります。マイクロインジェクションのために必要な目的の分子の濃度は、経験的に決定されるべきであり、蛍光トラッキング色素は、一般的に0.5から1.0 mg / mlで使用されています。典型的には、ローダミンまたは別の蛍光色素分子は共有結合の検出が、他の方法は感度に応じて使用することができ、市販のキットを使用して興味のある分子に結合されています。詳細については、下記の重要な考慮事項を参照してください。 </li><li> 0.22μmの遠心フィルターを通して注入物質（〜50μl）をフィルタリングします。遠心フィルターは、真空および/またはデッドボリュームが関連付けられているシリンジろ過よりも優先されます。 </li><li>マイクロインジェクションニードルを生成するには、ホウケイ酸ガラスピペットは、メーカーのガイドラインに従って、フレイミング·ブラウンマイクロピペットプラーを使用してプルアップされています。代わりに、マイクロインジェクション針はfemtotipマイクロインジェクション針を作るエッペンドルフ含むベンダーから購入することができます。 </li><li>慎重エッペンドルフ20 Femtotipsを使用してマイクロインジェクション針の悩まされていない端に注入物質の4μlをピペット。気泡が引っ張らマイクロインジェクションニードル内に存在しないことを確認します。倒立顕微鏡に取り付けられたエッペンドルフFemptoJet Injectmanのマイクロマニピュレータアームにマイクロインジェクションニードルをロードします。マイクロインジェクション手順の良いレビューのために、読者は可視化実験の資料8の以前のジャーナルに向けられている。 </li><li>倒立ツァイス顕微鏡の皿ホルダーにグリッド化カバーガラスおよび培養細胞を用いた生細胞の皿を置きます。フォトエッチンググリッド内で増殖している細胞を見つけて、グリッドの英数字識別子の点に注意してください、これは、以降のすべてのステップで使用されます。以降の手順では、カバーガラスの縁でサンプル移送を制限するように理想的には、カバースリップの中心に細胞を見つけます。 </li><li>手動で低くインジェクションカバースリップ上の所定の位置にアームと、先端が優しく培養細胞およびこのポイントを超えて針の動きを防ぐために、プレス &#39;Limitの表面に接触するまで、マイクロマニピュレータジョイスティックとコントロール、下注射針を下に使用して、したがって、脆いを壊すホウケイ酸ガラスを引っ張った。細胞のマイクロインジェクションの他のすべての側面を、エッペンドルフFemtoJet InjectManユーザーマニュアルに従って実行されます。マイクロインジェクション法は、最近細菌9から分泌される個々の病原性タンパク質を理解するために使用された。 </li><li>選択されたグリッド内の他のすべての細胞を顕微注入する。コンフルエント〜50％で成長した細胞では、1は600μm2グリッドあたり〜80セル（例では、 図3（a）に示すように）期待することができます。従って、蛍光および電子顕微鏡検査により、30から40〜実験と対照細胞のnがあるでしょう。 </li><li>目的のために哺乳動物細胞培養インキュベーターに戻し、生細胞皿を置き時間は、実験装置によって決まる。あるいは、一つは前固定に関心のある特定の細胞内構造の出現を待つためにマイクロインジェクションからタイムラプス顕微鏡分析に直接進むこともできます。 </li></ol> 3。蛍光顕微鏡法<ol><li>必要に応じて、マイクロインジェクション、細胞の生細胞タイムラプス蛍光測定を実行し、その後、0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）に2.5％グルタルアルデヒドでメディアを交換して、室温で10分間インキュベートする。生細胞の測定が必要とされない場合は、細胞増殖培地を廃棄し、10分間室温で1xPBSで5ミリリットル3.7％ホルムアルデヒドで細胞を固定します。固定液を捨て、5mlの1xPBSと交換して、3.2に進みます。注：それは蛍光顕微鏡が完了するまで、グルタルアルデヒドを追加しないように非常に重要です。 </li><li>蛍光顕微鏡でフォトエッチンググリッド化されたカバースリップで生細胞の皿を置き（共焦点は、THIは必要ありません■ステップ）とセルの配置（ 図4A）を文書化するために5月10日、明視野と適切なグリッドの蛍光画像を収集する。不活性の注入色素（ 図4B）の励起および発光波長を用いて顕微注入された細胞を同定する。これは、電子顕微鏡を含む後続のステップでマイクロインジェクション細胞の同定を容易にするために、異なる倍率（例えば10xと65X）で画像を得ることが重要である。 </li><li>共焦点蛍光顕微鏡を用いて、上記の手順2.5で識別されたグリッド内のマイクロインジェクション、細胞のZ-スタックを収集します。高倍率（100倍）は、電子顕微鏡で同定される細胞内構造と蛍光画像を相関させるために必要です。 </li><li>カバーガラスは、市販のカバースリップの除去液を用いて生細胞の皿の底から除去し、5 mlを含むバージン細胞培養皿に細胞側を上に配置されている1xPBS。以下に詳述するようにカバースリップを使い、電子顕微鏡用に処理されます。 </li></ol> 4。透過型電子顕微鏡<ol><li> 0.1Mのカコジル酸緩衝液（pH7.4）で2ミリリットル2.5％グルタルアルデヒドで1xPBSバッファーを交換し、10分間室温でインキュベートする。長いインキュベーションは、必要ありませんが、細胞内構造の維持に役立ちます。注意：単独でホルムアルデヒドは電磁界解析のための十分な固定ではありません。 </li><li>カコジル酸緩衝液で3回洗浄し、続いて30分間の0.1Mカコジル酸緩衝液2 mlの1％四酸化オスミウムを加えて固定液と染色細胞を除去し、最後に蒸留H 2 Oですべてのバッファを置き換える</li><li>標準のEMプロトコルに続いて、エタノールで段階（70％〜100％）を直列にサンプルを脱水。エポン樹脂が充填されたチューブの上にエポン樹脂と場所のカバーガラスセル側を下準備します。 60℃で24時間重合を許可℃にセル側が行うフォトエッチンググリッド化されたカバースリップを置くことでエポン樹脂にWNは、目的の細胞だけでなく、グリッドパターンの両方が（ 図に示した例3B）重合時エポン樹脂に転送されます。 </li><li>速やかに液体窒素および/または熱湯に浸漬することによって、エポン樹脂からカバーガラスを外します。興味のあるグリッド（：グリッドパタパタは鏡像として転送されます注意してください）​​検索する双眼解剖スコープ内で樹脂の表面を点検してください。無菌のかみそりの刃またはメスを用いて、関心のある唯一のグリッドはエポン樹脂ブロックの頂点にあるようなエポンブロックを切り詰める。 </li><li>ウルトラミクロトームを使用して、所望の厚さ（断層TEM用従来のTEMおよび〜250nmの厚さのために〜70nmの厚さ）でトリミングブロックの連続切片を獲得。標準的なプロトコルに従って酢酸ウラニルとクエン酸鉛でセクションを比較してください。 </li></ol> 5。相関光学および電子顕微鏡<ol><li>で、目的の細胞を再配置前の手順で得られた画像を用いて電子顕微鏡。興味のある回顕微注入した細胞の位置が特定されている、興味のあったセル内の領域を識別するために高解像度の共焦点蛍光画像を使用しています。 TEMを用いた高解像度の画像、これらを。蛍光zスタック画像がEMスライスに対応するかを決定するためにそのような細胞周囲や核膜などのランドマークを使用しています。 </li><li>お好みの画像処理プログラム（例えば画像Jは、Adobe Photoshopなど）を使用して、50％に蛍光画像の不透明度を下げると、それが相関するとTEM像の上に重ねます。スケールを調整することによって、画像（縦横比を固定することを忘れないでください）​​とTEM像と一致するように共焦点画像の回転を合わせます。蛍光画像のコントラスト、シャープネスなどを微調整し、アライメントを助けるかもしれない。注：私達はヘテロクロマチン、核膜、およびセルの周囲が支援するための優れた建造物を表すことを発見した2画像の向きインチ</li></ol> 6。重要な考慮事項<ol><li>大幅に注入された小分子を識別しやすいように、例えばローダミンまたはフルオレセインなどの蛍光タグが共有結合し、市販のキットを使用して取り付けることができます。追加情報は、異所的にマイクロインジェクションの前に蛍光細胞内局在のマーカータンパク質を発現することによって得られる。したがって、蛍光体および不活性マイクロインジェクショントラッキング色素の選択が重要になります。 </li><li>近くにカバースリップの中心に付着しているマイクロインジェクションのための細胞を選択し、エッジに近いグリッドを選択しないように。これは、目的の細胞を電子顕微鏡に使用エポン樹脂に転写されることが最大の確率を提示します。 </li><li>細胞のコンフルエントI完全合流プレートとして、大事には電子顕微鏡でマイクロインジェクション細胞の同定は非常に困難になります。彼らは短い実験の当日〜50％コンフルエントに達するか、または長い（1-2日）実験当日の密集度25％〜ようではなく、種細胞。位置や形状の細胞と同様に配向させるランドマーク電子顕微鏡像として &quot;空のスペースを使用します。 </li><li>共焦点光学スライス厚は、実験のニーズに合わせて調整する必要があり、したがって、経験的に10を決定すべきである。 </li><li>固定剤のホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、利用可能な最も高いグレードである必要があります。ホルムアルデヒドは、細胞を固定し、さらにタンパク質や小さな蛍光分子（例えば、ローダミンまたはFITCなど）の両方の蛍光特性を保持します。しかし、それは高いEMの解像度を可能にするための構造が保持されません。グルタルアルデヒドはanaly EMに高度に膜や細胞内構造を保持SISが、かなり蛍光妨げるでしょう。したがって、2つのステップの固定は、蛍光顕微鏡法とEMの両方にとって重要です。最後の固定がグルタルアルデヒド処理によって行うことができるようにホルムアルデヒド固定ステップは、生細胞の測定を実行する場合は省略できます。 </li></ol> 7。代表的な結果この手順では、真核細胞の細胞質に直接目的の分子を提供し、ミリメートルからマルチナノメートルの分解能に対する細胞とorganellerアーキテクチャにその局在および/または効果をモニターする能力を与える。実験装置と手順の概略図を図2に示します。この手法は、共焦点顕微鏡の後、エポン樹脂（ 図に目的の細胞だけでなく、グリッドパターンの両方を転送することができるレーザーエッチングされたガラスカバースリップグリッド化（ 図3A）、上に成長させた細胞のマイクロインジェクションに依存している3B）。 典型的なマイクロインジェクションのCLEM手順は相関蛍光画像と電子顕微鏡写真を、もたらし、細胞内局在性および超微細構造解析の両方を可能にします。フォトエッチングガラスグリッド化されたカバースリップ上で培養した細胞は、明視野像が得られた後、目的の分子（ 図4A）にマイクロインジェクションする。不活性トラッキング色素が非マイクロインジェクション細胞（ 図4B）からマイクロインジェクション、細胞を区別するために組み込まれている。共焦点Z-スタックはフルオロフォアまたは関心のマイクロインジェクション小分子（ 図4C）に接続された他の識別子を使用して得られる。サンプルは、グルタルアルデヒドで固定し、電子顕微鏡用に処理されます。電子顕微鏡写真は、それに対応するセル（ 図4D）に取得され、オーバーレイされます。蛍光シグナルを宿す領域が（ 図4Eより高い倍率で、より詳細に検査され</強い&gt;）。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="図1"/> 図1マイクロインジェクションのCLEM手続きのタイムライン。実験の設定に応じて、マイクロインジェクションし、蛍光測定は、同じ日に行うことができます。電子顕微鏡用の試料を準備する長いインキュベーション工程に最も時間がかかるためで、2〜3日続く。 TEM解析および電子顕微鏡画像を用いた蛍光信号を相関は一日で行うことができます。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="図2"/> 図2マイクロインジェクションのCLEM手順の一般的な実例ステップ1：レーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上に増殖している細胞を見つけ、目的の分子を顕微注入するステップ2：明視野画像とマイクロインジェクション、細胞の共焦点蛍光灯Z-スタックの両方をキャプチャステップ3：準備するEMのためのカバーガラスは、分析とエポン樹脂に埋め込む。転送されたグリッドパターンを用いて、目的のように細胞をブロックトリム頂点にあるステップ4：ウルトラミクロトームで切断し、シリアルのセクションでは、 ステップ5：EM画像と蛍光画像を関連付けます。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="図3"/> 図3グリッドパターンは、目的の細胞の識別を容易にパネル 〜50％コンフルエントまで増殖させた細胞のマイクロインジェクションを示す。。グリッド識別子AKの点に注意してください。スケールバーは100μmである。 パネルBは、関心のあるグリッドは、解剖顕微鏡で同定された後、連続切片となる重合エポン樹脂ブロック上にカバースリップから転送グリッドパターンを示しています。 パネルCは、セクショニングの準備のために転送されたグリッドパターンを示しています。転送されたグリッドのパタパタは樹脂ブロックに逆であることに注意してください。SCAL電子バーは1200μmである。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="図4"/> 。図4マイクロインジェクション相関光と電子顕微鏡からの代表的な結果をパネルレーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上で生育NRK細胞の明視野顕微鏡写真を示し、矢印は、パネル内のCDのCLEMによって可視化される二つのセルを示すパネルBは蛍光を示す。不活性トラッキング色素の、このケースでは、カスケードブルー、顕微注入した細胞を識別するために使用される。 パネルCは、明視野の重ね合わせとローダミン標識小分子の蛍光シグネチャを示しています。ここに示されている2つのセルはA＆B パネルDは明視野、蛍光および電子顕微鏡のCLEMを表すパネルの矢印で示されます。矢先は蛍光punctaはパネルEで高倍率で結像を示しスケールバーは次式のとおりです。安値：パネル＆Bは100μm、C＆Dは50μm、E、100nmである。

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	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていません。

ここで紹介する方法は、真核生物の細胞質に精製されたタンパク質、核酸、または小分子を直接配信することを可能にし、蛍光および電子顕微鏡の相関関係により超高分解能分析を与える。このメソッドの使用方法はシンプルなもので、様々な既存のコア施設及び/または適切に装備され、電子顕微鏡の研究室で、社内で行うことができます。技術は、ユーザがリアルタイムで蛍光標識された...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>フォトエッチングカバーガラスとライブセルプレート</td><td>マテック</td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td>カスケードブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td>ローダミン標識キット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmの遠心ろ過ユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF100-50から10 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP-97 </td><td>ランプテストを実行した後にプログラム＃4を使用</td></tr><tr><td> FemtoJetのマイクロインジェクションシステム</td><td>エッペンドルフ</td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップの除去液</td><td>マテック</td><td> PDCFのOS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai透過型電子顕微鏡</td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td>ライカ</td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

真核細胞は、複雑に依存して高度に規制され、適切な細胞機能のために必要な生化学的な極性を維持する機能的に異なる膜結合コンパートメント。酵素、タンパク質、および細胞骨格成分がこの生化学的分離を支配し、維持する方法を理解することが極めて重要でことである。および/または混乱させる細胞内コンパートメントローカライズする蛍光標識分子の使用は、豊富な知識を得られたと携帯規制の我々の理解を進めてきた。蛍光、共焦点顕微鏡などのイメージング技術は比較的単純蛍光標識小分子の位置を確認し、しかし、非常に小さな構造の分解能は1に制限されます。 一方、電子顕微鏡は、非常に高い解像度で細胞内の形態の詳細を明らかにしたが、その静的な性質は、それが困難な高度に動的なプロを測定することができる精度2,3とcesses。したがって、同じ試料の電子顕微鏡と呼ばれる相関光学および電子顕微鏡と光学顕微鏡との組み合わせ（CLEM）4,5は 、電子顕微鏡6の高解像度を持つ超高速蛍光イメージングの二重の利点が得られる。この強力な技術は、細胞生物学5,7の多くの側面を研究するために実装されています。創業以来、この手順では、高解像度で細胞内のアーキテクチャや形態を区別するために我々の能力を高めている。 ここでは、CLEM（ 図1）に続いて急速なマイクロインジェクションを実行するための効率的な方法を提示します。マイクロインジェクションのCLEMプロシージャが直接真核細胞の細胞質に小分子および/ ​​またはタンパク質の特定の量を導入し、ミリメートルからマルチナノメートルの分解能（ 図2）への影響を研究するために使用することができます。技術はマイクロインジェクションに基づいている細胞は両方共焦点蛍光顕微鏡および電子顕微鏡でライブセルイメージング料理との裏面に貼付レーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上に成長させた。興味のあるセル（複数可）の局在を容易に試料の固定化に使用エポン樹脂に、目的の細胞と一緒に、転送され、電子顕微鏡分析（ 図3）に先立ってセクショニングされるグリッドパターンによって促進される。蛍光およびEM画像のオーバーレイは、ユーザーが同様に関心のマイクロインジェクション分子（ 図4）により誘導される任意の形態学的および/ ​​または微細構造の変化などの細胞内局在を決定することができます。この手法は、マイクロインジェクション試料の性質に応じて、いくつかの時間≤5秒からまでの範囲の時間ポイントに適している。

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この...

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

生物学

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

蛍光と超微細構造の同時保存のための新しいプロトコール

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

著者スポットライト:蛍光タンパク質保存による相関光顕微鏡および電子顕微鏡の進歩

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.