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前にこのプロトコルを開始する、出生後日目新生仔マウスを集め1-3保護さと暖かさのために、元のケージ寝具を使用してネストされた滅菌容器内（P1-3）。これは、ミクログリア収率を最適化するためにこのプロトコルを介して迅速かつ効率的に作業することが重要である。完全な試薬リストについては、表1を参照してください。 1。楽器、文化メディア、料理の準備<ol><li> 10ミリリットル/子犬ミクログリアを調製する完全培地（MCM; 1×最少必須培地イーグル[MEM]を補充した1 mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.6％v / vのD-（+） - グルコース、100μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、4％v / vのウシ胎児血清（FBS）、6％v / vのウマ血清）、各T-75フラスコ（1フラスコ/仔）に追加する、キャップと場所に水平にインキュベーター（37℃、5％CO 2）で 1時間平衡化する。 それは、切開を開始する前に、フラスコ（単数または複数）でこのメディアを平衡化することが不可欠である 。 </li><li> PREPA37℃の水浴の解剖用MCM（6ミリリットル/ PUP）とセルの再懸濁のための独立した円錐状の管MCM（2ミリリットル/ PUP）内での一定分量、そして暖かい、再。 、準備分量、氷上ミンチメディア上のチル（MM、HBSSを補充：100μg/ mlのP / S、0.01MのHEPES、3ミリリットル/ PUP）、および解剖メディア（DM、MEMは/ 100μg/ mlのPを補充したがSであり、2ミリリットル/ PUP）。 </li><li> 10分間、70％エタノールに浸漬して、次の手術器具を殺菌：シザー＃1（1;首を切るために）、＃1（2;鼻を確保し、皮質を除去するために）鉗子、はさみ＃2（1; nonangled、頭皮を開くために）、＃2（1鉗子、頭皮を除去するために）、＃3（1鉗子、頭蓋骨を除去するために）、＃4（2鉗子;髄膜を除去するために）、シザー＃3（1、脳組織をミンチにする）。無菌パッド上で空気乾燥させます。 </li><li> 70％エタノールで水平気流ワークステーションと解剖顕微鏡を拭う。 </li><li>頭を取得するための2無菌、100ミリメートルペトリ皿にDMを分注（3ミリリットル、1/3匹の皿）と解剖（1ミリリットル;解剖の前に氷上で冷却）; / PUP 1一品。脳組織（; 1ディッシュ/ PUP 1ミリリットル）をミンチ用の1の滅菌、100ミリメートルペトリ皿に、MMを分注する。 </li></ol> 2。脳の組織切開<ol><li>安楽死の前に、そっとラボの組織を用いて70％エタノールで首と子犬の頭を消毒。シザー＃1と、すぐに頭を削除して子犬を安楽死させる。先に調製したペトリ皿に頭を捕獲。安楽死させると次の動物に進む前に、1子犬の解剖を完了します。 </li><li>チルド解剖皿に頭を移し、解剖顕微鏡下で＃1（あるいは、ヘッドが目のソケットを介して鉗子を穿孔することによって固定することができる）の鉗子を用いて鼻をつまんで頭部を固定し、オープンな頭皮シザー＃2を使用して作成することにより、 Yカット：ヘッドのベースから、目に向けて角度で始まる。優しく頭蓋骨を露出させ、横方向に剥離することにより、頭皮を削除するには＃3の鉗子を使用します。 </li><li>鉗子＃3を使用して、ゆっくりとベースの結合組織を取り除く頭。 （半球間裂以下）は、脳と頭蓋骨の間に鉗子の一方の腕を通すことによって頭蓋底が露出し、慎重に開いて頭蓋骨、グリップ、そっと開いて引き裂くために上方頭蓋骨を引く。 </li><li>鉗子＃1を用いて脳の腹側の下に結合組織を崩壊され、その後、同じツールを使用して脳を削除します。脳の腹側の下に上向きの力を利用して頭蓋骨から脳を持ち上げます。 </li><li>その解剖学的位置に脳に注意してください。背側は、解剖顕微鏡下で皮質を視覚化するために上に向け、中脳および皮質の交差点に鉗子の先端を挿入して所定の位置に脳を固定し、完全に鉗子＃4で皮質髄膜を除去し、そして腹髄膜を除去して進んでください。髄膜が完全に除去された後、鉗子＃4を用いて脳の他の部分から皮質を分離する。 それが完全にミクログリアの純度とyielを最大化するために髄膜組織を除去することが不可欠であるD。 </li></ol> 3。脳組織ミンチ<ol><li>転送皮質は、以前に料理をミンチ準備する。クラスII生物学的安全キャビネットの滅菌技術を使用してステップをミンチに進みます。 </li><li>ミンチシザー＃3を使用して、脳組織、15ミリリットルコニカルチューブにみじん切りの組織を転送し、ハサミとMMの1ミリリットルごとにミンチの皿をすすぎ、みじん切りの組織を含む15ミリリットルコニカルチューブにリンスを収集し、分注このすすぎ工程を最大化します 。 すべての残存組織が ​​円錐管に移されるようにすることで、ミクログリアの収量 。刻んだ組織はチューブの底に沈降させ、1〜2分間乱さ組織懸濁液のままにしておきます。MMは必須栄養素が含まれていないように2分を超えないようにしてください。 </li><li>慎重に取り外し、定住みじん切り組織を破壊していない、あること、標準ピペットチップで汎用の千μlのピペットで上清を2ミリリットルを廃棄する。 </li&gt; <li>みじん切り組織にMCMの3ミリリットルを追加します。標準のピペットチップを使用してジェネリック千μlのピペットを使用して完全な力で組織を粉砕するチュレーションが完了したときには識別可能な固形組織が ​​残っていないはずです 。。ピペットチップから残留粉末化したサンプルを収集し、同じピペットチップでMCMの別の3ミリリットルを追加します。 </li></ol> 4。成長している皮質細胞<ol><li>遠心分離機細胞（215×gで、5分、室温で、スイングバケットローターを用いた臨床遠心分離機）をペレット化し細分化した組織。生物学的安全キャビネットにペレット化した細胞を戻し、削除し、上清を捨て、ゆっくりと細胞ペレット（; MCM 2ミリリットル/管）;再懸濁以前に調製したT-75フラスコに細胞の再懸濁を追加します。フラスコに蓋をして中に水平に配置します加湿された、標準的な組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）。細胞を24時間インキュベートすることができます。 </li><li> 24時間後、静かに破壊するの手のひらに対してフラスコをタップ組織破片。前と残骸の完全な除去を確実にするためにタップした後、細胞を確認してください。セットフラスコ垂直、メディアを取り出し、廃棄し、フラスコの底に新鮮なMCMを追加（12ミリリットル、37℃）、キャップと水平に、インキュベーターに戻し入れます。 </li><li>汚染の毎日のセルをチェックして、成長を監視する。 </li><li> 体外 （DIV） でのおよそ17〜21日、ミクログリア細胞は、混合グリア培養物から収穫の準備ができているでしょう。細胞は準備ができているかどうかを判断するには、倒立位相差顕微鏡で細胞を調べる。 ミクログリア〜40％の集密度でとき収穫の準備ができている。彼らは、他のグリアの上に単層として成長し、小さな、明るい球状セルとして表示されます。 </li></ol> 5。混合グリア培養物からミクログリアの分離<ol><li>ミクログリアを分離するために、積極的に実験台に対してフラスコをタップします。この攪拌は、ミクログリアの低接着特性のために、他のグリア細胞とは別のミクログリアに役立ちます。 </li><li&gt;パラフィルムでシール、T-75フラスコのキャップを、混合グリア培養（200 rpmで、37℃、5時間）回転させます。温度制御され、無加湿ロータリーシェーカーを使用して、細胞が5時間よりも長く握手させないようにしてください視覚的に検査します。ミクログリアは、倒立位相差顕微鏡を用いて、5時間後、フラスコ表面から持ち上げられている。 ミクログリアは明るく、球状、浮遊細胞である。フラスコの底に付着したアストロサイトとオリゴデンドロサイトの残留層が存在します。 </li><li>無菌コニカル遠心管にミクログリアを含む上清のメディアを集め、ペレットミクログリア（215 XG; 5分、バケットローターを振る）。 </li><li> 〜2、0.6％体積/ vglucose、1mMのL-グルタミン、100μg/ mlののP / S、5％v / vのFBSを1 mMピルビン酸ナトリウム：;暖かいミクログリア増殖培地（MGMにおけるミクログリアペレットを再懸濁MEMを補充したミリリットル/フラスコ）、血球計数器を用いて細胞濃度を決定し、上の24ウェルプレートフォーマットにおいてウェル1×10 5細胞/プレートプラスチックまたは（500μL/ウェル; MGM）を滅菌ガラスカバースリップ。 この手順を用いて、平均ミクログリア収量は7.5×10 5細胞/ PUP皮質である。 </li><li> 24時間後のめっき、浮遊細胞および破片を除去するために、新鮮なMGM（37°C）とメディアと再給細胞のすべてを削除します。 このステップでは、細胞の生存にし、静止ミクログリアを維持することが重要です。細胞は、すぐに再給紙後に実験のために利用することができる。 </li></ol> 6。たとえばトリートメント<ol><li>加湿インキュベーター中で2又は24時間（37℃、5％CO 2）インキュベートし;パムの10 ng / mlの3 CSK 4（パム）、10 ng / mlのリポ多糖（LPS）またはビヒクル対照に細胞をさらす。 </li></ol> 7。機能性生体外を経由して免疫蛍光イメージングおよび免疫細胞化学のためにミクログリアを分析する<ol><li>微量遠心管（1.5ml）およびCENTR治療、収穫細胞培養培地の後にメディアを消去するには、卓上マイクロ（900 XG 2分）を使用してifuge。使用する準備ができるまで、すぐにアッセイ、または-20℃で保存、きれいなマイクロチューブに上清を移します。市販のマウスTNF-αELISAキットを介して細胞培養上清中のTNF-α濃度を分析します。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定（w / v）のパラホルムアルデヒド/ 4％（w / v）のスクロース/ PBS液pH7.4（4％PFA、15分、RT）。固定後、穏やかにオービタルシェーカー上で振盪しながら5分間PBSで細胞を洗浄。 <ol><li> 免疫蛍光/免疫細胞化学で固定し、PBS洗浄、免疫細胞化学のためのプロセスミクログリアの後。 すべてのステップは、穏やかに振とうしながら行った 。 PBS/0.1％トリトンX-100で細胞を透過、一時間PBS/10％正常ヤギ血清でブロックセル。ブロッキング緩衝液中で、またはウサギ抗伊庭-1抗体（1/750）;ウサギ抗NF-κB抗体（1/1、250 p65サブユニット）と、O / N、4℃で細胞をインキュベートする。ビジュアル抗原をIZE：蛍光コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体（1時間、1/1、000）とのインキュベーション後の抗体複合体。 PBS/0.1％トリトンX-100（3X 5分）で洗浄することによって結合していない二次抗体を除去する。 </li><li> 4 &#39;、6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール/ PBS（DAPI; 0.1μg/ ml）を有するカウンター染色細胞。細胞核を視覚化する全てのミクログリアはCX3CR1-GFPに由来+ / -マウスは、GFPを発現する。 DAPIを可視化するために350nmの波長フィルタを利用し、GFPを可視化する488nmの波長フィルターと594 nmの波長フィルタは、p65および伊庭-1免疫複合体を視覚化する。 </li></ol></li><li>マウントカバーは、水性マウンティング溶液を用いて、蛍光顕微鏡を用いて視覚化ミクログリアを滑る。 </li></ol>

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Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

著者は研究が関心のある潜在的な競合として解釈される可能性のある商業や金融関係が存在しない場合に実施されたことを宣言します。

現在の手順では、新生マウスからの皮質ミクログリアの単離のための効果的な方法を提供しています。この手順では、蛍光イメージング、免疫細胞、およびELISAで測定し、1）保存ミクログリアの免疫表現と機能の2倍の利益を持っている、そして、2）ミクログリアの前に、他のグリア細胞（アストロサイトおよびoligodentrocytes）の存在下で成熟することができますグリア培養成熟期間中に重要?...

小膠細胞は、CNS実質の監視マクロファージは、成体哺乳類の脳の全細胞集団の約12％を構成する。小膠細胞は、卵黄嚢、骨髄前駆細胞に由来し、成体CNS 1-5内の異なる領域における細胞構築の細胞密度および形態が変化している。健康な成人の脳では、ミクログリアは、微細な、ダイナミックなプロセスと、小さな枝状または極性細胞である。周辺マクロファージの形態とは対照的に、ミクログリアは細胞非アクティブとして表示されることがあり、健康な脳では静止、ロープロファイル表現型を示すが、in vivoイメージング研究は、ミクログリアのプロセスを動的」を彷彿とさせる方法で、その微小環境を監視するために拡張し、撤回することを実証サンプリングと測量」6,7。 ミクログリアは、スイッチング、高度かつ差別的脳における環境的および病態生理学的な変化に応答する監視者からの​​状態 - 一般的に彼らの休止およびそれぞれ活性化した状態とみなさエフェクターへ。活性化のこのスイッチは、このような病原体関連分子パターン（PAMP）に反応し、Toll様受容体（TLR）、などの膜結合パターン認識受容体（PRR）の係合によって、すなわち細菌やウイルス由来のリポタンパク質を媒介することができます、核酸、及び炭水化物8-11。のPAMPのほかに、PRRは、また、細胞損傷12-16のようなCNS恒常性に摂動を表す危険/ダメージ関連分子パターン（DAMPS）として知られている無菌の、非病原性の分子に対するミクログリア活性化を誘導することが示されている。かつて従事し、PRRははミクログリア細胞の形態や遺伝子発現の変化をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する、具体的には、活性化したミクログリアは、アメーバ様の表現型を適応させる細胞核にP65、NF-κBサブユニット（P65）を転位し、アップレギュレートのproductionような活性酸素種（ROS）16-24に沿っ腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン1-β（IL-1β）などの炎症誘発性サイトカインの分泌。 CNSの先天性免疫応答の積分が、これらの分泌された分子はまた、それによって、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの25-29疾患状態における神経変性を誘導し、悪化、ニューロンの酸化ストレスを増加させることが見出されている。 しかし、病的状態にあるミクログリア活性化のメカニズムは完全には理解されていない。ミクログリアの活性化の生体内での機能の多くは、培養中で要約することができるように、したがって、ミクログリアの単離は、これらの生物学的プロセスへの強力な調査ツールです。いくつかの方法がCNS組織30,31の酵素消化後のパーコール勾配を経由して分離を含むミクログリアを分離するための利用可能です。しかし、酵素消化を変更することができます細胞表面抗原の発現32を減少させることによって、細胞の免疫表現型、および本明細書に記載された方法よりも、動物あたりの細胞収量をもたらす。以前パーコール勾配収率3-5×10 5細胞30,33,34を経由して、全CNSから単離法を報告しながら、具体的には、7.5×10 5細胞の子犬皮質あたりの平均ミクログリア収率を報告している。現在の手順では、それによってミクログリア免疫表現性と機能性を維持し、彼らの低接着特性に基づいたミクログリアを分離することにより、消化酵素の使用を回避する。 （CX3CR1-GFP + / - ）は、本研究では、新生児のヘテロ接合カイン-GFPに由来し混合グリア培養からミクログリア細胞の単離を記載し、ロータリーシェーカー、以前の延長線上の機械的攪拌を経由して、C57BL / 6マウスの皮質公表された方法の24,35。私たちは、ミクログリアの容易な視覚化のための前のマウス系統を利用単球特異的プロモーター36〜38 -これらのマウスは、内因性CX3CR1遺伝子座の制御下にGFPを発現する。このメソッドは、保存免疫表現ex vivoで細菌性リポ多糖（LPS）またはパム3 CSK 4、TLR4およびTLR1 / 2アゴニストでチャレンジしたときの形態学的変化、p65の核移行、およびTNF-αの分泌によって証明されるようにして高純度のミクログリアの文化を生産であった。

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &amp;deg;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30239.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Defined)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Earle&#039;s (MEM)</td><td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td>Without L-glutamine. Contains Earle&#039;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td>Without calcium and magnesium. Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-031</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Used to stain cell nucleus.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NF&amp;kappa;B (p65)</td><td>Abcam</td><td>7970</td><td>Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td></tr><tr><td>10 ml Disposable Serological Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Disposable Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Disposible Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6010</td><td>1; 5 in; used for removing head</td></tr><tr><td>Scissor: Vannas&lt;br/&gt; (scissor #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp</td></tr><tr><td>Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1; curved; used to mince brain tissue</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #7&lt;br/&gt; (forcep #1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>2; used to secure nose and remove cortices&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #2&lt;br/&gt; (forcep #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>1; used to remove scalp</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #3&lt;br/&gt; (forcep #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>1; used to remove skull</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #5a&lt;br/&gt; (forcep #4)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-21</td><td>1; used to remove meninges</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Specific Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoom Stereo Dissection Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ4060</td><td>Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td></tr><tr><td>Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-201-330</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3440001</td><td>Class II</td></tr><tr><td>Water-Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>VWR</td><td>97025-836</td><td>Set to 37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Swing-out buckets</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006441</td><td>To be used with Swing-out rotor</td></tr><tr><td>Swing-out Rotor</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006445</td><td>Max Radius: 19.2 (cm)</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge&lt;br/&gt; (clinical centrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>With swing-out rotor</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17 microcentrifuge&lt;br/&gt; (tabletop microcentrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S98645</td><td>With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

CNS組織からミクログリアの単離は、ex vivoでミクログリア生物学を研究するために使用される強力な調査ツールです。本発明の方法は、ロータリーシェーカーで機械的攪拌により、新生児マウスの皮質からのミクログリアを単離するための手順を詳しく説明します。このミクログリアの分離法の利回り生体内で正常な、非病理状態で静止ミクログリアを示す形態学的および機能的な特徴を示す高純度皮質ミクログリア。この手順は、形態学的変化、NF-κB（P65）のp65サブユニットの核移行、および特徴的な前炎症性サイトカインの分泌の誘導によって示されるように、ミクログリア免疫表現および生化学的機能を維持し、腫瘍壊死因子α（TNF-α ）、リポポリサッカライド（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）の課題に依存する。そのため、本単離法は、静止してACTIの両方の免疫表現を保持するex vivoでの条件でミクログリア生物を調査する実験方法を提供し、ミクログリアをvated。

隔離中のミクログリアex vivoでの免疫表現と機能性を保持することミクログリア生物学のための捜査モデルとして、これらの細胞を利用できることが重要です。本発明の方法を用いて、ミクログリアimmunofunctionalityの正常な保全性を実証するために、我々はP3新生児から皮質ミクログリアを単離した（CX3CR1-GFP + / -およびC57BL / 6）およびLPS又はパムのいずれかで培養物を処理した。...

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Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K ビュー.  Georgetown University Medical Center. ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミ...

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

免疫・感染学

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

神経科学

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...