Greber らに公開されているアクチビンELISAプロトコルを設定するための博士ボリスGreberに感謝します2007。我々は、グラフィカルな概要を準備するための夫人モニカShevackに特に感謝しています。私たちは、撮影前と中にすべてのヘルプと貴重な提案のために博士ハイコ·フックスに非常に感謝しています。我々は、MEFには、CMの安定供給を維持するために特にエリーザベトSocha、アジャイ室のすべてのメンバーに感謝したい。我々はまた、永続的なサポートのためのMPIMGの動物施設で私たちの同僚を認める。本研究の一部はマックス·プランク協会によって資金を供給された[BMBF、助成金番号0315717A] ERASysBioのパートナー+ EU FP7のERA-NET Plusのスキームの下でサポートイニシアチブ。

1。マウス胚線維芽細胞の単離細胞（MEF） 次の2つの手順は、非無菌条件下で行われます。 <ol><li>頸椎脱臼により13または14 DPC（日後の交尾）で妊娠したマウス（CF1、ハーラン、米国）を生け贄に捧げる。 </li><li>子宮角を解剖し、簡単にのCa 2 +はMg 2なしでPBSを含むファルコンチューブに70％（v / v）エタノールと場所にリンス+（ギブコ社、Invitrogen社製）。 </li></ol>次の手順は無菌条件下で組織培養フード内で実施され、滅菌器を使用しています。 <ol start="3"><li>ペトリ皿に子宮角に配置し、その胎盤や胚嚢から各胚を分離します。 </li><li>頭と赤い器官を解剖し、PBSで洗浄し、きれいなペトリ皿の中ですべての胚を配置します。それはピペッティングすることが可能になるまで細かく滅菌カミソリの刃を用いて組織をミンチ。 </li><li> 0.05％トリプシン/ EDTA（Gibco社、Invitrogen社製）、合わせたもの含めるの1ミリリットルを追加します。胚あたりのDNase I（USB）の鼎100クニッツ単位。 </li><li> 50mlファルコンチューブに組織を移し、37℃で15分間インキュベート℃、インキュベーションの各5分後、完全に上下にピペッティングにより細胞を解離する。 </li><li>新たに調製したMEF培地の約1ボリュームを追加することによって、トリプシンを不活性化する。 MEF培地（成分は、メディアの500ミリリットルを加え、すべてのコンポーネントを混在させると、フィルタするため）： DMEMの450ミリリットル、FBSを50ml（10％（V / V））、200 mM L-グルタミン（1/100（v / v））を5 mlのペニシリン - ストレプトマイシンの5ミリリットル（1/100（V / v））を。 </li><li> 5分、（300×g）で、低スピードで細胞を遠心分離し、慎重に暖かいMEF培地で上清と再懸濁し、細胞ペレットを削除します。 </li><li>プレート約2時間、0.2％ゼラチン（ウシ皮膚、タイプB、シグマからゼラチン）で被覆された各T150（TPP）フラスコで3-4胚と同等であるセルの数。線維芽細胞（P0、通路0）ゼラチンコートしたフラスコにアタッチする能力を持っている唯一の細胞である。 </lI&gt; <li>理想的には、細胞は24時間後に80から90パーセントコンフルエントであり、この段階ではP0の細胞の大部分は将来の使用のために凍結されています。 </li><li>フィーダは、ヒトES細胞をreplateするか、または条件培地（CM）を生成するようにP3またはP4までP0の細胞の残りのT150フラスコ（s）を展開し、不活化して使用します。 </li></ol> 2。不活化とめっきのMEF（フィーダー細胞の調製） すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。 <ol><li>少なくとも2時間、室温で0.2％のゼラチンとインキュベートしたコートT150フラスコ。 </li><li>マイトマイシン、PBS中のC（1 mg / ml）とフィルタを希釈する。 </li><li> MEFのから培地を吸引除去し、Ca 2 + Mg 2 +を含まないPBSで洗浄する。 </li><li> MEFのマイトマイシンCで10μg/ mlを含む培地の代わりに20ミリリットル。 </li><li> 37℃で2時間インキュベート培地を含むマイトマイシンCとCは、その後PBS、トリプシン処理、遠心（300 xgで5分間）と、暖かい培地に再懸濁し細胞で2回洗浄する。 </li><li>次の6日間のCM制作のためのT150フラスコ、使用中の56.000細胞/ cm 2の密度で細胞とプレートを数える。 </li></ol> 3。馴化培地（CM）の準備すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。 <ol><li> 56.000細胞/ cm 2の密度hESCの培地でMEF培地を交換する（UM、無条件培地）で不活化したMEFをめっき後の日（0.5ミリリットル/ cm 2）とFGF2の4 ng / mlのと新たに補った。 </li><li> 24時間インキュベーションした後、フィーダーフラスコからCMを収集し、フィーダにFGF2の4 ng / mLを含有する新鮮なhESCの培地を追加します。 </li><li>次の6日間に、この手順を繰り返します。毎日の-20℃でCMを集めた</li><li> 6日には、培地とフィルター（コーニング、0.22μmの、PAS）のすべてのアリコートをミックスした後。 -80℃で50ミリリットルのアリコートとストアを行い℃の</li><li>マトリゲル上に成長したヒトES細胞に添加する前にFGF2の追加の4 ng / mlとしたCMを補足するものです。&lt;/ LI&gt; </ol> 4。培地にアクチビンの測定（ELISA）15 <ol><li>すべてのサンプルと試薬を室温に戻します。 </li><li>マイクロプレートに追加し、1％BSAを含むPBSで（ヒューマン\ MOUSE \ラットアクチビンMAB、R＆D Systems）を捕捉抗体（100μl/ウェル）、室温で一晩インキュベート希釈します。 </li><li> 24時間は、RTで1時間ブロック（1％BSA / PBS、300 /ウェル）をPBST（0.05％Tween20を含むPBS）（300μl/ウェル）をウェルに3回洗浄した後。 </li><li>この時間内に7希釈液（30 ng / mlの未満の濃度）とブランク試料を含むアクチビン（R＆D Systems）を標準曲線を、準備します。アクチビンの線形動作範囲は0.25〜32 ng / mlである。 </li><li>ウェル（100μl/ウェル）に標準とサンプルの重複を追加し、室温で2時間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄します。 </li><li>セカンダリ（ビオチン標識）抗体（マウス/ラット/ヒトモノクローナル抗体アクチビン、R＆Dシステムズビオチン）（0を追加します。25μg/ mlの1％BSA / PBS）と室温で2時間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、ストレプトアビジン-H​​RP（1％BSA / PBS、R＆Dシステムズ社で希釈した）を追加し、室温で20分間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、基質溶液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ）を追加し、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li><li>各ウェルに停止液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ社）を加え、穏やかに混ぜる。 </li><li>各ウェルの光学密度を決定するために、540または570 nmの波長補正で、450 nmのマイクロプレートリーダー（Molecular Devicesスペクトラマックス250、グローバル医療機器株式会社、ミネソタ州）を設定します。 </li></ol> 5。代表的な結果分離手順の全体的なスキームを図1に示されています。ヒトES細胞と異なる条件下で培養hiPSCsの典型的な形態は、 図2に示されています。の形態<html> MEFのとCMを準備するために使用不活化フィーダー細胞は、 図3に示されています。一般的に、細胞は24時間後に分離コンフルエントとフリーズしたり、展開する準備ができているはずです。しかし、時にはそれがコンフルエントに培養を取得する前に2-3日かかる場合があります。 CMが通路4としない後に細胞から調製されるべきである。初代培養細胞にのみ老化の発症前に4から5までの通路のために拡張することができますので、これは非常に重要です。 サイトカイン、アクチビンAは、多能性細胞14の未分化な成長をサポートするためにフィーダー細胞から分泌される最も重要な要因と見なされます。 CMでアクチビンのレベルの測定は、（ 図4）MEFの品質を監視するために非常に便利な定量的なアッセイである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> 図1 MEFの分離手順の概略図。 ontent &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> 図2（A）フィーダー細胞、（B）条件培地および（C）定義されている培地の存在下で培養した未分化ヒトES細胞の典型的な形態。 （D、E）フィーダー細胞の存在下で培養hiPSCsの典型的な形態。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> 56.000細胞/ cmの密度で3マウス胚繊維芽細胞（MEF）の典型的な形態は。二日間メッキ/分離後の（）航路0（P0）、（B）不活化フィーダー層図 2。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> 図4酵素免疫測定法（ELISA）ベースの馴化培地（CM）PRにアクチビンの濃度の測定CF1マウス系統から派生したマウス胚線維芽細胞でepared。 CMは6日のために収集し、プールした。 CM &quot;1&quot;、CM &quot;2&quot;は、メディアと無条件メディアへのUMの異なるバッチを参照してください。空調プロセスの関数としてUMでほぼ検出不可能であるアクチビン、MEFにして培地中に分泌アクチビンされています。

<ol>
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Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介するMEFの分離手順は、ヒトES細胞とhiPSCsための標準化された培養条件の確立を可能にします。また、フィーダー細胞によるサイトカイン産生を評価するために使用されるELISAベースのシステムは、MEF由来の馴化培地の質の有用な指標である。サポートしている線維芽細胞を提供するマウス系統（CF1）の定期的なメンテナンスは、培地のバッチ間の変動を回避するために必要です。また、細胞の一貫した品質を得るために同時に複数のマウスから胚を分離することをお勧めします。確かに新たに単離したMEFは、P0とP1で凍結保存することができます。また、不活化のMEFは、細胞培養のための要件に応じて適切な量のアリコートで凍結保存することができます。通常約250.000細胞を培養ヒトES細胞やiPS細胞への6ウェルプレートの単一ウェルに播種する必要があります。確立され、最適化されたメソッドは、定期的にdiffeの間でのばらつきを最小限に抑えることができます。実験を借りる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース） </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>真空フィルターシステム</td><td>コー​​ニング</td><td> 431097 </td><td> 500ミリリットル、0.22μmの、PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトのSerUM交換</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>シグマ</td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td>マイトマイシンC </td><td>ロシュ社</td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子</td><td>ぺプロ</td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化Anti-human/mouse/ratアクチビン抗体</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト/マウス/ラットアクチビンのMAb </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05％トリプシン-EDTA </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td>余分な薄型アイリスはさみ</td><td> FST </td><td> 14088から10 </td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフェ鉗子</td><td> FST </td><td> 11150から10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse固定鉗子</td><td> FST </td><td> 18155から13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells

一般に、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）とヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）1は、可変条件下で培養することができます。しかし、これらの細胞を培養するための効果的なシステムを確立することは容易ではありません。培養条件は、ヒトES細胞とhiPSCsの多能性付与遺伝子発現に影響を​​与えることができるので、最適化および培養方法の標準化が重要である。 hESCの樹立は、最初のフィーダー細胞とウシ胎児血清（FBS）含有培地2としてのMEFを使用して記述されていた。次に、FBSはノックアウト血清代替物（KSR）、およびヒトES 3の増殖を促進するFGF2、置き換えられました。最後に、フィーダーフリーの培養システムは、KSR含有馴化培地を細胞（MEFによって条件付け培地4）にマトリゲルをコートしたプレート上で細胞培養を可能にします。その後、ヒトES細胞の培養条件は、化学的にdefinでフィーダーフリーの培養に向かって移動したEDの条件は5-7。また、異種フリーコンポーネントを使用して、病原体と動物性タンパク質の培養法による潜在的な汚染を避けるために、8を確立されている。 改良された条件を取得するには、マウスフィーダー細胞は、ヒト細胞株（例えば、胎児の筋肉や皮膚細胞9、大人の皮膚細胞10、包皮線維芽細胞11-12、羊膜間葉系細胞13）に置き換えられています。しかし、ヒト包皮線維芽細胞由来のフィーダーレイヤーを使用して未分化ヒトES細胞を維持するための効率は14アクチビンの分泌の低いレベルのために、マウスフィーダー細胞からのそれと同じくらい高くはありません。明らかに、マウスとヒトのフィーダー細胞による成長因子の産生で明らかに違いがあります。 マウスとヒトのフィーダー細胞のトランスクリプトームの解析は支持と非支持細胞の間に有意差を明らかにした。外因性のFGF2はmaintaiために重要ですヒトES細胞とhiPSCsの自己再生寧と、フィーダー細胞のTGFβ1、アクチビンAとグレムリン（BMP拮抗薬）の発現を調節する重要な因子として同定されている。アクチビンAは、ヒトES細胞15から16にOCT4、SOX2、NANOGとの発現を誘導することが示されている。 長期培養では、ヒトES細胞とhiPSCsは、その未分化状態を維持するために、有糸分裂不活性化されたMEFまた​​はマトリゲルをコートしたプレート上でMEF-CM（MEF-馴化培地）でフィーダーフリーの条件下で成長させることができる。彼らは直接ヒトES細胞の成長に影響を与えるので、両方の培養条件の成功は、完全に、フィーダー細胞の品質に依存します。 ここでは、メディア内のアクチビンのレベルを評価するために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）の単離および培養のために最適化された方法、条件培地（CM）と酵素免疫測定法（ELISA）の調製を示す。

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Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

マウス胚性線維芽細胞（MEF）の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地（CM）が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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Research

JoVE Journal

Biology

90.4K ビュー.  Max Planck Institute for Molecular Genetics. マウス胚性線維芽細胞（MEF）の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地（CM）が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生物学

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

ヒト胚性幹細胞の文化とメンテナンス

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...