この作品は、米国癌学会（PF - 07 - 103 - 01 - CSM）、国立衛生研究所（R01 GM61275およびP30 CA042014）、白血病とリンパ腫協会、およびハンツマン癌財団によってサポートされていました。

siRNAのトランスフェクションと細胞調製<ol><li>使用される各ウェルにフィブロネクチン（10μg/mL）の0.5mLをを追加することで、4ウェルLabTek IIチャンバーカバーガラスを準備します。室温で10-15分間インキュベートします。 </li><li>製造業者の指示に従って、リバーストランスフェクションのためのsiRNA /リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen社）の複合体を準備します。 （100μL合計）使用されるチャンバーあたり24ウェルディッシュの1つのウェルの推奨額を使用してください。 siRNAのトランスフェクションのための類似の製品/プロトコルを代用することができます。 </li><li>チャンバーカバーガラスの井戸からフィブロネクチンを削除します。使用される各ウェルにsiRNAを/リポフェクタミンRNAiMAX複合体100μLを加える。 </li><li>よくトランスフェクション混合物を含んでいるあたり注し2万ヒストンH2B - mCherry -発現細胞（500μLで）。 </li><li>細胞は、通常の細胞培養の培地1mLのトランスフェクション混合物を交換する前〜24時間インキュベートすることができます。 </li><li>画像取得の前に細胞をさらに24時間インキュベートする（48時間トランスフェクション後）。 </li></ol>顕微鏡のセットアップと画像取得<ol start="7"><li>画像取得の設定に以下の3つの主要部分があります：1）顕微鏡のステージに収まる、37の定数湿潤環境を維持する細胞インキュベーター° C、および5％CO 2、2）自動化されたステージを装備した倒立顕微鏡、自動化された蛍光と明視野シャッター、および自動化されたフィルタホイール、とステージ、シャッター、フィルターホイールを統合して制御する3）ソフトウェアパッケージ。私たちのイメージングセットアップでは、我々はLabTek IIチャンバーカバーガラスで使用できるOKOラボからカスタマイズしたセルにインキュベーターを使用してください。ステージ、シャッター、フィルターホイールは、Metamorphソフトウェアによって制御されていますヒント：OKOラボステージトップインキュベーターシステムが異なるプレート、皿、またはカバースリップの様々なサイズのためのアダプタも用意しています。 </li><li> 、予め温めておいたと平衡化インキュベーターの蓋を開けるアダプタにチャンバーカバーガラスを置き、粘土で固定保持することによってインキュベーターでLabTek IIチャンバーカバーガラス位置。細胞培養の培地が乾燥しないように、チャンバーカバーガラスでカバーしておきます。蓋を閉じて、インキュベーターがその場でしっかりと保持されていることを確認し、顕微鏡のステージ上で全体のインキュベーターを置きます。 </li><li> Metamorphを使用して、ソフトウェアのメニューバーで&quot;アプリ/多次元取得&quot;を選択して、実験を設定する。これは、場合（各色（複数の設定を行う場合）、数とステージの位置の場所のための露光時間は、タイムラプスの頻度と長さを選択できるウィンドウを立ち上げ、およびzのセクションの数になります希望する）。データファイルの保存先を選択ヒント：。Metamorph以外のソフトウェアを使用している場合、機能が多少異なる場合がありますが、全体的なコンセプトは同じです。 Micromanager、ほとんどのハードウェアのセットアップと互換性のあるオープンソースのImageJをベース集録ソフトウェアは、優れた代替手段です。 </li><li>このプロトコルの目的のために、我々は、15段階の位置で8時間の2つの波長（明視野とmCherry）15分ごとで画像を取得しますヒント：より良い時間分解能が必要な場合は、その後、買収の時間間隔を短くすることができますが 。 、少ないステージの位置を使用することができ、より少ない有糸分裂細胞は、分析のために利用できるようになります。時間間隔を考慮フィルタセットを切り替えるためにフィルタホイールに必要な時間を取ることを検討する際には重要です。 </li><li>第一明視野照明を用いて細胞の分野に焦点を当て、それぞれの波長に最適な露光時間を決定します。ソフトウェアでは、唯一の明視野チャネル（これはそれぞれの買収の前に各段階の位置でオートフォーカスにソフトウェアを許可する）ためのオートフォーカス機能を調整するヒント：私たちは石油を必要とせずに優れた分解能を与えるために40倍乾燥した位相コントラストの目標を使用。他の目的は、所望の光学解像度に応じて使用することができます。 </li><li> mCherryの波長に切り替えて、50ミリ秒の露出を使用してイメージをはめ込みます。良いイメージを表示するために必要な最小限に露光時間を調整します。それは、持続的な細胞の生存を確保するための露光量を制限することが不可欠です。原則として、これは最高の照明強度を増加させることによってではなく、NDフィルター（励起光の束を低減する）と長く、カメラの露光時間を使用することによって達成することができます。使用するのに、これ以外の波長に対して、この手順を繰り返しますヒント：テスト用の所定の露出で、長期的な細胞の生存を決定するには、一時的に割り当てられたタイムポイントの間隔を調整することによって所望のタイムラプス以上の細胞が生き残ることができる画像の総数をプレビューすることができます秒〜数分から（つまり、10分は10秒になります）。あなたの細胞は100〜200のエクスポージャー（または存続する場合適切な番号）、次にあなたの露出は結構です。されていない場合は、完全な実験をシミュレートするために励起光、露光時間、または画像の総数を減らすことができます。 </li><li>次に、選択して、細胞集団の適切なサンプリングを実現できるように、ステージの位置の適切な数をマーク。 Metamorphの位置を記録し、それぞれの取得のためにそこに返されますヒント：私は一般的に彼らはあまりにも密であることを非常に多くのたくさんの細胞が画像に存在する位置を探してみる、ではなく。また、有糸分裂を介して進行する多数の細胞を観察する良い機会を持つように十分なポジションを選択することが重要です。 </li><li>すべてのタイムラプス、波長の露光時間、およびステージの位置情報が記録された後、ソフトウェアが適切に機器を制御しているかどうかを判断するために、画面上の&quot;プレビュー&quot;ボタンを選択します。 </li><li>あなたが満足されれば、買収を開始する画面上の&quot;取得&quot;ボタンを選択します。その後、後ろに座るとコンピュータとの作業を行うために顕微鏡を許可するヒントは：。そのすべてが正常に機能していることを確認するために買収の少なくとも一つの完全なラウンドを通して自動化を守ってください。 </li></ol>画像処理と解析<ol start="16"><li>買収が完了したら、次のステップは、より扱いやすい形式に画像データを転送することです。このプロトコルの目的のために、私は、ImageJのプログラムを使用してイメージのモンタージュを生成する方法をし、Metamorphを使って動画を生成する方法を第一のデモンストレーションを行います。どちらの形式では、定量化のために有効になります。 </li><li>最初のステップは、データを確認することです。そのためには、メニューバーの&quot;アプリ/レビュー多次元データ&quot;を選択してください。あなたのファイルの場所を選択して、&quot;View&quot;を選択します。これは、個別に各ステージの位置から画像のスタックを見ることができるようになります。希望するステージの位置を選択し、&quot;画像のロード&quot;。あなたは、データフレームごとを通して進めることができるようになります。 </li><li>細胞が有糸分裂を通過するもののステージの位置（としてのDNAと細胞形態の両方によって決定される）については、Metamorphを使って映画やモンタージュを作る、またはそのようなImageJは（NIHを通じて無料で入手可能）などの他のプログラムとすることができます。 </li><li> Metamorphの映画を制作するには、メニューバーの&quot;プロセス/保存ムービー&quot;を選択します。あなたは、どの使用するフレームは、速度、およびムービーのファイルタイプを選択することができます。その後、&quot;ムービーの保存&quot;を選択します。 </li><li>モンタージュを作るために、私はこのようなImageJのような他のプログラムで使用することができます。STKファイルとして画像のスタックを保存します。 </li><li> ImageJのでファイルを開き、有糸分裂を通過するセルが見つかるまで、フレームを進める。細胞の周りをトリミングし、&quot;イメージ/重複&quot;を選択ヒント：すべてのフレームを複製することを確認してください。 </li><li>モンタージュを作成するには、&quot;イメージ/スタックを/モンタージュを作成&quot;を選択メニューバーで。ここには、モンタージュの大きさと形状を含むようにするフレームを指定することができ、フレーム間の境界を求めているかどうか。これらを選択し、&quot;正常（Okay）&quot;ヒット。 。。tifファイルとしてモンタージュを保存し、ImageJのまたはAdobe Photoshopのいずれかで、それ以降の処理を行うヒント：簡単に画像処理のために8ビットフォーマットにMetamorphで使用される16ビット形式からモンタージュファイルを変更します。 </li><li>有糸分裂の各段階で時間を計算するには、染色体が赤道（前期/前中期の時間）、フレームで整列されるまで、染色体が分離し始めるまでのt = 0（DNAの凝縮や細胞の丸めの最初の兆候）、フレーム数をカウント決定（中期の時間）、およびフレームの細胞が平坦化し始めるまで（後期/終期/細胞質分裂）。それぞれの有糸分裂の段階で計算された時間は、各フレーム間の時間間隔に依存します。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> 図1は、ヒストンH2B - mCherryを発現するHeLa細胞株を使用する典型的なコントロールsiRNAのトランスフェクション実験の結果を示しています。この方法は、有糸分裂後期1のタイミングでヌクレオポリンNup153のための予想外の役割を明らかに、有糸分裂のタイミングを定量化するために効果的に使用されています。してください<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。

<ol>
	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

イメージングと蛍光タンパク質技術の最近の進歩と、ライブイメージングは、細胞の解析2のルーチン課題となっています。 GFPの様々な（と他のカラーバリエーション3）-タグタンパク質は、広く利用可能かを構築することが比較的容易であり、DNA /染色体ダイナミクス4、5、中心体の複製6、サイクリンBダイナミクスを含む細胞分裂の特徴の数を追跡するために使用することができます7、核膜の破壊と再構築8、9、有糸分裂紡錘体の形成10、および細胞質分裂11のさまざまな段階。蛍光標識の励起/発光スペクトルは互換性があるときにタグ付けされたタンパク質は、特定のイベント間の連携が評価できるように、単独でまたは組み合わせて使用​​することができる。大きく空間的および/または時間分解能は/必要な場合は、共焦点レーザー走査、回転するディスク、または共鳴スキャンを使用することができるかどうかを顕微鏡、とますます解像度で洗練された顕微鏡のオプションのリストは増え続けています。哺乳動物細胞における有糸分裂のライブイメージングは、ハイスループットRNAiと小分子の画面12から14に使うために改変されています。従って、この技法を使用して1つの初期の実験は、比較的単純かもしれないが、この戦略の構築の可能性は広範囲です。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

有糸分裂中に発生する細胞の組織と染色体ダイナミクスの変化をしっかりとゲノムと細胞内含有量の正確な継承を確実にするために調整されます。このような染色体の運動として有糸分裂の特徴的なイベントは、、容易に特定のGFPタグ融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞株のタイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、個々のセルごとに追跡することができます。 RNAiベースの枯渇と組み合わせることで、これは特定のタンパク質のレベルが低下した後に不具合が発生した有糸分裂の段階を特定するための強力な方法（複数可）することができます。このプロトコルでは、我々は有糸分裂のタイミングで潜在的な有糸分裂の調節タンパク質を破壊する効果を評価するための基本的な手法を提案する。細胞は、siRNAでトランスフェクトステージ上のインキュベーションチャンバー内に置き、そして自動化された蛍光顕微鏡を用いて画像化している。我々はどのように静止画のモンタージュや映画のどちらかを作るためにイメージシーケンスを処理するためにタイムラプス実験を、セットアップするためのソフトウェアを使用する方法について説明し、定量化し、発現する細胞ラインを用いて有糸分裂段階のタイミングを分析する方法mCherryをヒストンH2Bをタグ付け。最後に、我々は、タイムラプス実験を設計するための重要な考慮事項について説明します。この戦略は、他のアプローチを補完するものであり、薬物療法を用いて細胞周期を同期させることなく、有糸分裂の人口と2）の解析などの細胞を見たときに観察されていない可能性があります動態の変化に）の感度を1の利点を提供しています。このようなイメージング実験から視覚情報だけでなく、有糸分裂のサブステージを評価することができます、だけでなく、FACSによる細胞周期の解析から明らかではないと予想外の洞察を提供することができます。

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

ここでは、画像への基本的なプロトコルを記述し、siRNAのトランスフェクション後のライブ哺乳類の組織培養細胞の有糸分裂のタイミングを定量化する。

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K ビュー.  University of Utah. ここでは、画像への基本的なプロトコルを記述し、siRNAのトランスフェクション後のライブ哺乳類の組織培養細胞の有糸分裂のタイミングを定量化する。

ビデオ: Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...