この仕事のための財政支援は、SIUCで全米科学財団、国立衛生研究所（NIH）、材料技術センター（MTC）やオルダを通じて提供されていました。我々は、FE-SEMの購入のための助成金（CHE-0959568）でNSFに感謝します。我々は有用な議論を教授マシュー·マッキャロルに感謝したいと思います。ジュリアレイエスは彼女の奨学金や財政支援のためにCOLCIENCIAS、コロンビア庁と大学Pedagogica Y Tecnologicaデコロンビアに感謝します。

PDAリポソーム4,5,6のA.合成とキャラクタリゼーション注1：すべての実験手順全体すべてのコンテナにラッピングアルミ箔を使用した光から、PDAソリューションを保護します。 注2：リポソーム溶液の2つの異なるセット（BとC）は、次の手順を実行して調製した携帯情報端末（PDAリポソームの合成とキャラクタリゼーション）。 1。 N-ヒドロキシスクDiacteylene（NHS-PCDA）の合成<ol><li>リポソームを調製するために、必須成分PCDA-NHSが必要です。我々は、以下の手順を使用して、PCDA-NHSを合成しました： </li><li> - （3 - （ジメチルアミノ）プロピル）-3 - エチルカルボジイミド塩酸塩（0.144グラム、0.713ミリモル10,12 - pentacosadiynoic酸（PCDA）（0.267グラム、0.713ミリモル）、N-ヒドロキシスクシンイミド（0.0914グラム、0.786 mmol）と1を追加）の乾燥CH 2 Cl 2中（20ミリリットル）。 </li><li> 2時間室温で溶液をかき混ぜる。 </li><li>慎重にrを用いて溶媒を除去otary蒸発器は、乾いた薄いフィルムを得た。 </li><li>ジエチルエーテル（25ml）と水（25ml）で3回洗浄残渣を抽出する分液ロートを使用します。 </li><li>半時間し、MgSO 4（1.0g）を有する有機層を乾燥させます。白色固体粉末（0.24グラム、&gt; 90％）を取得するために回転蒸発により溶剤をフィルタリングして削除します。 </li><li>核磁気共鳴（NMR）の下で最終化合物を分析します。 </li><li> 1 H NMR（300 MHzで、DMSO）δ（ppm）は：0.893（トン、3H）、1.268（M、26H）、1.512（メートル、4H）、1.754（メートル、2H）、2.252（トン、4H）、 2.365の（m、1H）、2.610（m、1H）【、2.842（S、2H）。 </li></ol> 2。リポソーム製剤5,6,7 <ol><li> PCDA-NHS：1,2 -ジミリストイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DMPC）:: 8：1：ジクロロメタン20mlで1 PCDAを溶かす。 </li><li>凝集物を除去するためのフィルター紙を使用してソリューションをフィルタリングします。 </li><li>モノマーの薄膜を得るために完全に溶媒を蒸発させる。 </li><li> vacの下で一晩薄い膜を乾燥uumで。 </li><li>ハイド所望の濃度（0.65から1 mM）のリポソーム溶液を作るために、脱イオン水（50ml）でフィルム。 </li><li> 76でプローブ音波処理により得られた懸濁液を超音波処理℃〜18分間。 </li><li>慎重に脂質凝集物を除去するために濾紙を通してソリューションを渡す</li><li> 4単量体の自己組織化を促進するために℃で一晩で溶液を冷却する。最終的な解決策は、光学的に透明であるべきである。 </li><li>空気中にペンレイUV源を（4.5 mW / cm 2）を使用して約2分間紫外線の254nmの照射により自己組織化ジアセチレンモノマー（リポソーム）重合する。 </li><li>リポソーム溶液は、少なくとも2週間室温で安定していた。時冷蔵ソリューションは、より安定していた。 </li></ol>ローダミンタグ付きウシ血清アルブミン（BSA-RH）修正PCDAリポソームのB.準備 1。リポソーム表面へのBSA-Rhの結合<ol><li> PBS BU内のBSA-Rhを溶かすffer（イオン濃度は0.01Mであった、pH7.2）を、BSA-ローダミン水溶液の1.210μMの最終濃度を作る。 </li><li>室温でステップA.2。（上記参照）で調製したリポソーム溶液10mlに、BSA-ローダミンの2ミリリットル（1.2μM）を追加します。 </li><li>タンパク質のリジン残基からNHS基により活性化されたカルボン酸へのアミン基の結合のための古典的な反応は、（ 図2の反応スキーム）に続いてきた。 NHS-PCDAは、NHS-アミン反応（ 図2、ステップ2）を用いてリポソームを用いた共有結合タンパク質分子のために（ 図2、ステップ1）に設計されました。 NHSは、順方向のアミンカルボン酸反応を駆動する優れ残しエージェントです。適切な条件の下でこの反応の収率は定量的であるべきである。 </li><li> フリーBSA-Rhの除去 ：脱イオンwに：スペクトラ/ポアバイオセルロースエステル（CE）膜（100,000 MW、C O）を浸し15分間ater。この膜は、脱イオン水で未反応のBSA-ローダミン（分子量〜66000 Da）の透析のために使用されます。 </li><li>透析膜への解決策を慎重に移す。 </li><li>透析中の2時間で水、8時間、14時間、24時間、および36時間に変更します。 </li><li>アルミ箔で覆われたバイアル中で最終的な解決策を収集します。 </li></ol> CでのSR-ジアミンの合成とビオチンタグ付きリポソーム 1。代わりに、ステップ2.1でDMPCを使用するのではなく、我々は、ビオチンタグ付き（を使用する1,2 - ジオレオイル-sn-グリセロ-3 - ホスホエタノールアミン-N-（ビオチニル）（ビオチン-DOPE）。 <ol><li> 2.2から2.9を介してすべての手順に従ってください。 </li><li>代わりに工程BにおけるBSA-Rhから、タグ付けSulphorhodamineを（SR-ジアミン）を使用します。 </li><li> B中のすべてのステップに従ってください</li><li>この調製品に含まれるリポソームは、ビオチンを含んでおり、その表面に、SR-ジアミン。その後の工程は一つの例外を除いて、AとB（上記参照）と同様であった：ストレプトsolutiに追加されましたFRET効率の変化を介してビオチン - ストレプトアビジン相互作用を調べるために。 </li></ol> D.描写結果<img alt="タイトル図" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> タイトル図。反応を説明する漫画とは、リポソーム表面に発生する処理（ステップBに従って調製）FRET。 用いてリポソームにタンパク質アタッチメントのA.モニタリング1 FRET のモニタリングは、ローダミンおよび工程Bで調製したリポソームのPDA間のFRET BSA-Rhの励起および発光スペクトルとPDAの吸収スペクトル（ 図3A）取られます。我々ははっきりと見ることができ、PDAの吸収スペクトルとBSA-RHと重なるの発光スペクトル。これは、FRETメカニズムの共振要件を満たします。重合前後のBSA-ローダミンタグ付きのリポソームは、UV-Vを使って分析したで、蛍光分光。隔離されたドナーとアクセプターのために、効率がドナー-アクセプターの距離（r）とJ1（J値）に大きく依存しているフレット。発光の消光が原因光重合後青PDAの電子吸収スペクトルの出現によるローダミンとPDA間のFRETの（ 図3B）が観察される。我々のケースでは、効率が可視領域の未重合リポソームのJ = 0のため、未重合リポソームおよびローダミンはゼロですフレット。 我々は、それらの表面にNHSを含んでいなかっただけのPDAリポソームと同様の実験を行った。これらのケースでは、BSA-RHは、リポソームの表面にタグ付けされていませんでした。その場合には、ローダミンやPDA（rの平均値 ）との間の平均距離は、フォースターの半径（R 0 = 2.8 nm）に比べてはるかに大きかった。したがって、私たちは、蛍光強度の大きな減少は見られなかった。この観察LSOは時rが&lt;2.8 nmの蛍光消光が支配的であることを示唆している。 JとR 0の値は、次式を用いて計算した：[1] J（λ）=∫F D（λ）はεA（λ）はλ4dλ R 0 = 0.211 [K 2 N -4 問D J（λ）] 1月6日 青PDAの吸光係数（ε）-1前ストレプトアビジンの添加に〜2000から10000 M -1 cmの範囲である。青PDAの吸光係数は、光重合条件に依存しています。 [2]例えば、εの値は、より長い時間を重合させたソリューションのために大きくなります。さらに、ジアセチレンモノマーの自己集合はまたε値に影響を与える可能性があります。 J calcul管理ポイントは、これらの変化を考慮に入れて、そして、彼らは、ビオチン-ストレプトアビジン分子の相互作用に起因するPDAの吸光係数の変動を反映していますJ値は実験的なPDAの吸収とSR-101の放射データを用いて計算されます。 J値の変化は、溶液（ 図4C）にストレプトアビジンを添加した後、PDAの電子吸収スペクトルのシフトに起因している。 J値の単位はM -1 cm -1で4 nmである。 のB.モニタリングは、ビオチンタグ付きリポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてFRET 注1：ローダミン、上記工程Cで調製したリポソームのPDA間のFRETのモニタリング。 Sulphorhodamineタグ付きの励起および発光スペクトルは、ジアミン（SR-ジアミン）とPDAの吸収スペクトル（ 図4A）取られます。未重合および重合ビオチンタグ付けされたリポソームは、紫外 - 可視用いて分析した及び蛍光分光。ローダミン（SR-101）の排出量は、FRETによる発光消光を示唆している（ 図4B）、重合後に約45％減少している。リポソーム溶液2mlにストレプトアビジン溶液40μlのアリコートを（1μM）を追加します。溶液へのストレプトアビジンを加えて、J値の変化は（ 図4C）が観察される。ビオチンは、ストレプトアビジン、PDAリポソーム（ 図1〜645 nmの中心）の青色のピーク強度に特異的に結合するように、（F igure 1S）が観察され、540nmの吸収ピークの増加は減少した。 図4Dは、FRETの変化を示したもので効率。ストレプトアビジンの濃度の増加とともに減少したFRET効率は、我々の予測と一致している。 ストレプトアビジンの各40μlのアリコートを添加した後、SRの排出を記録します。我々は、ストレプトを添加した後、ローダミン排出量の着実な増加を観察したアビジン（ 図5）。ローダミン排出の増加は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を以下sulphorhodamineの発光スペクトルとPDA吸光度スペクトルのJ値の低下によるものです。分子レベルでは、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用は、より熱力学的に安定な赤PDAの形2〜青PDAの形で減少し、その結果、PDAの有効共役長の微妙な変化につながる。これは、J値の変化の基礎となっています。興味深いことに、PDAのリポソームへの共有結合または非共有結合したビオチンの分子間相互作用の微妙な違いは、私たちのセンシングアッセイ4を使用して調べることができる。 我々はまた、対照実験を行ったとストレプトアビジン - ビオチンシステムのものと同じ実験条件下で対照試料の発光をモニターしています。対照実験は以下から成ります、その上に（1）に含まれるリポソームのソリューションは、ビオチン表面は同じボリュームと濃度の緩衝液を加え、（2）それらの表面上のビオチン受容なしリポソーム溶液を同じボリュームと濃度のストレプトアビジンを添加した。ストレプトアビジンを添加した後、ビオチンタグを付けたリポソーム溶液の強度が強化された強度を示したが、対照実験のリポソーム溶液の強度（例えば、 図2Sを参照してください）、その一方で、発光強度の減少を示した。これは、溶液の希釈に起因すると考えられる。これらの実験は、ソリューションの強化された排出量は、特定の分子間相互作用に起因することが示された。 ローダミンおよびPDAのペアのためのフォスター半径（R0）〜2.80 nmであることが（eq.2）が算出される。これは、rは 2.80 nmであるときに孤立したPDA-ローダミンペアについて、励起状態のローダミン分子の50％がPDAに転送し、そのエネルギーを持つことになります。 我OBS<html>ビオチンが共有結合のPDAバックボーンに接続されている場合、排出の増加はリポソームに非共有結合したビオチンのそれよりも2〜3倍大きいことerved。4これらの結果は、我々の提案するシステムが相互作用の微妙な違いを区別するために敏感であることを示唆しているリポソームに付着共有結合および非共有結合した受容体に起因する振動子（ビオチンとリポソーム二重層の間のリンカー）であった。分光光度計のスキャニングとデータ集録機能に応じて、タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングは（ミリ秒で秒単位まで）（UV-Vis分光法で）この感知システムで可能です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> 図1の青と赤のPDA溶液の吸収スペクトル。 （挿入図）光学顕微鏡写真は、デジタルカメラで撮影した。 グラム &quot;/&gt; PCDA-NHSの合成については、 図2。反応スキーム（ステップ1）。タンパク質のアミン置換基（ステップ2）にPCDA-NHSの反応。ステップ2 PCDAモノマーのカルボン酸へのタンパク質のリジン残基の結合の基礎である。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> 図3A。観測の変化は効率がPDAの吸収スペクトルの変化によるものであるFRET。重合前のBSA-Rhの排出とPDAの間で吸収が、FRETのための要件であるBSA-RH放出を伴う重合PDAの吸収が重なる後の重複はありません。ローダミンは、ドナー（赤）とアクセプター（青）として重合したPDAのリポソームの行為です。 <img alt="図3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> 図図3（b）前（青）とPCDA重合（赤）後、BSA-Rhのタグを付けたリポソームの蛍光スペクトルを示す。ローダミン排出量の大幅な減少は、ローダミンおよびPDAの間のFRETにより観察された。 <img alt="図4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> 。。図4Aのスペクトルの重なり（J）、PDA（青または赤）の吸収スペクトルとSulphorhodamineの発光スペクトル（オレンジ色）の変化を図4Aは、極端な条件のための代表的なスペクトルであるストレプト過剰の溶液に添加したときには、です。図4Aは、ストレプトアビジンの過剰の添加後ほぼ完全に青から赤PDAの変換を示しています。これは明らかに、J（スペクトルの重なり）はPDAの吸収スペクトルのブルーシフトに伴って増加することが分かる<img alt="図4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> 図4B。蛍光スペクトル前（青）と後の（rED）リポソーム重合。 <img alt="図4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> 図4C FRETの条件：。リポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてドナー（sulphorhodamine）とアクセプター（PDA）との間にJの変化。 <img alt="図4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> 図4Dは。リポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてドナー（sulphorhodamine）とアクセプター（PDA）の間の効率の変化をFRET。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> 図5のPDAリポソーム溶液にストレプトアビジンのアリコートを添加した後のローダミン発光スペクトル。挿入図は、SR-101スペクトルの放射の変化の大きなビューを示しています。

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	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

私たちは、NHS-アミン反応を用いてリポソーム表面にタンパク質のリジン残基の選択的な結合を行った。これは、ベースの方法は、リポソーム表面に結合するビオチン - ストレプトアビジン結合とタンパク質（BSA）のリアルタイムモニタリングを行うことが可能ですフレット。同様の手順は、それらの選択的受容体と様々なタンパク質相互作用の結合ダイナミクスを研究するために適用するこ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 10,12 - pentacosadiynoic酸（PCDA） </td><td> GFSの薬品</td><td> 3261 </td><td>光感受性</td></tr><tr><td> N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS） </td><td>アクロスの有機物</td><td> 157270250 </td><td>湿気に敏感</td></tr><tr><td> 1 - （3 - （ジメチルアミノ）プロピル）-3 - エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC） </td><td>ケム-IMPEX国際</td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 -ジミリストイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DMPC） </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td>ローダミンタグ付きウシ出願UMアルブミン（BSA-RH） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> （1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン-N-（ビオチニル）（ビオチン-DOPE） </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRETは、エネルギーは非放射長距離双極子-双極子相互作用を介して1基底状態の受容体分子に励起されたドナー分子から転写されるプロセスです。検体は、PDA 2,3,4,7に接続されている受容体と相互作用した後に、PDAのUV-Vis電子吸収スペクトルの青色シフト（ 図1）：本センシングアッセイでは、PDAの興味深い性質を利用しています。 PDAの吸収スペクトルにおけるこのシフトは、FRET効率の変化につながるのPDA（アクセプタ）とローダミン（ドナー）との間のスペクトルの重なりの変化（J）を提供しています。このように、分析対象物（リガンド）と受容体間の相互作用は、ドナーフルオロフォアおよびPDAの間のFRETで検出されます。特に、我々は、モデルタンパク質分子ストレプトアビジンの検出を示す。我々はまた、ウシ血清アルブミン（BSA）へのリポソーム表面の共有結合機構をFRETを示しています。 tとの間にこれらの相互作用彼重層リポソームとタンパク質分子をリアルタイムで感知することができる。提案手法は、小さな化学と大生化学分子を感知するための一般的な方法です。蛍光が測色よりも本質的に敏感であるので、アッセイの検出限界はサブナノモル範囲または下位8にすることができます。さらに、PDAは、複数のセンサがドナーとPDAリポソームの表面に付着している別の受容体と官能のPDA（アクセプター）を使用して開発することができることを意味FRETにおける普​​遍アクセプタとして作用することができる。

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

我々は、共役高分子ポリジアセチレン（PDA）およびフルオロフォアの生体分子の検出のためのPDAのリポソームの表面に付着した間のFRETを示しています。 PDAのリポソームはまた、プローブとして使用する生体分子のための彼らの表面上の受容体分子が含まれていました。リガンド - 受容体相互作用感知機構の基礎であり、フルオロフォアおよびPDA間でFRET効率の変化につながる。

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

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14.3K ビュー.  Southern Illinois University. 我々は、共役高分子ポリジアセチレン（PDA）およびフルオロフォアの生体分子の検出のためのPDAのリポソームの表面に付着した間のFRETを示しています。 PDAのリポソームはまた、プローブとして使用する生体分子のための彼らの表面上の受容体分子が含まれていました。リガンド - 受容体相互作用感知機構の基礎であり、フルオロフォアおよびPDA間でFRET?...

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

細胞毒性の継続とリアルタイム監視のための自律的に生物発光哺乳類細胞

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...