制服サービス大学の学内プログラムによって資金を供給。

1。新生仔ラットの脳組織の解剖<ol><li>チルリーボビッツのL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）に4℃暖かい培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）37℃氷の上でエアコンL-15メディアの4-5 mlの4 60X15ミリメートルのペトリ皿を準備します。 100％エタノールを持つすべての手術器具を滅菌する。 </li><li> 70％エタノールでP2新生児ラップ子犬をすすぎます。 （P1-P5歳新生児仔ラットは、このプロトコルで使用することができます。） </li><li>迅速に滅菌鋭いハサミで子犬ラットを刎ねると、70％エタノールにすぐに頭をドロップします。 5仔ラットの合計繰り返した後食塩水に頭を転送します。 </li><li>氷上で5ミリリットルL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％ペン/連鎖球菌） - 4のペトリ皿に頭と場所から全体の頭脳を削除します。 </li><li> 1.4リットルの残りの子犬のために - 手順1.2を繰り返します。 </li><li>脳から髄膜を除去し、DESを転送氷の上でL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlの新しいペトリ皿に赤外LEDの脳組織（ すなわち 、大脳皮質、小脳、全脳、など）。 </li></ol> 2。混合グリア細胞集団の準備<ol><li>ハサミや刃で脳組織を損傷することなく、滅菌50 mlコニカルチューブに10 mlのピ​​ペットで組織を転送します。 </li><li> 4℃で5分間2500 RCFで円錐形の遠心</li><li>上清を吸引除去する。新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlを追加します。 </li><li>滅菌した10 mlのピ​​ペットでピペットは、組織の上下に10回。 </li><li>新鮮な50 mlコニカルチューブにセルストレーナー（100μm以下の細孔）を配置します。上下にピペット組織は一度滅菌5mlのピペットを用いて、セルのストレーナーにフラッシュピペットを用いて、コニカルチューブに細胞ストレーナーを通して材料を分配する。 </li><li>新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BS 4-5 mlのセルストレーナーを洗浄します+ 1％のペン/連鎖球菌）。 </li><li> 4℃で5分間で2,500 RCFで緊張した細胞と円錐形の遠心分離</li></ol> 3。混合グリア細胞培養のメッキとメンテナンス<ol><li>処理された各ラット子犬の脳については、各フラスコに培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）の12 mlを加えて1滅菌T-75フラスコを準備します。 </li><li>ペレット化した細胞からの上清を吸引除去し、細胞ペレットに培地の5-6 mlを加える。 10 mlのピ​​ペットで10回ピペッティングします。 </li><li>それぞれのT-75フラスコに細胞懸濁液の等量を転送します。 </li><li> 1-3週間の合計で37℃5％CO 2インキュベーター内でフラスコをインキュベートします。 </li><li>フラスコは、最初の5日間インキュベートし、5日目に、新鮮な培地12 mlを各フラスコに培地を交換し、インキュベーターに戻す必要があります。その後、3日ごとに、合流を達成するために新鮮な培地を12 mlの各フラスコ内の培地を交換してください。これは何されている必要があり細胞が付着フラスコの底に触れることなく、非常に慎重にね。 </li></ol> 4。プライマリミクログリアの分離とめっき<ol><li>混合グリア培養が完全にコンフルエントになったら、インキュベーターからフラスコを削除し、環境大気とのガス交換を防ぐためパラフィルムでフラスコのキャップをカバーしています。 </li><li> 37℃で1時間に100 RPS（ラボコンパニオンSI-600、Jeioテック）でフラスコを振る℃に</li><li>フラスコ表面に星状膠細胞層を中断せずに10 mlのピ​​ペットを用いてすべてのフラスコから培地を収集します。 50 mlコニカルチューブにメディアを配置します。インキュベーターにフラスコと戻りフラスコに新鮮な培地を追加します。 </li><li> 4℃で5分間で2,500 RCFでコニカルチューブを遠心分離</li><li>すべてのコニカルチューブから上清を吸引除去する。細胞ペレットは、高純度のミクログリア細胞である。ミクログリアメッキ培地（DMEM + 10％FES + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を1mlに再懸濁したペレット。 </li><li>を使用して再懸濁した培地で細胞密度を数える血球。 </li><li>ミリリットル当たりの密度2×10e5細胞を達成するために、ミクログリアメッキメディアの適切なボリュームを追加します。実験的な解析に適したプレート。 </li><li>ミクログリアは一晩にアタッチすることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果高純度の主ミクログリア培養の結果、上記のプロトコル。としてマクロファージ/ミクログリア細胞特異的マーカー（Iba1）の免疫組織化学によって決定される、メッキミクログリア培養は&gt; 90％純粋（ 図2）です。さらに、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン細胞特異的マーカーを染色すると、最小限の汚染（ 図2）を示しています。混合グリア細胞培養を確立した後、ミクログリアは4つの連続した​​回まで振とうすることにより単離することができる。初期ミクログリアの分離は、約2.2×106細胞/ mlまたは10フラスコ当たり約9万個の細胞が得られると予想される収量は、それぞれの連続した​​SHAとともに減少するKE。この方法により単離されたミクログリアが貪食能力など、一酸化窒素の生産として機能し、神経毒性（ 図3）13 から14を調査するために首尾よく使用されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> 図1混合グリア細胞培養、プライマリミクログリアの分離を準備するためのプロトコルの概要。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> ミクログリア（IBA-1、赤）、アストロサイト（GFAP、緑）、ニューロン（NeuN、赤）とオリゴデンドロサイト（CC1、赤）は、特定のマーカーを用いて免疫組織化学的分析によって検証として高純度のミクログリアの図2。分離。 DAPI（青）で培養中の細胞のDNAを染色も表示されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> 図3ミクログリアは、メソッドdescriで分離されたベッドは、貪食アッセイ、機能アッセイと神経毒性の研究に限定を含むではなく、多くのアッセイで使用されています。これらの研究で、我々が制御するために露出したミクログリア（IBA-1陽性、緑）、（）またはLPS（B）が扱われているメディアを発見した、定量することができる蛍光標識ラテックスビーズ（赤）、それらの貪食を増加させる（ C）。さらに、LPS（1ng/ml）治療は、ミクログリア（D）で一酸化窒素の産生を増加させることができます。最後に、トランスウェルインサート区切りまたは直接ミクログリア - ニューロン培養の両方を介して、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）放出（E、F）によって測定されたLPSとともにインキュベートしたミクログリアが神経細胞死を誘導できることを見出した。

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Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは定期的に研究実験のための純粋で健康的なミクログリアを製造するために利用されていますが、手順の重要な部分の間に技術的な側面を慎重に検討は、単離されたミクログリアの変動を最小限に抑えることができます。まず、タイムリーで働く新生児の仔ラットの脳組織の解剖中に組織への酸素および虚血性損傷を最小限にする必要があります。しかし、髄膜の存在がこれ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿</td><td>フィッシャーブランド</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td>シャープ解剖はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14094から11 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃曲線7bの鉗子標準のヒント、11センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11270から20 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子標準のヒント、ストレート、11センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mlコニカル遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5ミリリットル血清ピペット</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100μmの滅菌ナイロンセルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td> 35から2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75センチメートル2組織培養フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの最小必須培地（DMEM） </td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td>胎児のウマ血清</td><td>フィッシャー</td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100％エタノール</td><td>ワーナー·グラハム·カンパニー</td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩は、食塩水、10X、pH7.4を緩衝</td><td>質生物学、株式会社。 </td><td> 119-069-131 </td><td>無菌の蒸留水で1X </td></tr><tr><td>バイオハザードバッグ</td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> Hausser科学</td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> cellBIND表面を有する6ウェル細胞培養プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。<em&gt; in vitroで</em&gt;研究と下流のアプリケーションに最適です。

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

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Immunology and Infection

39.1K ビュー.  Uniformed Services University. 脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。 in vitroで研究と下流のアプリケーションに最適です。