ファイザー株式会社から博士ソーントンへの資金は感謝して承諾されています。

1。収集、保管および血清および気管支肺胞洗浄液の調製<ol><li> 4℃で凝固するために使用する℃、-20℃でアリコートとして店舗血清°Cの前に血液を可能にすることにより、未処理の血液サンプルから血清を収集。気管支肺胞洗浄液（BAL）も、-20℃でアリコートとして格納する必要があります注：分注し、血清及びBALの記憶域が繰り返し繰り返しテスト中にサンプルの凍結融解することによって、標的抗原の分解の可能性を制限します。 </li><li>雪解けサンプルと14,000 rpmで1分間ボルテックスし、遠心分離によって徹底的に血清およびBAL試料を混ぜ合わせる。 </li><li>ヒト血清サンプルのルーチンテストのために、組織培養培地（TCM）と血清1:1（v / v）を希釈します。 TCMは、RPMI-1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清、200mMのL-グルタミン溶液の1％（v / v）の、そして防腐剤としてアジ化ナトリウム（0.02％w / v）で構成されています。培地は事前に準備されており、数ヶ月間、4℃で保存することができます。 dilutの100μlを適用するLFDにED血清。 </li><li>人間BAL流体、および動物モデルからBAL流体には、無治療前に、LFDにきちんとしたサンプル100μlを適用します。 </li><li>動物モデルからの血清のために、リン酸塩は沸騰水浴、14,000 rpmで5分間遠心し、適用される100で4％（w / v）のEDTA、3分の熱を含む緩衝生理食塩水で血清1:2（v / v）を希釈するLFDデバイスへのきちんとした上清の添加。 </li></ol> 2。ラテラルフローデバイスへの血清およびBALのアプリケーション<ol><li>室温（23℃）で横方向のフローデバイスを格納します。この温度で​​は、これらのデバイスは12ヶ月間安定しています。レベルの表面にその袋と場所からデバイスを削除します。 </li><li>滅菌したピペットチップを使用して、デバイスのリリースポートに前処理した血清またはきちんとしたBAL試料100μlを適用します。 </li><li>アッセイは、テストの結果が記録されるべき時に室温で15分間、実行することができます。注：秒以内に流体がSEになるenは、観測窓のニトロセルロース膜に沿って毛管作用によって移行することができます。 </li></ol> 3。 LFD結果を記録するとの解釈<ol><li> LFDは、内部制御ライン（プラスチックハウジング上に文字Cで示される）とテストライン（文字Tで示される）で構成されています。コントロールラインは常に血清またはBAL試料中にアスペルギルス抗原にかかわらず表示されます。これは、アッセイが正しく実行されたことを示しています。 </li><li> アスペルギルス抗原は、血清またはBAL試料中に存在する場合は、テストラインは、サンプル·アプリケーションの15分内に表示されます。試験線の強度は、試料中のアスペルギルス抗原の存在量に比例するので、テストラインが（+）弱い陽性として表示されることが、中等度陽性（+ +）または強い正（+ + +） 。しかし、任意の正のテストラインは関係なく、強度、試料中のアスペルギルス抗原の存在を示すことになる。番目のアスペルギルス抗原の電子の不在は、全くテストラインが表示されません、結果は負の値として記録されます（ - ）。 </li></ol> 4。代表的な結果 BALと血清サンプルと負の、弱い陽性、中等度陽性、強陽性のLFD結果の代表例を図1に示されています。 抗原陽性LFDテスト（弱いものと強いもの）や急性骨髄性白血病（AML）患者からBAL流体を用いた負LFDテストの結果を表1に示されているEORTC / MSG診断基準に従って診断した。このテーブルに含まれる、対応する臨床的および菌（ラクトマンナンと文化）データであり、 アスペルギルス特異的PCR検査の結果は、各患者のために、セントBartholomews病院8で開発しました。病気の診断は、宿主因子（好中球減少症、コルチコステロイドの長期使用、他の認識T細胞immunos治療に基づいていたuppressants）、臨床的基準とBALのためにGM陽性（ここではGMのインデックス値&gt; 0.8として定義されます）。 2002 EORTC / MSGのガイドライン10の下に、患者12、13および16は、宿主因子と臨床的基準またはGM陽性に基づいて&#39;可能&#39; IAと診断された。それぞれの臨床データおよび真菌学からの証拠をサポートすることで、同行しない限り、改訂された（2008年）EORTC / MSGのガイドライン2、宿主因子とGM陽性単独で、あるいは宿主因子単独で臨床的基準によれば、 &quot;可能性&quot;侵襲性真菌感染症を示しませんでした。患者6はために宿主因子、メジャーとマイナーの臨床的特徴とGM陽性の両方の2002年から2008年のガイドラインの下にある &quot;可能性&quot; IAと診断されました。 LFDやPCRアッセイのどちらも現在はEORTC / MSGのガイドラインに含まれていながら、2アッセイおよびBAL試料におけるアスペルギルス抗原、核酸の存在を示す商業ガラクトマンナンのテストの間に強い合意があるに注意し、<html>患者の6〜12の秒。 IPAを診断するLFDやPCRアッセイの有効性を実証する臨床試験の追加の結果は、Johnson ら 8に記載されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> 図1血清およびBALを使用してLFDテスト（コントロール及びテストライン）負（コントロールラインのみ）と肯定的な結果。テストライン反応の強度は、血清およびBALサンプル中の標的抗原の濃度に比例します。反応は一般的に範囲から弱（+）中等度から（+ +）への強い（+ + +）。かかわらず、試験線の強度の、すべての3つの血清陽性反応が血流中にアスペルギルス抗原を循環の存在に起因する侵襲性肺アスペルギルス症を示すことになる。正のBAL反応（弱、中程度または強い）は、胞子や肺の潜在的に病原性の菌糸の開発の発芽を示すであろう。 pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> 患者ません。 </td><td> PatiENT情報</td><td> 臨床基準1 </td><td> BAL文化2 </td><td> GM EIAインデックス3 </td><td> EORTC / MSG（2002）4 </td><td> EORTC / MSG（2008年）5 </td><td> アスペルギルス PCRの結果 </td><td> LFD結果 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td>主要なCT記号（結節とハロ）とマイナー1 </td><td>負</td><td> 0.9（正） </td><td>考えられる</td><td>考えられる</td><td>正の</td><td>プラス（+）弱い</td></tr><tr><td> 12 </td><td>推定される以前の真菌感染症</td><td>主要ないいえ、マイナー1 </td><td> カンジダglabrata </td><td> 6.43（正強） </td><td>可能</td><td>なし</td><td>正の</td><td>強い陽性（+ + +） </td></tr><tr><td> 13 </td><td>コアグラーゼ陰性ブドウ球菌ylococcusとE.血液中の大腸菌 </td><td>大きな、二つのマイナーません</td><td>負</td><td> 0.25（負） </td><td>可能</td><td>なし</td><td>負</td><td>マイナス（ - ） </td></tr><tr><td> 16 </td><td>肺感染症</td><td>潜入し新たに加え、複数の胸水を含む3つのマイナーの基準</td><td>負</td><td> 0.16（負） </td><td>可能</td><td>なし</td><td>負</td><td>マイナス（ - ） </td></tr></tbody></table> CTスキャンで1結節またはハローは、真菌感染症を示唆する それはヒトの正常細菌叢の一部として単離された9番目の最も一般的な酵母であるとして、BAL液中の2 カンジダglabrataは、汚染物質と見なされる BALのGM EIA試験で&gt; 0.8の3指数は、 アスペルギルス感染症の指標である 4 &#39;possibl 2002 EORTC / MSG診断基準に基づいて、E &#39;、&#39;可能性&#39;や&#39;実績のある侵襲性真菌症10 5 &#39;可能性&#39;の改訂（2008）EORTC / MSG診断基準、 &#39;可能性&#39;や&#39;実績&#39;侵襲性真菌症2に基づく 表1。可能性IPAを伴う急性骨髄性白血病の患者から、制御AML患者（感染の証拠なし）、および感染のEORTC / MSG診断からBAL試料のLFD試験の結果。

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我々は、開示することは何もありません。

IPAの決定的な同定は、唯一の真の生検試料から病原体の分離によって達成されるが、適切なサンプルの回復は非常に病気の患者ではしばしば不可能であり、 アスペルギルス属は血液からまれに回復可能であることができます。大きな進歩は、IPAの診断で、胸部のスキャンコンピュータ断層撮影の使用で行われているが、そのような &quot;ハロ&quot;または &quot;空気三日月&quot;の兆候として肺IPAを示唆している特性は、どちらか一時的なものや呼吸のアーチファクトに起因することができますまたは他の真菌感染症11,12。このようなデータは、したがって、患者の血清中に循環しているか、BAL液、喀痰や尿サンプル13に存在している菌類から署名分子を（GMとβ-グルカン）を識別することを目的と血清学的手法で補完しています。これらのテストは十分な感度が表示されますが、それらは一定の条件1,6の下に十分な特異性を欠いている、または干渉に苦しむ</sup&gt;。 ここで紹介するIPAを検出するためのLFDテストでは、ウイルス、細菌、寄生虫や毒素14から19と、最も有名な、検出のためのテストでこれまでに使用されているIPAや攻撃技術の&quot;ポイント·オブ·ケア&quot;の診断を可能にする1988年にUnipathによって導入された家庭用妊娠検査のために。ここで説明したアスペルギルス LFDは、 アスペルギルス特異的mAb JF5は、多孔性ニトロセルロース膜上に捕捉ゾーン（テストライン）に固定されています。独立したゾーン内の膜に固定化した抗マウス免疫グロブリンは、内部統制（コントロールライン）を務めていました。リリースポートに血清又はBAL液を添加すると、リリースパッドのMAb JF5-金コロイド複合体は、標的抗原に結合し、複合体は、その後、毛管現象によって多孔質膜に沿って渡します。捕捉ゾーンで固定化モノクローナル抗体JF5は、赤色のテストラインでの結果JF5-金コロイド - 抗原複合体に結合する。すべてのバインドされていないJF5-金コロイドコンジュゲートは、アッセイが正しく実行されていることを示す内部コントロールにバインドします。赤色の制御ラインでこの結果。 テストは短時間で実行するために、わずか15分を取って、血清およびBAL GMに基づいたテストとβ-グルカンの検出に比べて安価であり、実行するために高価な機器や大規模な実験施設を必要としません。さらに、モノクローナル抗体JF5は、GMとβ-グルカンテスト1,4,6の偽陽性反応を引き起こすことが示されている薬や汚染物質とは交差しません。現在の診断テスト以上の追加の主な利点は、 アスペルギルス種の浸潤性増殖の指標である活動を検出するLFDs能力である。 LFD手続きにおける重要なステップは、デバイスへの血清またはBALサンプルの適用後に結果の15分を読むために必要です。テストは、今年5月バイアス結果interpretatiとして、結果を記録する前に、より長い15分間放置すべきではありませんで。弱い反応は、潜伏期間を拡張することによって強化されることはありません。感染症の動物モデルからの血清の熱処理は、アッセイの感度を向上させるために発見されました。テストの制限は、定性的なことですし、陽性の主観的な評価を行うための演算子に依存しています。試験線の強度は、血清及びBAL試料（ 図1）抗原の内容に応じて異なります。しかし、任意の正の反応は（知られているネガの比較により決定） アスペルギルス抗原、したがって、感染の有無を示しています。 LFDアッセイの主観性を制限するには、ハンドヘルドデバイスは、LFDテストライン強度の定量化が可能となり、抗原検出20のしきい値の設定を有効にされご利用いただけます。 LFDの将来の発展は、その商業化や他の侵襲性真菌病原体の同時検出を可能にする多重LFDの開発を含む非常に特異的なモノクローナル抗体3を使用して 。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> アスペルギルス LFD </td><td>エクセター大学</td><td></td><td>リクエストに応じて対応する著者から入手できます</td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td>シグマ</td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>シグマ</td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td>ウシ胎児血清の他の情報源は、TCMの調製に使用することができます</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

侵襲性肺アスペルギルス症（IPA）は、罹患率および血液悪性腫瘍患者と造血幹細胞移植レシピエント1の死亡率の主要な原因です。 IPAの検出は手ごわい診断上の困難を表しており、 &quot;ゴールドスタンダード&quot;が存在しない場合に、臨床データと微生物学、病理組織学的実現可能との組み合わせに依存しています。 IPAの診断2 &quot;可能性&quot;と&quot;可能性&quot;侵襲性真菌疾患、研究と治療がんのと&quot;実績&quot; ​​を定義アレルギー感染症真菌研究グループ（EORTC / MSG）コンセンサスの国立研究所のための欧州機関に準拠している必要があります。現時点では、核酸ベースのテストは、外部IPA検出のために検証されていないので、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、現在のEORTC / MSG診断基準に含まれていません。 組織切片におけるアスペルギルス症の同定のためシミの問題がある他の侵襲性真菌病原体3と、実績のあるIDを持つ菌糸の形態でlaritiesは、純粋培養で病原体の分離を必要とします。文化ベースのアプローチは、生検試料の可用性に依存しているが、これらは常に病気の患者ではアクセスできませんし、得られたときは、常に文化のための現実的な繁殖を生むとは限らない。 アスペルギルスの発症に重要な特徴は、血管浸潤免疫血清および気管支肺胞洗浄（BAL）液中で特徴的な抗原の署名分子を検出するテストを使用して菌を追跡する機会を提供して形質である。これはアスペルギルスガラクトマンナンと保存された真菌細胞壁成分を検出（1→3）-β-D-&quot;パン真菌&#39;アッセイ（Fungitellテスト）を検出Platelia酵素免疫測定法の開発（GM-EIA）につながっているグルカンではなく、それらの細胞壁1,4は、このコンポーネントを欠いているケカビ目インチです。これらのテスト1,4-6の精度を周囲の提訴は、次世代のモノクローナル抗体（MAb）ベースの感染症1,5のサロゲートマーカーを検出するアッセイの最近の発展につながっている。 ソーントン5は最近IPAのポイントオブケア（POC）診断のための免疫クロマトグラフの横フローデバイス（LFD）を開発するハイブリドーマ技術とその使用方法を使用して、 アスペルギルス特異的モノクローナル抗体（JF5）の生成を説明します。 LFDの主な利点は、MAb JF5は、真菌のみ5の活発な成長の間に分泌される細胞外の糖タンパク質抗原に結合するためのアクティビティを検出する能力である。これはアスペルギルス胞子が吸入空気の共通コンポーネントであるため、IPAを診断するため、肺のBALなどの流体を使用して、重要な考慮事項です。 IPAを診断する装置の有用性はLFDが改善感度と仕様を表示し、感染の動物モデルを使用して、実証されているificityはPlatelia GMとFungitell（1→3）-β-D-グルカンアッセイ7に比較されます。 ここでは、ヒト血清およびBAL液中にアスペルギルス抗原を検出するためのシンプルなLFD手順を提示します。そのスピードと精度は、血液悪性腫瘍患者におけるIPAの診断のための新たな補助ポイントオブケアテストを提供します。

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

侵襲性肺アスペルギルス症に対する迅速かつ正確なポイント·オブ·ケアテストが提示されます。それはに結合する特異的なモノクローナル抗体を使用して、横フロー技術を利用しています<em&gt;アスペルギルス</em&gt;抗原は肺感染症時に分泌される。アッセイは、血清およびbrochoalveolar洗浄と互換性があり、病気の診断のための新たな補助試験を表しています。

ラテラルフロー技術を用いた血液学的悪性腫瘍患者における侵襲性肺アスペルギルス症の検出

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

detection-invasive-pulmonary-aspergillosis-haematological-malignancy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.8K ビュー.  University of Exeter. 侵襲性肺アスペルギルス症に対する迅速かつ正確なポイント·オブ·ケアテストが提示されます。それはに結合する特異的なモノクローナル抗体を使用して、横フロー技術を利用していますアスペルギルス抗原は肺感染症時に分泌される。アッセイは、血清およびbrochoalveolar洗浄と互換性があり、病気の診断のための新たな補助試験を表してい?...

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

ラベルフリーバイオセンサー技術を活用乳癌におけるヒト白血球抗原バイオマーカーの検出

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...