我々は116520 DP2 NIHの新しいイノベーター賞とORAUラルフポウジュニア教員強化賞からのサポートを認める。

1。細胞維持<ol><li>メディアは毎日変更でのH1 hESCの（WiCell）は、mTeSR1媒体でhESCの資格をマトリゲル被覆ウェル上で維持した。 F12：ウェルズは、DMEM 25 mlにhESCのマトリゲルの300μlを添加して調製希釈マトリゲルソリューションによって被覆されていた。このマトリゲル溶液1mlは、6ウェルプレートの各ウェルに添加し、または400μlを12ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間コートさせた。細胞は機械的に彼らが1の間で、直径1.5ミリメートルに達した後、コロニーを掻き取ることにより、1:4の分割比で継代した。 </li><li> RHMVEC（VEC技術）が一日おきに変更するメディアとMCDB-131培地中で維持されていた。 80％の合流が1:3の分割比で到達した後、細胞をトリプシン処理によって分割された。通路3と7の間の内皮細胞は、この研究のために使用された。 </li></ol> 2。ストック溶液の調製<ol><li>アクチビンは、滅菌Pの濃度50μg/ mLで再構成したBSは、アルブミン0.1％ウシ血清を含む。溶液は-20℃で小分けして保存されていた</li><li> EGFは、無菌の10mM酢酸で500μg/ mlで再構成した。溶液は-20℃で小分けして保存されていた</li><li>インスリンは10mlの水に0.1ミリリットルの氷酢酸を添加することによって調製した酸性化し、H 2 O（pHが≤2）を追加して10 mg / mlで再構成した。 </li><li> DAPTは、18 mg / mlをDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで300μMの濃度に希釈した</li><li> KAAD-シクロパミンは5mg/mlでDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで2μMの濃度に希釈した</li><li>オールトランスレチノイン酸は、95％エタノールで2.7 mg / mlを再構成した。 、F12注し、-80℃で保存し：それはさらにDMEMで2mMの濃度に希釈した</li></ol> 3。胚体内胚葉（DE）と膵臓前駆（PP）の誘導<ol><li> H回直径1〜1.5ミリメートルに達したESCコロニー、DE誘導をDMEMを加えることによって行った：F12はB27を補充し、0.2％BSA、100 ng / mlのアクチビンのメディアと、4日間のために1μMのウォルトマニン（0日目·4日目）毎日変更します。 </li><li> DEの誘導が完了した後、膵臓の前駆細胞の誘導は、DMEMにメディアを変更することにより誘発された：F12は、24時間0.2μM濃度（4日目 - 5日）でB27、0.2％BSAとKAAD-シクロパミンを添加した。 </li><li> 24時間後、メディアはDMEMに変更されました：F12は、補充したB27、0.2％BSA、メディアは毎日変更と3日間0.2μMの濃度2μMの濃度で全トランスレチノイン酸（5日·8日目）でKAAD-シクロパミン。 </li></ol> 4。膵臓の成熟<ol><li> PPの誘導の後、すべてのグループをDMEMから成る成熟メディアに変更されました：F12、2 dのB27、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、25μg/ mlのインスリン、30nMでのNa 2 SEO 3〜50μg/ mlのトランスフェリンを添加したメディアとAYSは（8日·10日）毎日変更します。 </li><li>成熟培地中の2日後、最終的な成熟のステップは、並列比較のために、いくつかの異なる条件を使用して行われます。 （i）の制御などの内皮細胞がなく、唯一の共培養メディアを使用すると、（iii）RHMVEC細胞と接触共培養を用いたノッチ阻害剤DAPT（II）を使用して：分化は、以下の条件の下で誘導された。細胞は、メディアは毎日変更で（10日·17日目）週間DAPTまたは共培養培地中で維持した。 <ol><li> DAPTメディアは30μMのDAPTと成熟メディアを補完することにより調製した。このグループ内の細胞を6日間（11日·17日目）の最初の24時間MCDB131を完了するために露出し、その後DAPTメディアに暴露した。 </li><li>共培養培地は、B27とMCDB-131メディア、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、10 ng / mlのEGF、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、10 mgのEndoGro、90μg/ mlのヘパリンを補完することにより調製した。メディアコントロール条件では分化細胞が露出したメディアが6日（11日目 - 17日目）（NO内皮細胞）の共培養培地に変更された後、24時間MCDB-131完全培地（10日·11日）まで。 </li><li>接触共培養条件については、100万RHMVECは、添付ファイルを許可するように24時間完全MCDB-131培地中の分化細胞（VEC技術）（10日·11日目）に添加した。 24時間後、メディアはメディアが毎日変更で6日間（11日·17日目）の共培養培地に変更されました。 </li></ol></li></ol> 5。定量RT-PCR解析<ol><li>分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終わりに溶解し、RNAは、製造元の指示に従って、NucleoSpin RNA II抽出キットを用いて抽出した。 </li><li> RNA品質はSmartSpecプラス分光光度計を用いてRNAの定量に続いて、260 nmと280 nmでのRNAの吸光度をチェックして分析した。 </li><li>逆転写ImProm II逆転写kを用いて行ったそれは製造元の指示に従って。すべての反応は、RNA 100ngので行われた。 </li><li>定量RT-PCRは、製造元の指示に従ってMx3005P QPCRシステム（アジレント）とブリリアントIIのSYBR Green QPCRマスターミックスを用いて行った。用いたプライマーは表1に記載されています。初期化ステップを95に続いて2分間50°C°Cで10分間で行われた。 50増幅サイクルは、次のように行った：95℃30秒C、54°、30秒と1分間72℃のC。 </li><li>未分化細胞上の標的mRNA発現の倍数変化は、次の式を用いてCT値から算出した。 ΔCT（マーカーI）= CT（マーカーI） - CT（GAPDH） ΔΔCT（マーカーI）=ΔCT（マーカi）から（サンプル） - ΔCT（マーカi）から（未分化細胞） 相対式（マーカーI）= 2-ΔΔCT（マーカーI） </li></ol> 6。免疫細胞化学<ol><li>分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終了時に細胞は、室温で15分間、4％ホルムアルデヒドで固定した。 </li><li>固定した細胞を15分間トリトンX-100（TX）0.25％を使用して浸透させた。 </li><li>非特異的染色を30分間TXを0.05％、10％ロバ血清中でインキュベートすることによりブロックされました。 </li><li>一次抗体のインキュベーションを4℃で一晩実施した、推奨抗体希釈（表1を参照）をブロッキングバッファーで°C。 </li><li>細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。 </li><li>二次抗体のインキュベーションは、ブロッキング緩衝液で希釈し、適切な抗体を用いて暗所に室温で1時間行った。 </li><li>細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。 </li><li>核染色は、PBSで1:1000に希釈した染色Hoeschtとのインキュベーションを行ったPBSで3回洗浄し、続いて5分間。 </li><li>固定および染色した細胞はオリンパスIX81倒立顕微鏡およびMetaMorphイメージングソフトウェアを使用して撮像した。 </li></ol> 7。代表的な結果 DEマーカーSOX17、CXCR4、およびFoxa2のために定量RT-PCR分析により確認し、 図2に示すように、SOX17のために免疫染色としてアクチビンの追加は、4日間のために未分化hESCのに増感剤は、胚体内胚葉を誘導する。シクロパミンとレチノイン酸の添加後、膵臓前駆細胞への分化は、膵臓前駆細胞のマーカーと、図3に示すように、PDX1の免疫染色の定量RT-PCRにより確認した。 分化の最終段階で、強くhESCの派生した膵臓の前駆細胞でのインスリン発現のアップレギュレーションを誘導RHMVEC細胞と共培養にお問い合わせください。共培養による分化の効率が共同で分析したDAPTを使用して、コントロール条件でmparing。それが現在膵臓の成熟を達成するために最も広く使用されている方法の一つですので、DAPTは、ポジティブコントロールとして使用されていました。共培養は、内皮細胞の支持要因によって補わ変更されたメディアで行われたので、追加のコントロールは、分化のメディアの効果を確認する内皮細胞の不在下でメディアを用いて行った。この分析の詳細については、図4に示されています。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> 図1インスリンを発現する細胞にhESCの分化のための多段階のプロトコルです。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> 図2：ヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉誘導。とウォルトマニン4日間アクチビンにさらさhESCの細胞の代表的なDEマーカーのA）定量RT-PCR解析。その結果、AR<html> eは未分化hESCのに関して正規化。 B）SOX17染色（緑）およびDAPI（青）SOX17の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> 内胚葉細胞由来の胚性幹細胞の図3。膵臓前駆細胞の誘導。 DE誘導後4日間シクロパミンとレチノイン酸にさらされるのhESC由来の内胚葉細胞の早期膵臓マーカーのA）定量RT-PCR解析。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 B）PDX1染色（紫）およびDAPI（青）PDX1の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。 &quot;&gt; <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> 図4膵臓成熟段階）定量RT-PCR hESCの膵ホルモンの分析DAPTを使用して、膵臓の成熟した後、共培養または共培養培地（コントロール）に連絡してください。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 p値はStudentのt-検定によって得られた。 B）RHMVEC（赤）標識ディル-AC-LDLとの共培養は、空のスペースは（上）がある場合は、ECSはプレートに取り付け、他のRHMVECが差別ESC（下）に直接接触して見つけることができる領域を示しています。共培養法を用いて分化した細胞のC）C-ペプチド（緑）染色。スケールバー：12.5ミクロン（上）と50μm（下）D）RHMVECの免疫染色では、RHMVECにはインスリンの発現を示していません。 <table border="1"><tbody><tr><td> マーカー </td><td> Primer1（5 &#39;から3&#39;）&lt;/ TD&gt; <td> Primer2（5 &#39;から3&#39;） </td><td> 参照 </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td>グルカゴン</td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td>インスリン</td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> 表1。定量PCR反応に用いたプライマー。

<ol>
	<li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+:+de+la+transgression+de+l'embryon+humain+&#225;+la+m&#233;decine+r&#233;g&#233;n&#233;ratrice+de+demain.">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain &#225; la m&#233;decine r&#233;g&#233;n&#233;ratrice de demain.</a> Gyn&#233;cologie Obst&#233;trique &#38; Fertilit&#233;. 37, 620-626 (2009).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+Signals,+and+Lineages+in+Pancreas+Development.">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li><li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells.">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li><li>Basma, H., Soto-Guti&#233;rrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes.">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li><li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage.">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li><li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine,+a+Hedgehog+signaling+inhibitor.">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li><li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans:+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., F&#228;ssler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vascular+Basement+Membrane:+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+[beta]&gt;+Cell+Proliferation.">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]&gt; Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li><li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a.">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li><li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines.">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li><li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

膵臓の開発中に、差別膵臓細胞では、大動脈からの内皮細胞と近接している。さらに、膵島は、血糖と膵島ホルモンの迅速な交換を促進するために密に血管があります。これらの事実を考えれば、内皮細胞が膵臓器官形成の過程において重要な役割を果たしていることは驚くべきことではない。膵臓の開発中の血管内皮細胞の重要性はますます高く評価されている間、胚細胞のin vitro分化<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> mTeSR1（サプリメント付き） </td><td>セル技術を幹</td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESCの修飾されたマトリゲル</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM：F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131（コンプリート） </td><td> VECテクノロジー</td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td>アクチビン</td><td>研究開発</td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/mlの</td></tr><tr><td>ワートマニン</td><td>インビトロジェン</td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C4116 </td><td> 0.2μmの</td></tr><tr><td>オールトランス型レチノイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> N0636 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S5261 </td><td> 30nMの</td></tr><tr><td>インスリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I1882 </td><td> 25μg/ mlの</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T8158 </td><td> 50μg/ mlの</td></tr><tr><td> EGF </td><td>研究開発</td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td>ガラス上培養</td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VECテクノロジー</td><td> ENDOGRO </td><td> 10mgの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H0888 </td><td> 1μg/mlの</td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td>マシュレナーゲル</td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II逆転写システム</td><td>プロメガ</td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントIIのSYBR Green QPCRマスターミックス</td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> SOX17ヤギポリクローナルIgG </td><td>サンタクルス</td><td> SC-17355 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td> PDX1ヤギポリクローナルIgG </td><td>サンタクルス</td><td> SC-14662 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>ポリクローナルC-ペプチドのウサギ</td><td>細胞シグナリング</td><td> 4593 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗ウサギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> - 21206 </td><td> 1000分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗ヤギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> - 21447 </td><td> 1000分の1 </td></tr></tbody></table>表2。試薬およびキット。

endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cells in a directed differentiation approach

胚性幹細胞（ESC）は、2つの主な特徴を持っている：彼らはいつまでもこのように複数の系統に分化する可能性を有する未分化の状態でin vitroで増殖させ、彼らが多能性であることができます。このような性質は、細胞ベースの治療と再生治療のアプリケーション1のESCのは非常に魅力的です。しかし、実現するための最大限の可能性のために細胞は骨の折れる作業である成熟した機能的な表現型に分化する必要があります。細胞分化を誘導するのに有望なアプローチは密接にin vitroでの設定で器官形成のパスを模倣することである。膵臓の開発は、肝臓や膵臓など、いくつかの臓器に開発することができます内胚葉から始まる、特定のステージ2で発生することが知られています。内胚葉誘導は4月7日 、いくつかの成長因子との組み合わせで3アクチビンの添加によりリンパ節転移経路の変調によって達成することができる</&gt; supの。胚体内胚葉細胞は、シクロパミン8の添加によってin vitroで達成することができますソニック·ザ·ヘッジホッグ阻害の阻害による膵のコミットメントを受けています。膵臓の成熟は、ノッチシグナル伝達の阻害を含むいくつかの並列イベントによって媒介される、3次元のクラスタに膵臓の前駆細胞の凝集、血管新生の誘導、いくつかの名前を指定する。これまで最も成功したESC由来の膵臓前駆細胞の体外成熟によってDAPT補充9でNotchシグナル伝達の阻害を介して達成されている。成功したものの、減少している機能を持つ成熟した表現型の低収率でこの結果。以下の研究領域は、ますます、生体内の膵島成熟10,11の重要な要因として評価されている膵臓の成熟にシグナリング内皮細胞の効果である。 現在の研究では、endothelのような効果を探るIAL細胞は膵島様細胞をインスリン産生にヒトESC由来の膵臓前駆細胞の成熟にシグナル伝達。我々は、ヒトESCが最初にPI3K経路を阻害するとともに、アクチビンによって内胚葉に向かって誘導される多段階の指示分化プロトコルを報告する。内胚葉細胞の膵臓の仕様は、レチノイン酸を添加することによりレチノイド誘導とともに、シクロパミンによってソニック·ザ·ヘッジホッグシグナル伝達の阻害によって達成されます。成熟の最終段階は、共培養の構成によって達成さ内皮細胞のシグナル伝達によって誘導される。いくつかの内皮細胞の共培養でテストされているが、ここに我々は、主に分析を容易にするために、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）で我々のデータを提示します。

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Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K ビュー.  University of Pittsburgh. 現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。

ビデオ: Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

生物学

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...