この作品は、マックスプランク協会によってサポートされていました。

プラスミドの1。作成<ol><li> （ 図1）標準的な分子生物学技術を使用して、両方をpLucおよびpYFPベクターに関心対象の各タンパク質のためのcDNAをサブクローニングする。詳細なプロトコルのためにGreen ら 13を参照してください。 </li><li>シーケンスは、すべての目的のタンパク質が介在終止コドンとリュック/ YFPの配列とインフレームであることを確認するために構築します。 </li><li>所望の融合タンパク質は、生物学的活性を保持することを確認するための機能的アッセイを行う。ここに提示された場合にYFP融合タンパク質の細胞内局在を、蛍光顕微鏡により確認した。 </li><li> pLucをとpYFP発現ベクターに関連する標的化シグナルを操作することによって、適切なリュックとYFP制御タンパク質の発現プラスミドを作成します。ここで紹介する場合、pLucをしてpYFPベクターに核移行シグナルを挿入することにより、核標的リュックとYFPの構造を生成します。 </li><li>作るLucおよびYFPは、単一のポリペプチドに融合された陽性対照構築物。ここに提示された場合に、YFPをコードする配列はpLucをベクターに挿入された陽性対照を生成する。 </li><li>トランスフェクション混合物にDNAの質量を等しくするために使用される中性フィラープラスミドを選択する。全く真核生物プロモーターを持っていないため、このような細菌のクローニングベクターのような哺乳動物細胞における転写的に不活性になるプラスミドを使用してください。 </li></ol> DNAミックスの2。準備<ol><li> 260 nmの吸光度に基づいて、セクション1に記載されている全てのプラスミドの濃度を推定（1吸光度単位は、50μgのDNA / mlのと同じです）。 650ダによって塩基対の数を乗じて各プラスミドの分子量を決定します。各プラスミド調製物のモル濃度を計算するために濃度および分子量を使用する。 36 nMでの濃度のプラスミドDNA調製物を希釈する。これらは、ワーキングストックになりますすなわち、トランスフェクションのためのDNAミックスを調製するために使用される。 </li><li>水20μlの最終体積中に、フィラープラスミドの1800 NGを含むコントロールDNAミックスを調製する。 </li><li> pLucを制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。 </li><li> pLucを制御コンストラクトの5μLとpYFP制御コンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。 </li><li>ポジティブコントロールコンストラクトの5μLを含むコントロールDNAミックスを調製する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。 </li><li>以下のDNAは、目的のタンパク質のホモ二量体化をテストするためにミックスの準備、各DNAミックスXを、関連pLucを5μlの構築Pyとの5μLを組み合わせるFPは構築。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。 A）pLucを制御し、pYFP-X B）をpLuc-XおよびpYFP制御 C）をpLuc-XおよびpYFP-X </li><li>以下のDNAは、目的のタンパク質のペアの間の相互作用をテストするためにミックスの準備、XおよびYは、それぞれのDNA混合物に関連しpLucをコンストラクトの5μLを組み合わせ、pYFP5μlを構築する。 1800 NGに全DNA質量を持って来るためにフィラープラスミドを追加します。 20μlの最終容量を持って来るために水を加える。 A）pLucを制御し、pYFP-X B）をpLuc-XおよびpYFP制御 C）をpLuc制御とpYFP-Y D）をpLuc-YとpYFP制御 E）をpLuc-XおよびpYFP-Y F）をpLuc-YとpYFP-X </li></ol> 3。トランスフェクション<ol><li>収穫は75cm 2のフラスコからのHEK293細胞をサブコンフルエント。培地13mlの中に全細胞の10％に希釈する。白の各ウェルに細胞懸濁液130μLを分注透明な96ウェル組織培養プレート底。 24時間培養細胞。 </li><li> 3によりDNAミックスの数を乗算することによってトランスフェクトするウェルの数を計算する。室温まで無血清培地をもたらす。無血清培地の6.3μLおよびウェルあたり0.18μlのトランスフェクション試薬を含むマスターミックスを調製する。ボルテックスで混合し、5分間室温でインキュベートする。 </li><li>無血清培地/トランスフェクション試薬マスターミックス20μlにDNA混合物の2液を添加することにより、トランスフェクションミックスを準備します。ボルテックスを行います。 10分間室温でインキュベートする。 </li><li>ウェルあたりトランスフェクション混合物の6.5μ​​Lを分注、各トランスフェクション混合物を3つのウェルをトランスフェクト。さらに36〜48時間の培養細胞。 </li></ol> BRET信号の4。測定<ol><li>ボルテックスによりDMSO中34 mg / mlので生細胞のルシフェラーゼ基質を溶解。 </li><li>基質希釈媒体pで1:1,000に再構成された生細胞のルシフェラーゼ基質を希釈37℃まで再加温しウェル当たり基質希釈50μlの培地を許可します。ミックスする渦。沈殿物が生じることがありますが、アッセイを妨害しません。 </li><li> 96ウェルプレートから培地を吸引する。各ウェルに希釈した生細胞のルシフェラーゼ基質を50μlを分注する。少なくとも2時間培養細胞（24時間まで）。 </li><li> 96ウェルプレートからリッドを外し、内部照度計、室温で10分間、プレートをインキュベートする。 </li><li>よく一度にリュックとYFP 1からの発光を測定します。長い470ナノメートル未満の波長を遮断するフィルタを用いて、リュックからの発光を測定します。 500〜600nmのバンドパスフィルタを用いてYFPから発光を測定する。 10秒かけて発光信号を統合します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからリュックエミッションの測定値を平均。バックグラウンドを差し引いたリュック放射値を生成するために、他のすべてのリュック発光読み取り値からこの値を差し引く。</li><li>唯一のフィラープラスミドを受けた3つのウェルからYFP発光測定値を平均する。バックグラウンドを差し引いたYFP発光の値を生成するために、他のすべてのYFP発光測定値からこの値を差し引く。 </li><li>各ウェルには、補正前のBRET比を与えるためにバックグラウンドを差し引いたリュックエミッション値によりバックグラウンドを差し引いたYFP発光値を分割します。 </li><li>唯一pLucを、対照プラスミドでトランスフェクトされた3つのウェルからの未補正BRET比を平均する。修正さBRET比を与えるために、他のすべての未修正のBRET比から、この値を引きます。 </li><li>補正されたBRET比の残りの組のそれぞれについて、最終的なBRET比を得るために3つのトランスフェクトされたウェルからの値を平均する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

融合タンパク質発現構築物の設計は、BRETアッセイをセットアップする際の重要なステップである。ここに提示される実験では、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼまたはYFPのC末端に融合させた。それは、ルシフェラーゼ/ YFPのN末端にタンパク質を融合させることも可能であるし、必要であり得る。いくつかのタンパク質は、融合物は、タンパク質の構造および機能の破壊を回避するため?...

ヒトの疾患の両方の古典的な結合および次世代シーケンス解析は、生物学的経路の範囲に関与するタンパク質の臨床的関連性を明らかにしている。なお、従来、このような研究におけるそれらの同定のために、これらのタンパク質の生物学的役割のほとんど又は全く検討があったことがよくある。目的のタンパク質の生物学的機能を探索を開始する一つの実りアベニューは、その生理的な文脈でと対話する他のどのタンパク質を特定することです。このように、分子ネットワークを特徴づけることは、人間の表現型の根底にある生物学的経路への洞察を提供しています。 最も頻繁に使用される大規模スクリーニングは、目的のタンパク質のための候補相互作用パートナーを同定するためのアプローチは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング1及び質量分析に基づくプロテオミクス2である。これらのメソッドは、潜在的な相互作用するタンパク質を示唆している中で、非常に成功したが、arはでき偽陽性の結果を受けやすいE。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析スクリーニングによって同定相互作用の確認は、第二の技術を用いて相互作用の検証を必要とする。典型的には、共免疫沈降、またはプルダウンアッセイは、この目的のために使用される3。検証のためにそのような技術を使用する1つの欠点は、特定のタンパク質相互作用を維持するために必須であり得る細胞内条件を破壊し、細胞溶解のための要件である。第2の欠点は、弱いかまたは一過性のタンパク質相互作用は、洗浄工程中に破壊され得ることである。さらに、これらのアッセイは、重要な実践的な時間を要求を同時に処理することができるサンプルの数が制限され、多くの場合、試薬およびプロトコルの時間のかかる最適化を必要とする。 共免疫沈降実験に関連する問題のいくつかを克服するために、いくつかのアッセイは、蛍光及びbiolumに基づいて開発されている生細胞において使用することができるinescentタンパク質。最初のそのようなアッセイは、蛍光（又はフェルスター）共鳴エネルギー移動（FRET）、重複する発光および励起スペクトルを持つ4つの蛍光タンパク質間のエネルギーの非放射伝達に基づいた。エネルギー移動の効率は、従って、FRET現象の観察は、ドナーとアクセプターフルオロフォアが近接している必要があり、強く、距離依存性である。とアクセプター蛍光（一般的に黄色蛍光タンパク質、YFP）との融合のような第2、関心のある2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質は、ドナー·フルオロ（CFP一般シアン蛍光タンパク質）との融合体として発現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、CFPドナーにYFPアクセプターの位置からの発光の測定可能な増加をもたらすであろう、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターフルオロフォアをもたらすことができる。 FRETは、生きた細胞中4タンパク質-タンパク質相互作用を検出することに成功している。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためにFRETを使用することの主な欠点は、ドナーフルオロフォアの励起に外部照明のための要件である。発光信号、アクセプターの不必要な励起、およびドナーとアクセプターフルオロフォアの両方の光退色の高いバックグラウンドで外部照明の結果。これらの効果は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するためのアッセイの感度を低下させる。 外部照明から高バックグラウンドの問題を克服するFRETアッセイの修飾は、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）アッセイ5,6である。 BRETシステムにおいて、ドナーフルオロフォアは、ルシフェラーゼ酵素により置換されている。こうして、アクセプターフルオロフォアの励起にエネルギーが不要な外部照明をレンダリングする、ルシフェラーゼ基質を酸化することにより、システム内で生成される。ほとんどのこのアッセイの一般的な構成は、ドナーはウミがルシフェラーゼウミとアクセプターが（代替供与体および受容体タンパク質の議論のためにフレら 5参照 ）YFPである。したがって、このシステムでは、目的のタンパク質は、ルシフェラーゼおよび潜在的に相互作用タンパク質YFPへ、またはその逆に融合される。 BRETアッセイは、ルシフェラーゼの基質としてセレンテラジンを追加する必要があります。セレンテラジンは細胞透過性であるため、生細胞におけるBRETアッセイを行うことができる。しかしながら、天然のセレンテラジンは、水溶液中で不安定であり、セレンテラジン両方の酵素非依存性分解アッセイのために利用可能な基質の濃度を減少させ、自己発光を生成し、ルシフェラーゼ活性の測定の感度を減少させる。生細胞におけるBRETの使用は、水溶液中で安定である保護されたセレンテラジンの開発によって促進されたが、細胞質ゾルエステラーゼによって切断されるセル7内活性セレンテラジンを生成するために、細胞膜を横切って拡散後sである。 ルシフェラーゼおよびYFP融合タンパク質を発現する細胞への基質の添加後、タンパク質 - タンパク質相互作用から生じるエネルギー移動をルシフェラーゼおよびYFPからの発光をモニターすることにより定​​量化される。タンパク質相互作用は、マルチウェルプレート中の生細胞内で直接監視することができるので、BRETアッセイ法は、費用及び​​時間効率的である推定上の相互作用を検証するための簡単​​な、スケーラブルな方法を構成する。 プロテオームスクリーニング研究で同定された推定インタラクターを検証することに加えて、BRETシステムはまた、目的のタンパク質上の従来の生化学的および構造的研究から生じる相互作用物質候補を試験するために使用することができる。タンパク質 - タンパク質相互作用の存在は（BRETアッセイを使用して、または他の技術のいずれかによって）確立されると、emp表であるとBRETアッセイの可能性がある相互作用を特徴づけるために、さらにloyed。例えば、相互作用領域はタンパク質の切断型を生成することによってマッピングすることができ、相互作用における特定の残基の関与は、点突然変異を作成することによって実証することができる。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾、または（例えば、薬物またはリガンドなど）の小分子調節効果は8-10を調査することができる。 BRETアッセイはまた、患者のDNAで同定された変異を調査するための大きな可能性を秘めている。突然変異の原因の役割がBRETを用いたタンパク質-タンパク質相互作用に対する変異の効果を研究、確立されているケースでは、表現型11の分子病因についての詳細を公開してもよい。次世代シークエンシング方法の登場以来、それがRELEある不明確である場合には、個体内で識別することには、いくつかの潜在的に損傷を与える変異は、ますます一般的である表現型〜12 vant。この状況では、BRETアッセイは、タンパク質の機能およびその障害のゆえの関連性に対する変異の影響を評価する上で貴重であり得る。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）に基づくアッセイは、生細胞におけるタンパク質 - タンパク質相互作用をモニターするための高感度で信頼性の高い手段を提供する。 BRETは「アクセプター」蛍光タンパク質への「ドナー」ルシフェラーゼ酵素からのエネルギーの非放射伝達である。このアッセイの最も一般的な構成では、ドナーはウミレニフォルミスルシフェラーゼであるとアクセプターは、黄色蛍光タンパク質（YFP）である。エネルギー移動の効率を強く距離依存なので、BRET現象の観察は、ドナーとアクセプターが近接にあることを必要とする。培養哺乳動物細胞中の目的の2つのタンパク質間の相互作用をテストするために、一つのタンパク質をルシフェラーゼとの融合とYFPとの融合としての第2のように表現されている。関心のある2つのタンパク質間の相互作用は、エネルギー移動が起こるのに十分に近いドナーおよびアクセプターをもたらすことができる。タンパク質 - タンパク質を調査するための他の技術と比較してteractionsは、BRETアッセイは敏感であり、少しのハンズオン時間といくつかの試薬を必要とし、弱い一過性の、または、生細胞内で見つかった生化学的環境に依存している相互作用を検出することができます。従って、酵母ツーハイブリッドまたは質量分析プロテオミクス研究によって示唆され、推定上の相互作用を確認するための理想的なアプローチであり、加えて、タンパク質 - タンパク質相互作用に対する翻訳後修飾の効果を評価する、マッピング相互作用する領域に適していて、患者のDNAで同定された変異の影響を評価する。

BRETアッセイの原理は、 図2に示されている。ここに提示される実験の全体にわたって使用されるアッセイのセットアップを図3に示されている。ルシフェラーゼ-YFP融合タンパク質をトランスフェクトした細胞からの強いBRET信号の検出は、エネルギー移動が観測できたことが確認されこの実験において（ 図4）。 我々の研究は、脳の?...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K ビュー.  Max Planck Institute for Psycholinguistics. タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。 

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Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

生物学

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...