ממומן על ידי תוכנית עירונית באוניברסיטת שירותי במדים.

1. דיסקציה של רקמת מוח החולדה ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-15 צ&#39;יל של ליבוביץ בתקשורת ממוזגים (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) עד 4 ° C. התקשורת והתרבות חמים (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ל 37 ° C. הכן 4 60x15 מ&quot;מ צלחות פטרי עם 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה מותנה קרח. לעקר את כל כלי ניתוח עם אתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגורים-P2 ראפ היילודים עם אתנול 70%. (גורי עכברים היילודים בגילאי P1-P5 ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד מהרה לערוף עכברוש גור במספריים חדים סטריליים ושחרר את הראש מיד אתנול 70%. חזור עבור סכום כולל של 5 גורי עכברים מכן להעביר ראשי לתוך תמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח כולו מראשי ומניחים לתוך צלחת פטרי עם 4 - 5 מ&quot;ל L-15 פתרונות (ליבוביץ&#39; L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלים 1.2 - 1.4 עבור הגורים הנותרים המלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את קרומי המוח מהמוח ולהעביר desרקמת המוח ired (כלומר, קליפה, המוח הקטן, המוח כולו, וכו &#39;) לתוך צלחת פטרי חדשה עם 4-5 מ&quot;ל של תמיסת L-15 (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) על קרח. </li></ol> 2. הכנת אוכלוסייה מעורבת תא גלייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא פגיעה ברקמת המוח עם מספריים או סכין, להעביר את הרקמה עם פיפטה 10 מ&quot;ל ל 50 מ&quot;ל צינור סטרילי חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת חרוט על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant. הוסף 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה סטרילית 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא (100 הנקבוביות מיקרומטר) על צינור טרי 50 מ&quot;ל חרוטית. רקמת פיפטה מעלה ומטה פעם אחת עם 5 מ&quot;ל פיפטה סטרילית ועם פיפטה סומק כדי מסננת את התא, לוותר על החומר דרך מסננת לתוך התא צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המסננת תא עם 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + BS 0.1%עט + 1% / דלקת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת חרוטי עם תאים מתוחים על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li></ol> 3. ציפוי ותחזוקה של מעורבות בתרביות תאים גליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד במוח החולדה גור מעובד להכין 1 T-75 סטריליים קנקן ידי הוספת 12 מ&quot;ל של תרבות המדיה (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) לתוך בקבוק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מתאי pelleted ולהוסיף 5-6 מ&quot;ל של מדיה ותרבות כדי גלולה התא. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נפח שווה של ההשעיה התא בקבוק T-75 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלוחיות של CO 2 באינקובטור 5% ב 37 ° C עבור סכום כולל של 1-3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות יש מודגרות 1 למשך 5 ימים, ביום החמישי, להחליף את התקשורת והתרבות בבקבוק כל אחד עם 12 מ&quot;ל של התקשורת טריים ולחזור חממה. לאחר מכן, כל 3 ימים, להחליף את התקשורת מיזוג של כל אחד עם בקבוק 12 מ&quot;ל של התקשורת טריים להשיג המפגש. זה חייב לעשותנה בזהירות בלי לגעת התחתונה של צלוחיות שבו התאים לצרף. </li></ol> 4. בידוד ציפוי של microglia ראשי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תרבויות גליה מעורבים הם confluent לחלוטין, הסר צלוחיות של חממה ולכסות כמוסות קנקן עם parafilm למנוע חילוף הגזים עם האוויר הסביבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחוץ את צלוחיות ב 100 RPS (מסייע מעבדה SI-600, Jeio טק) עבור שעות 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מדיה מכל צלוחיות עם פיפטה 10 מ&quot;ל מבלי לשבש את שכבת astrocyte על פני הבקבוק. מניחים את צינורות התקשורת ב -50 מ&quot;ל בצורת חרוט. הוסף מדיה טריים על צלוחיות וצפחות ​​וחזרה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת צינורות חרוטי ב RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מכל צינורות דמויי קונוס. כדורי סלולריים הם גבוהים מיקרוגליה תאים טוהר. כדורי Resuspend ב 1 מ&quot;ל של microglia ציפוי התקשורת (DMEM FES + 10% + 1% פניצילין / סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספור את צפיפות התאים בתקשורת resuspended באמצעותhemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח מתאים של התקשורת מיקרוגליה ציפוי להשגת 2 x 10e5 תאים לכל צפיפות מ&quot;ל. צלחת בהתאם לניתוח ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר microglia לצרף לילה. </li></ol> 5. נציג תוצאות הפרוטוקול שתואר לעיל התוצאות גבוהות תרבויות טוהר העיקריים מיקרוגליה. כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה לסמן מקרופאג / microglia תאים ספציפיים (Iba1), מצופה תרבויות מיקרוגליה הם&gt; טהור 90% (איור 2). בנוסף, מכתים עבור סמנים סלולריים astrocyte, oligodendrocyte ו נוירונים ספציפיים מדגים זיהום מינימלי (איור 2). לאחר הקמת מעורבות בתרביות תאים גליה, microglia יכול להיות מבודד על ידי ניעור עד 4 פעמים רצופות. הבידוד הראשונית microglia תניב כ -2.2 x 106 תאים למ&quot;ל או כ -9 מיליון תאים לכל 10 צלוחיות והתשואה הצפויה יורדת עם כל שא ברציפותקה. Microglia מבודדים בשיטה זו נעשה שימוש בהצלחה לחקור היכולת phagocytosis, פונקציה כגון ייצור תחמוצת החנקן, רעילות עצבית (איור 3) 13-14. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להכנת תערובת בתרביות תאים גליה ובידוד של microglia העיקרי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> איור 2. בידוד של microglia טוהר גבוהה אומת על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות microglia (איבא-1, אדום), astrocyte (GFAP, ירוק), תא עצב (NeuN, אדום) oligodendrocyte (CC1, אדום) סמנים ספציפיים. מכתים את ה-DNA של תאים בתרבית על ידי DAPI (כחול) מוצג גם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> איור 3. מבודד microglia ב שיטת descriבמיטה נעשה שימוש במספר מבחני, כולל אך לא רק, מבחני פאגוציטוזיס, מבחני תפקוד לימודי neurotoxicity. במחקרים אלה, מצאנו כי microglia (איבא-1 חיובי, ירוק), כאשר הם נחשפים לשליטה (א) או LPS (ב &#39;) התקשורת שטופלו, להגדיל phagocytosis שלהם שכותרתו fluorescently חרוזים לטקס (אדום), אשר ניתן לכמת ( ג). יתר על כן, LPS (1ng/ml) הטיפול יכול להגביר את ייצור תחמוצת החנקן microglia (ד &#39;). לבסוף, הן באמצעות הוספת transwell מופרד או ישירות microglia-נוירונים תרבויות, מצאנו כי microglia מודגרות עם LPS יכולות לגרום מוות של תאים עצביים, כפי שהיא נמדדת על ידי לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור (E, F).

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אמנם זה פרוטוקול מנוצל באופן שגרתי כדי לייצר microglia טהור ובריא ניסויים מחקריים, שיקול דעת מעמיק של ההיבטים הטכניים במהלך חלקים קריטיים של תהליך יהיה למזער משונות microglia מבודד. ראשית, במהלך דיסקציה של רקמת המוח מן הגורים חולדה היילודים, עבודה במועד הדרוש כדי למזער את הנזק ואת חוסר חמצן לרקמות איסכמי. עם זאת, חשוב גם להסיר לחלוטין את כיסוי meningeal מהמוח במהלך לנתיחה, כי נוכחות של קרומי המוח יתרום זיהום פיברובלסטים משמעותית בשל קצב התפשטות המהירה בתנאים תרבות. הטיפול השני, עדין של החומר רקמות במהלך הכנת תרבית תאים מעורבת גליה כן, חשוב להגביל את הנזק התא, מוות, או הפעלת microglial מוגזמת. בעת הוספת התקשורת והתרבות, יש להיזהר לא לפגוע יום שני astrocyteolayer. בנוסף, וניערה את צלוחיות לבידוד microglia, התאמת תדירות רועד עשוי להיות נחוץ כדי למנוע משכשכים או היווצרות בועות אוויר בכלי התקשורת. אירועים אלה עשויות להגביר את זיהום astrocyte או לגרום נזק לתא התרבויות. בעת פיתוח הטכניקה הזו במעבדה, ייתכן שיהיה צורך להתחיל עם הרעידות כוח פיזי נמוך (למשל, 100 סל&quot;ד) ולבחון את התרבות התאים על ידי מיקרוסקופ supernatant לפני הגדלת כוח רועד משך להשיג תשואה הרצויה של microglia ללא זיהום astrocyte. שיקול נוסף במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה במעבדה הוא הקובע את משך זמן תרבויות מעורבות גליה סלולריים יש לשמור על בידוד לפני microglia העיקרי ציפוי. למרות הבידוד הראשונית יכולה להתרחש מ -1 עד 3 שבועות לאחר הקמת תרבות, confluency של microglia על monolayer astrocyte יהיה שונה, וייתכן כי בfluence ביולוגיה microglial בניסויים במורד הזרם. בנוסף, isolations הבאים מן התרבות תאים משולבים גם גליה אולי צריך להיות מבוסס על confluency של התרבות לעומת משך הזמן המצוין בין הליכי רועדות. יתר על כן, מאז תשואה של ירידות בידוד לאחר מכן, חשוב לציין את המאפיינים הסלולר של microglia העיקרי עשוי להיות שונה מן הראשון בבידוד האחרון. לכן, ניסויים צריך להתנהל טכנית משכפל עם סימון קפדני של microglia כאשר מבודדים. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה דן בידוד microglial מן המוח גור חולדה, בידוד מוצלח של microglia יכול גם להיות מושגת באמצעות עכברים העצבים ורקמות אחרות, כמו מיתרי השדרה. אין שינוי משמעותי בפרוטוקול הכרחי אלה מקורות חלופיים מיקרוגליה, מעבר להגדלת הקצבה ציפוי ראשוני תרבויות מעורבות (כלומר, 2 brains/T75 העכבר בקבוק או שיתוף השדרה 3-4RDS מהבקבוק עכברוש P2 pups/T75). בנוסף, כפי שניתן היה לצפות, תשואה התא נוטה להקטין בהתאם החל החומר מופחת. עם זאת, למרות התשואות הנמוכות קבלת משימוש רקמת המוח העכבר, יתרונו הוא היכולת לחקור את המנגנונים המולקולריים של microglia פיזיולוגיה תגובתיות באמצעות רקמת המוח של העכברים הטרנסגניים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ X 15 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> פישר המותג </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> מספריים חדים המבתרים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # מלקחיים סטנדרטיים 7 ב טיפים, מעוגלים, 11cm </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> דומונט # 5 מלקחיים סטנדרטיים טיפים, ישרים, 11 ס&quot;מ </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות חרוטי </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות </td><td> גרנייה ביו אחת </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות </td><td> גרנייה ביו אחת </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> תא 100 מיקרומטר סטרילית ניילון מסננת </td><td> בז </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 2 ס&quot;מ רקמות תרבות צלוחיות </td><td> קורנינג </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco מינימלית של אמצעי חיוני (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי סוסים סרום </td><td> דיג </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% אתנול </td><td> חברת וורנר גרהם </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו תמיסת מלח, 10X, pH 7.4 </td><td> איכות ביולוגית, Inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X במים מזוקקים סטרילית </td></tr><tr><td> Biohazard שקיות </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם תרבית תאים צלחות עם משטח cellBIND </td><td> קורנינג </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות<em&gt; במבחנה</em&gt; מחקר ויישומים במורד הזרם.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.1K Views.  Uniformed Services University. בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות במבחנה מחקר ויישומים במורד הזרם....

Video: Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

הערכת מתח סלולארית, דלקת דיסקרטית מפריש אוקסיטוצין המוח גרעינים בחולדה Neonatal לפני ואחרי האכלה קולוסטרום הראשון

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

מיטוב בידוד תאי סטרומה מבלוטת התימוס וממח העצם

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

מחבר זרקור: קידום מחקר המטופויטי באמצעות בידוד תאי סטרומה לריצוף תא בודד

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...