この作品は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（RB3-02266）およびNIH（DK54441）によってサポートされていました。

始める前に必ず注意事項： <ol><li>ヒト胎児の膵臓は、先天異常研究所、組織を採取し、ワシントン大学（シアトル、ワシントン州、米国）から入手した。試料の組織寄付、保管、および使用のためのインフォームドコンセントを中心によってドナーから得た。プロトコルの同意文が書面で提供され、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校ヒューマン研究プロテクションプログラム全体の研究（プロトコール＃081237XT）に承認された。 </li><li>それは、ヒト胎児の膵臓全体手順の間、氷上で膵臓を保持する容器の両方を維持することが不可欠である。解離および消化は可能な限り高速に実行する必要があります。 </li><li>ヒト胎児膵臓は膵臓の貯蔵及び輸送のためにバッファから入手したクリニックを送信します。 （RPMI-1640 +10％正常ヒト血清（NHS）、300 mMのトレハロースSG、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾン）。 </li></ol>ヒト胎児膵臓の1。解剖<ol><li> 2.5 mg / mlの終濃度を得HBSSでRTコラゲナーゼXI 5mgを溶解する。 4℃での滅菌（オートクレーブ処理）シンチレーションバイアルおよびストアに0.22ミクロンのシリンジフィルターで溶液を濾過滅菌組織培養フードでは、2無菌ペトリ皿、無菌小さな坩堝（るつぼが使用できない場合、小さなビーカーを置換していてもよい）、滅菌ハサミとピンセットをセット。膵臓を洗浄するために1ペトリ皿に2ミリリットルのHBSSを追加します。約1ミリリットルを残して、胎児の膵臓を含むチューブから吸引液、。 </li><li> HBSSずに60ミリメートルペトリ皿にピンセットで膵臓を削除します。これらの実験のために、胎児のICCは、9から23週までの妊娠年齢との新鮮な膵臓から生成されます。以前gestionational年齢で膵臓からの単離は、膵臓の大きさに困難である。プロトコルは、Pのしかし買収、23週を超えて在胎期間に適用される可能性が高いancreataこの時間以降にあるため、連邦政府（米国）の制約のために困難である。時折、胎児の膵臓は脾臓、脂肪、または元の解剖から付属の結合組織で到着。余分な組織は、肉眼で容易に見えるとプロトコルを開始する前に、膵臓から除去されるべきである。 </li><li>シャーレ内の冷HBSS（〜0.5ミリリットル）の最小容量の膵臓を洗浄します。 </li><li>アイスバケットに滅​​菌ピンセットと場所を使用して、小さな無菌るつぼにきれいに膵臓を移動します。を50ml遠心管用のホルダーに坩堝を置き、はさみの2対を用いて、激しく数分間膵臓スライス。 （通常2〜5分間が、時間は、組織の大きさや硬さに依存します）。テクニックをカットすることが重要です。唯一の反対のハンドルを移動する固定位置にハサミの片側を保持する。ハサミの先端はるつぼの底にくるようにしてください。小さなに膵臓を破壊するために迅速なシザー運動を続行個。組織片が小さいほど、より良いコラゲナーゼは動作します。 </li><li>最大10分間、200rpmで37℃に設定したウォーターバスシェーカーでのコラゲナーゼと場所を含むバイアルにHBSS +切り刻ま膵臓の1.5ミリリットルを追加します。最初の5分の間に、より頻繁に何度もチェックしないでください。消化時間は、組織の品質に依存し、わずか6と分で十分である。粒子が小さく均一である場合、エンドポイントである。 </li><li>コラゲナーゼ活性を停止するために冷たいHBSSでバイアル（10〜15 ml）を入力します。氷の上に置き、塊が10分のために解決することができます。しばしば、この時点で、いくつかの細胞死が発生し、DNAを、培地中に放出される。これは、メディア &#39;糸&#39;することができます。この場合には、溶液（10 mg / mlのストック）を100μlのDNaseを追加。 </li><li>シンチレーションバイアル内の組織は、10分間のセトリングした最上層オフ吸引は（7〜8ミリリットル）半分よりわずかに小さく、それを出た後。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す、5ミリリットルのHBSSを追加。 300×gで5分間遠心分離します。 </li><li> HBSSを吸引し、RPMI-1640、グルタマックス、10％正常ヒト血清（NHS）、10のHEPES pHは7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾンを含む5ミリリットル培地中の細胞を懸濁します。 60ミリメートルペトリ皿上のプレート。 β細胞を生成しようとしている研究者のため、メディアへのHGF（最終ミリリットル10 NGを/）を追加します。さらに、グループの数は、インクレチンホルモンGLP-1の培養培地を補充することも、β細胞28を増加させることを実証した。細胞はのICCを集約し、形成するために72時間、懸濁液中のままにしておきます。 </li><li> 29先に説明したように懸濁液中の72時間後、細胞はヒト細胞株HTB9マトリックスのマトリックス上に播種することができる。にかかわらず、成長条件の、メディアは48時間ごとに変更する必要があります。 </li></ol>浮遊培養のICCにおける内分泌細胞の増殖および成熟のマーカーの2。免疫蛍光、単層、あるいはガラスカバースリップ上<ol><li>細胞増殖を測定するために、懸濁液中の接着細胞または細胞のいずれかのBrdU標識の前PFA固定の12時間行われる。 BrdUの試薬は1:100 RPMI-1640中で滅菌フィルター、グルタマックス、10％のNHS、10mMのHEPES pH7.0の、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびファンギゾンを希釈する。 </li><li> 懸濁液中の細胞の場合：300 XGと吸引培養液で5分間遠心分離する。 300 XGと吸引で5分間、遠心分離器をICCを洗うために10mlのPBSを追加します。のICCは、パラフィンに埋め込 ​​まれるようにしようとしている場合、オプションのプロトコル3.1から3.17に従ってください。 接着細胞の場合：培養液を取り出し、上記のようにPBSで細胞を洗浄。 PBSで2回洗った後、室温で4％PFAで20分間細胞を固定。この時点で、プレートをパラフィルムで包むことができ、1週間まで4℃でPBS中に保存した。 </li><li> RTで10分間PBS中の0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートする。 2％（ないPBSで2回細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー適用NKEY血清、2％ウシ血清アルブミン、1時間、PBS）で希釈した50mMグリシン。 （バッファは1:10に希釈ブロックする）作業バッファで細胞を洗浄。作業バッファに抗体を希釈します。カバーガラス上で培養した細胞において、60μlの総容量で抗体を希釈する。 6ウェルディッシュ内の細胞のために、600μlの総容量で抗体を希釈する。複数のエピトープを染色するために、抗体のカクテルを適用してもよい。対照として、IgGのを使用するか、特定の抗体の代わりに免疫血清を事前。対照試料は、使用されている一次抗体と同じ種からの制御IgGと共にインキュベートしなければならない。 </li><li> 4℃で、室温またはO / Nで1.5時間のどちらか一次抗体をインキュベート一次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。 </li><li>アレクサ共役抗体について1:1,000 - ローダミンとFITC結合抗体について1:200、1:500で二次抗体を希釈します。これは、すべての二次抗体が軽い敏感であることに注意することが重要です。サンプルをカバーアルミホイルで信号の損失を防止する。室温で1時間インキュベートする。 オプション：核を可視化するために、DAPIは、二次インキュベーション中に1:500で添加することができる。これは全細胞集団におけるタンパク質発現の定量のために有用である。 </li><li>二次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。バッファに浸漬しながら、カバーガラス上で培養した細胞において、静かにピンセットでカバーグラスを持ち上げる。 PBSに浸漬することによって、それを洗う。 6ウェルプレートで増殖した細胞は、PBSで洗浄し、吸引するために追加します。この時点で、彼らは倒立顕微鏡下で検査する準備が整いました。 </li><li>過剰のPBSを取り除くためにキムワイプを軽くカバースリップの端をタッチします。スライドガラス上のマウントゲルのドロップを追加し、スライド上にカバースリップを反転する。吸引により過剰取り付けゲルを取り外します。気泡を除去するために200μlのピペットチップの裏で優しくカバースリップをタップします。 </li><li> 4℃で約20分間、又はO / Nで、室温での乾燥下で調べるとfluorescentまたは共焦点顕微鏡。 </li></ol>パラフィン包埋のICCからのタンパク質の3。（オプション）免疫蛍光染色<ol><li> 3％アガロース溶液を調製し、55〜60℃まで冷ます</li><li>室温で5分間、1,500×gでの15mlコニカルチューブに懸濁液中でインキュベートしたICC、遠心分離を転送する。 </li><li>細胞から培地を吸引除去し、室温で10分間、500μlの4％PFAで固定する。ペレットが非常に大きい場合を除き、ペレットを混ぜて使用しないでください。 </li><li> 750μlのPBSで2回ペレットを洗浄。 4％PFAと同様に、この廃棄物は、有害とみなされ、あなたの機関の有害廃棄物の仕様に従って廃棄しなければならない。 </li><li>静かに15ミリリットルコニカルチューブの壁の下のアガロースの150〜200μLを緩め、追加するために、細胞ペレットをフリック。 </li><li>優しくチューブをフリックで混ぜますが、気泡を形成しない。 </li><li> 5〜10分間、4℃で固化することができます。 </li><li>取り除くために、21 G針を使用して、新鮮な15ミリリットルコニカルチューブ内のペレットと場所。 </li><li>スライド上のパラフィン包埋切片の調製はミクロトームを使用してサイトにするか、コア顕微鏡施設で行うことができます。 </li><li>組織、水和物を脱パラフィンし、すぐに水で洗い流してください。 </li><li>残りのアルデヒドを急冷し、室温で30分間、0.2Mグリシンを追加します。 </li><li> 2分間ずつPBSで2回スライドを洗浄します。 </li><li>抗原回復のために、ホットプレート上で沸騰する10 mMのクエン酸緩衝液（6.0）を持参。それが戻って沸騰に来るのを待ち、15分間待機し、バッファ内のスライドを浸す。 </li><li>ホットプレートからビーカーを取り除きます。バッファに冷却するために、スライドは約40分待ちます。 </li><li> 1時間PBS中の2％正常ロバ血清でブロックし、5分間ずつPBSで2回スライドを洗浄、5分間ずつ、H 2 Oで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 0.2％トリトンX-100を含むワーキングバッファー中適切な濃度に希釈した一次抗体と共にインキュベートする。ホルモン、増殖マーカー、および/または分化のために染色した場合の転写因子および1.5時間染色した場合、一般的に、一次抗体を一晩インキュベートする。 </li><li>上記のステップ2.3から2.9に従ってください。 </li></ol>

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D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで紹介する方法は、ヒト胎児の膵臓からのICCを生成し、その後、細胞増殖および膵臓内胚葉のマーカーのイメージに1を有効にしてください。ヒト胎児膵臓解離のプロセスは、72時間ICCの形成期間、マウス由来β細胞前駆細胞を単離するプロトコールと実質的に異なるアプローチに続いて、約90分を要した。ここで紹介するプロトコルは、研究者は、ヒト胎児の膵臓の開発を探索することができ再現性のある方法を提供します。縦断的研究二つの異なるタイプを行うことができる。まず、異なる在胎齢から機能的膵細胞型（腺管細胞、外分泌細胞、およびホルモン陽性細胞）を生成する可能性は、移植後に評価することができる。第二に、単一の在胎齢からのICCは、選択された薬理学的薬剤で処理し、相違点を探索するICC培養中の異なる時点で移植し、培養で増殖させることができる細胞の運命にある。現在、インスリン産生細胞へのhESCの分化に向けられる多大な努力と、生理的刺激に応答してインスリン分泌に関連した問題を再度復活している。人間のICCは、胎児の膵臓の細胞増殖およびβ細胞開発のこの重要な側面を研究するユニークなモデル系を提供する。 組織から細胞を分離する任意のプロトコルと同様に、詳細が成功のために重要である。パラメータの数は、実験を行う実験者の制御外、残念ながらです。この研究室で発生した二つの問題は、貧しい人々の出発物質の質と非膵臓組織の送達を含む。健康な胎児の膵臓組織は、シザーカットする会社です。あまりにも簡単に組織をカットする場合は、膵臓の酵素が膵臓自体を消化し始めているという印である。このからのリカバリと準備最良のキャンセルされるが、残念ながらありません。まれに、中膵臓の除去、経験豊富な技術者が、膵臓のために腸の部分を混乱させます。これらのサンプルは、膵臓よりもはるかに弾性を有し、顕著なルーメンが存在するであろう。繰り返しますが、これらのサンプルは破棄されるべきである。 説明したように上記のプロトコルが続く場合、トラックからの分離をスローするように発生した問題はほとんどありません。円滑な分離を確保するために覚えておくべきいくつかのポイントは、正確な膵臓切断に鋭いハサミを使用するようにして消化するには大きすぎる任意の組織サンプルを残さないようにすることを確認し、含まれています。カットが十分に小さくない場合、コラゲナーゼを効果的に機能せず、いくつかのICCが形成されている。コラゲナーゼの新しいバッチを使用する際に消化のためIU（国際単位）は、以前に使用される場合には逆に、同じようなレベルで始まる。しかし、オーバー消化が生じないことを保証するためにインキュベーション時間を減少させる。このトラブルシューティング技法は、IUラベルがバッチからBAに大きく変化しないことが保証さTCH。 視点で撮影され、ヒト胎児のICCを単離するためのこの手法は、フィールドでは比較的標準です。ほとんどの研究室は、メディアへのHGFの添加は、細胞が33を生き残り、増殖するのに役立ちますことを我々の調査結果を確認した。要約すると、我々は9〜23週までの妊娠の年齢で、ヒト胎児のICC新鮮な膵臓を単離するための方法を開発した。細胞は、単層として又は膵臓内分泌転写因子およびヒトインスリンを視覚化する実験のための懸濁液中で増殖することができる。

1型糖尿病における細胞ベースのインスリン補充療法への主な制約は、移植のためのヒト膵島の不足である。インスリン欠乏状態の代謝要求を満たすインスリン産生細胞へのヒト膵臓前駆細胞の増殖および分化を調節する能力は、1型糖尿病を治療するための細胞ベースの治療のための重要なビルディングブロックのままである。 ヒトES細胞由来のインスリン産生細胞の出現までは、ヒト胎児の膵臓の内分泌細胞またはその前駆体は、臨床移植のための細胞の潜在的な源として見られていた。科学的、規制環境は、ここ数年の間に変更されましたが、ヒト胎児の膵臓の発達を理解するための重要な必要性が残っている。多くは現在、細胞を拡大するための効果的かつ安全な方法が確立された場合には低いが、これらの細胞の治療的使用可能性は、Ag、ヒト胎児細胞の治療的使用を視聴AINが検討される。そのヒト胎児膵臓細胞凝集塊（のICC）の試験管内変換におけるグルコース応答インスリン分泌内分泌細胞にあるまま大きなハードルは、現在、非効率的なプロセスである。多くの作業が終わっほぼ30年間解明および内分泌膵臓の発達に必要な転写因子の発現プロファイルを描写しているが、ギャップは、転写因子の時間的な発現が調節され、細胞機能に関連する方法に関する我々の知識に残っている。 ヒトES細胞由来のインスリン産生細胞の出現までは、ヒト胎児の膵臓の内分泌細胞またはその前駆体は、臨床移植のための細胞の潜在的な源として見られていた。科学的、規制環境は、ここ数年の間に変更されましたが、ヒト胎児の膵臓の発達を理解するための重要な必要性が残っている。多くは現在、しかし、効果的な場合には、可能性は低いとしてのヒト胎児細胞の治療的使用を表示細胞を拡大するための安全な方法が確立されたと、これらの細胞の治療的使用を再度検討することができた。そのヒト胎児膵臓細胞凝集塊（のICC）の試験管内変換におけるグルコース応答インスリン分泌内分泌細胞にあるまま大きなハードルは、現在、非効率的なプロセスである。多くの作業が終わっほぼ30年間解明および内分泌膵臓の発達に必要な転写因子の発現プロファイルを描写しているが、ギャップは、転写因子の時間的な発現が調節され、細胞機能に関連する方法に関する我々の知識に残っている。 最近、幹細胞のフィールドは、成熟内分泌細胞のマ​​ーカーを発現する細胞の産生を駆動するために膵島開発中に一時的な転写因子発現についての蓄積された知識を採用している。ヒトES細胞や人工多能性細胞（IPSC）からのインスリン産生細胞の起源はかなり作られたが-いわゆる「ブラックボックス2に続いて膵臓前駆体転写因子）移植後のin vivo成熟を ​​発現する細胞を生成するために、1）初期のインビトロ分化：過去数年間で大幅な進歩が、最も効果的なプロトコルは、2つの異なる分化段階を必要とする&quot;期間。前進するためには、 生体内で膵島成熟の基礎となる生物学の理解の進歩に関係なく、細胞源の、生化学的レベルで理解しなければならない。のICCとのhESCを用いて得られた結果との間の類似性は、 インビトロで成熟した、グルコース応答性インスリン分泌細胞へのヒト膵臓前駆細胞の転移を制御する重要な生化学的プロセスの数が不明のままであることを示唆している。この理解の中央部分は、膵臓前駆細胞から機能的内分泌細胞集団を導出するための新規な方法を開発することとしたhESCは、生化学APPRだけを必要とする成熟事象を解明oachesが、変化を分析するためのメソッド。 なぜ我々は、ヒト胎児膵臓細胞を画像化することは、島の成熟の変化を特定の重要な側面であると考えているのですか？その答えは、インスリン産生細胞を生成するために部分的に過去の探求である。膵臓の前駆体と小島のためのモデルおよび組織培養系の両方が、研究者は、in vitroで 、動物の島およびヒト膵島 ​​の成熟の間に存在する重要な相違を探索することができました。ヒト胎児の膵臓発生の調査に限界が合法的に使用することができる胎齢のみ不均一な細胞凝集物を生じさせることである。単離されたヒト胎児細胞は、膵島、染色は在胎齢9-23週のインビトロ培養後に15％未満では、ほとんどの細胞が膵島ホルモンを染色しないで、内分泌細胞のマーカーを含んでいるが明らかに似ている。しかし、移植後および中成熟体内、細胞の大多数は、内分泌マーカーを発現する6,25。これらの研究からの結果は、 インビトロ分化後のホルモン陽性細胞の集団を増強する。 インビトロ法は、おそらくin vivoでの膵島への洞察を提供する単一のホルモン陽性内分泌細胞の適度な集団を生成することができるのhESC分化プロトコールで、今日エコーされている成熟。さらに、ヒト胎児の膵臓の開発を推進する分子事象を理解することは可能性のhESCからのインスリン産生細胞を導出し、さらにβ細胞の再生および膵臓細胞の分化転換を制御するメカニズムを描写するための努力が改善されます。 ヒト胎児の膵臓細胞とhESCの成熟の間の類似性は、細胞機能に拡張することができる。マウス細胞と同様に、ヒト胎児細胞および分化したhESCの両方が、グルコースに反応してインスリンを放出することができない体外 26,27 における膵島新生た。しかし、ヌードマウスおよび成熟、両方の人間の膵島様クラスターとのhESC展示内分泌表現型から派生したインスリン産生細胞への移植の際に。三ヶ月移植後、人口のいずれかから移植された細胞のほぼ90％がインスリン陽性であり、C-ペプチド17,26の放出によって決定された正常に機能。これらの結果は、移植膵島成熟を促進コンテキストと正体不明の手がかりを提供することを示している。ヒト胎児膵臓細胞についてここで説明したような最適化された画像プロトコルは、変調の要因を特定し、成熟を加速するために、検索に役立ちます。開発のこの段階で内分泌系統に向かって分化させたヒト胎児膵臓細胞とヒトES細胞の基本的な生化学的探査は成熟の効率を測定するために不可欠である。 Figurに概要以下のプロトコル、E 1は、全体のヒト胎児膵臓およびこれらの細胞の画像化からのICCと呼ばれるヒト胎児膵臓細胞の単離のための私たちの現在の方法を提供する。このプロトコルは、その後、単層としてまたは懸濁液中で増殖することができる組織からの細胞の初期準備を必要とする。内分泌細胞の増殖および成熟の一般的に使用されるマーカーのイメージングのための細胞の調製が記載されている。 生成と画像のICCの化学修飾剤の様々な非存在下または存在下での移植モデルに比べ、迅速な方法を提供し、完全に機能する外分泌にヒト胎児膵臓細胞の成熟を加速させる培養条件および化合物を同定するのに役立つ、乳管、またはホルモン膵臓細胞を産生する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

ほぼ30年間にわたって、科学者たちは、ヒト胎児のICCは、ヌードマウスの腎臓被膜下に移植することを実証したグルコース刺激1-9以下のヒトC-ペプチドの循環の大幅な増加によって証明されるように、機能して内分泌細胞に成熟。しかし、in vitroで、ヒト胎児のICCからのインスリン産生細胞の起源は10低い。ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）を用いて行わ最近の実験を彷彿とさせる結果、1型糖尿病のための潜在的な治療上の処置として非常に有望で、細胞の再生可能エネルギー源。のICCのように、部分的に分化ヒトES細胞の移植は、グルコース応答、インスリン産生細胞を生成しますが、ヒトES細胞からのインスリン産生細胞の体外発生にそれほど堅牢11月17日です。内分泌前駆細胞の増殖および分化に影響を与える要因を完全に理解する可能性が高いのICCと彼の両方から生成されたデータが必要になりますサウスカロライナ州。多くのプロトコルは、 インビトロ 11月22日 、ICCを10,23,24のためのはるかに少ないEXIST にヒトES細胞からのインスリン産生細胞を生成するために存在している。その不一致の部分は、おそらく、ヒト胎児の膵臓での作業の難しさから来ている。その終わりに向かって、我々は、細胞増殖、膵臓マーカーと人間のホルモンの、12から23週までの妊娠年齢のヒト膵臓から胎児の膵島を分離するために既存の方法に構築単層としてまたは懸濁液中の細胞を成長し、画像を続けているグルカゴン及びC-ペプチドを含む。新鮮な組織6の移植によって得られたC-ペプチドレベルに類似しているヌードマウスの腎臓被膜下移植後のC-ペプチド放出をもたらすの下に記載されているプロトコルによって生成されたICC。ここに示す実施例は、膵臓内胚葉増殖およびβ細胞の発生時にフォーカスが、プロトコルは、膵臓の発達の他の側面を研究するために使用することができる、外分泌、乳管、および他のホルモン産生細胞を含む。

胎児のICCの入念な準備は、このプロトコルの成功に不可欠です。細胞は通常、めっき後に定義され期間を見て方法の代表写真を図2に示す。精製した後に、新たにメッキ細胞集合体は、少数の細胞（図2A）が含まれているような小さなスパース明確なクラスタを表示されます。最初の24時間（図2B）の後、細胞クラスターの多くは大きくなるが、多数の小さなクラスターが残る。 48時間では、クラスタは大幅に拡大したが、（図2C）、非対称のままきた。 72時間で、ICCは、サイズと形状が比較的均一（図2D）、明確にする必要があります。それは、細胞がいずれかのようなHTB-9、24時間前に、免疫蛍光、または遺伝子の発現を変化させることができる非存在下又は化学物質または薬物の存在下でさらに72時間増殖させた場合とマトリックス上に播種することができることをこの時点で膵内分泌細胞Gに必要なeneration。膵臓内胚葉に向けて、ICCの増殖や分化のいずれかを評価するために3ハイライト一般的に使用される抗体の数図 。 図3Aに、ICCをは、HTB-9上に播種した4日間増殖させ、そしてPDX1、膵臓の開発の重要なマーカーで染色した。のICC のin vitro染色は、我々の研究室で日常的に行っているが、より頻繁に、ヒト胎児のICCは、ヌードマウスの腎臓被膜下に移植し、増殖し、 生体内 6,9,30-32 で分化させる。移植後の特定の時間に、マウスを屠殺し、移植されたICCを含む腎臓を除去し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。シーケンシャル5μmの切片をミクロトームを使用してサイト上またはコア顕微鏡施設のいずれかによって生成されます。エピトープアンマスキングおよび免疫蛍光顕微鏡用のパラフィン包埋組織からのタンパク質の染色は選択議定書3.10から3に記載されている。。細胞増殖を評価するために、およびKi67（赤）で、17は図3Bにおいて、移植されたICCは、上皮細胞マーカーパンサイトケラチン（PanCK緑色）で染色した。別の例では、ヒトインスリン（緑）、グルカゴン（赤色）の両方を、ヌードマウス（図3C）の腎臓被膜下に移植し、成熟した後に検出された。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。免疫のためのヒト胎児のICCの準備と染色のフローチャートを。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。0での代表胎児のICCの準備、めっき後24、48、または72時間（A）のICC懸濁液は直ちにめっき後、（C）48時間後のめっき、または（D）72時間をメッキした後、（B）24時間後に、めっき後に画像化した。交流のためのスケールバー、10倍の倍率= 300ミクロン、D用のスケールバー=100μmの20倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> 図3のメッキのICCの免疫が日常的にICCを（a）は 、膵臓内胚葉マーカーPDX1（緑）、（B）の内分泌細胞（PAN-CK;緑色）のために画像化される。と増殖（Ki67の、赤）、（c）インスリン（緑）、グルカゴン（赤色）。交流のためのスケールバー、40倍の倍率=20μmである。

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Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K ビュー.  University of California, San Diego. 単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。 

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

ヒト膵島の染色プロトコル

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

医学

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

乳幼児の脳代謝と血行動態の非侵襲的光計測

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

瘢痕創傷修復のマウス胎児皮膚モデル

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

用語胎盤の胎児膜から主のひと脱落膜細胞の分離

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...