我々のアプローチは、全体実装光学的にクリアされたマウス肺のアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の定量分析を行うことを可能にする。アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアは、気道に浸透し、免疫不全患者に生命を脅かす疾患を引き起こす可能性があります。哺乳類の気道は、異なる世代の気道のシステムです。
各世代は、気道壁と免疫細胞集団の異なる構造によって特徴付けられます。気管支枝では、アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアは粘膜クリアランスによって排除される。しかし、利用可能な空間では、粘膜クリアランスは機能せず、コニディアは肺胞マクロファージや好中球などの免疫細胞によってクリアされなければならない。
気道におけるコニディア分布の空間的時間的側面が重要である。しかし、疾患メカニズムを理解する上で問題を適切に調査しなかった。ここでは、感染したマウスの気道におけるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の定量分析のための実験セットアップを提示する。
標識されたアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアを50マイクロリットルのマウスに塗布します。6時間後、肺を収穫する。2%ホルムアルデヒドと染色に一晩固定し、ストレプトアビジンコンジュゲートを標識します。
その後、試料を光学的な清算に供する。50%メタノール水溶液を充填したガラス瓶に試料を入れ、室温でサンプルミキサーに1時間置きます。50%メタノールを100%メタノールに置き換え、サンプルミキサーの下に2時間置きます。
ベンジルアルコール1部とベンジル・ベンゾエートの2部からなる混合物を調製する。試料を24ウェルプレートに移し、ベンジル・ベンゾエート混合物で少なくとも30分間覆う。サンプルはイメージングの準備ができています。
サンプルホルダーにサンプルを置きます。そして、顕微鏡にホルダーを置きます。顕微鏡システムをオンにしてソフトウェアを開いた後、透過光を点灯してX目的を選択します。
サンプルを透過光の中で視覚的に見つけ、取得タブに進みます。共焦点レーザー顕微鏡ラムダモードを選択します。適切なレーザーをオンに切り替えます。
検出器のスペクトル範囲を設定し、二色性ミラーを選択します。検出器のゲインを調整し、ピンホールを1つのエリアユニットに絞ります。ピクセルの解像度を 512 x 512 に設定します。
zed-stack モードをオンにして、ライブイメージングを開始します。両方のサイコロが見える焦点面を見つけます。zed スタックパネルを展開します。
フォーカスホイールを使用して、サンプルの最も低い平面と最も高い平面を検索して選択します。サンプルの下部の横に焦点面を置きます。zed-stack モードをオフにして、スキャンモードをダイヤルします。
必要に応じて、X、Y の位置とタイルの数を調整します。zed-stack モードとダイヤルスキャンモードをオンにします。zed断面ステップを5ミクロンに設定します。
スキャン速度を設定します。実験を開始します。通常、イメージングは、土地のサイズとスキャン速度に応じて数時間かかります。
得られた画像は、次いでスペクトル的に混合されない。スペクトルのアンミックスには、線形アンミックスオプションを使用します。ストレプトアビジンとコニディアのラベルが付いた土地領域に対応する地域を選択します。
アンミックスを開始します。混合解除後、混合していないファイルを保存します。取得した画像からタイルをスティッチするには、画像を開きます。
方法、幾何学的ステッチを選択します。入力ウィンドウでイメージを選択します。ステッチオプションで、新しい出力とヒューズタイルオプションを選択します。
エアウェイ蛍光に対応する選択したチャネルで参照モードを使用します。余剰の 3D ビューでイメージを開きます。必要に応じて、プレゼンテーションに使用する色を変更します。
ここでは、灰色の色合いで気道チャンネルを表示し、紫色でコニディアチャンネルを表示します。気道マスクを作成するには、新しいサーフェスツールを追加を使用します。気道チャネルを選択し、10ミクロンのスムージングパラメータを選択します。
さまざまなフィルターを使用して、気道信号から除外できます。まず、サーフェスを視覚的に検査し、強度のしきい値を設定します。表面積のような追加のフィルターは、排他的に選択された気道にも適用できますが、胸膜や血管には適用されません。
次に、気道に属さない選択したサーフェスフラグメントを手動で削除します。これで、作成したサーフェスを観察し、不足しているパーツを調査して後で修正することができます。オプション編集とマスクをすべて使用して、気道サーフェスのマスクを作成します。
気道チャネルを選択し、サーフェスの外側にある作業セルを 0.001 に設定します。ここでは、結果のマスクをオレンジで示しました。コニディアチャンネルと気道マスクを2つの別々のフォルダに保存します。
エアーウェイマスクイメージを使用してファイルを開きます。イメージをバイナリにします。プロセスバイナリに従って、バイナリを作ります。
マスクの厚さに似た場合は、いくつかの拡張 3D 関数を適用します。プラグイン、プロセス、拡張3Dに従ってください。マクロ機能を使用してこれを行うこともできます。
数サイクルの拡張プロセスの後、穴の穴関数を使用します。プロセス、バイナリ、フィルホールに従ってください。マスクの残余穴を手動で埋めるには、関心のある領域マネージャを開きます。
分析、ツール、ROI マネージャーに従います。ポリゴン選択ツールを使用して、特定の投影で塗りつぶす領域を選択します。対象領域の形状を補間できるように、zed スタックの投影法に対して複数回実行します。
選択した図形を補間するには、すべての図形を選択し、さらに押して、ROI を補間します。その後、すべての ROI を白で塗りつぶします。穴の穴をもう一度使用します。
穴を埋めた後にマスクの厚さを元に戻す場合は、浸食 3D 関数を適用します。プラグイン、プロセス、侵食3Dに従ってください。これにはマイクロを使用することもできます。
浸食 3D と LA 3D の反復の数は等しい必要があります。コニディアカウントアプリケーションを起動します。ファイルの追加ボタンを押して、準備された気道マスクとConidia蛍光画像を持つDIFFファイルを持つフォルダを選択します。
カスタムしきい値を 0 から 1 の間で設定します。[OK] をクリックして結果を確認します。この手法を用いて、コニディア塗布から6時間後に、マウスの気管支樹の内外でコニディアの定量分析を行う。
データは、私たちの元のアプリケーションでは、Conidiaの大部分がアルファラ空間に浸透し、炎症性免疫応答の開始時にそこに割り当てられたことを示唆しています。共焦点レーザー走査顕微鏡によるマウス肺の3次元画像化により、気道内のアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアを同定できる。このプロトコルを用いた3次元画像の処理により、気管支の内外でのコニディア分布の定量分析を行うことができます。
我々のアプローチはまた、マウスの離れからコニディア排除の運動学を推定し、免疫担当および免疫不全マウスにおける解剖学的コニディア分布を比較するために利用することができる。さらに、このアプローチを使用して、気道に凝集した微粒子またはナノ粒子の分布を分析することができる。
