我々は、培養技術との有益な助言のために博士ジュリー·ゴードン博士ナンシーマンリーに感謝したいと思います。この作品は子供の緑内障財団とシャロン·スチュワート無虹彩症研究の信頼によってサポートされています。

マウス胚培養： すべての実験手順を見直し、継続的な規制監督を維持グルジア機関動物実験委員会、大学によって承認されたプロトコル番号のA2010 07から119、次の健康ガイドラインの国立研究所に厳密に従って行った。 1。培養培地の調製<ol><li>ノックアウトDMEM、ノックアウト血清代替（KSR）（10％）、N-2サプリメント（1×）、アルブミン、ウシ血清から（2％）、ペニシリン（以下の量で市販されている幹細胞培地およびサプリメントを用いて培地を調製50 IU / ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、およびアンホテリシン-B（1.25μg/ ml）を。李を参照して、抗真菌剤を添加して特定の試薬 ​​や機器の詳細については、抗生物質の濃度の2倍を（使用して：調製した培養培地は、以前に以下のように変更して15を説明したものと同様であるマテリアルのST）。 注：以前に使用され（ムーア·スコットら 15）のような抗生物質の濃度は、胚培養物は24時間の期間まで搬送するために十分であった。培養は24時間を超えて継続したときしかし、我々は、培養物の汚染を経験し、これは正常に抗生物質濃度を倍にすることによって制御した。 </li><li> 4℃で、またはメーカーの推奨に従って、-20℃でメディアコンポーネントを格納します。 KSRとN-2サプリメントは凍結融解の繰り返しを避けるために、-20℃で一定分量で保存してください。一度開いたノックアウトDMEMを、製造者の推奨に従って30日以内に利用されるべきである。使用前に、37℃の水浴中で成分を温め</li><li>無菌条件下でのメディアを準備します。培養フードでそれらを配置する前に70％アルコールを噴霧して培地成分を含むすべての機器や瓶の表面を消毒。 </li><li>培地成分は、滅菌ビーカーに直接フィルターシステム（コーニング）のいずれかで混合することができる。最初のノックアウトDMEM中にアルブミン粉末を追加します。アルブミンは、完全に溶解するまで穏やかに振とうして完全に混合する。次いで、N-2サプリメント、KSRと抗生物質を追加し、ピペッターを使用して完全に混合する。次いで、真空吸引により0.22μmの孔径のフィルターを用いて培地を滅菌濾過する。使用するまで4℃で50ミリリットルコニカルチューブとストアにメディアを分注する。一旦調製メディアは、培養のために4〜5日以内に使用しなければならない。 </li></ol> 2。文化の機器の準備<ol><li>ガラス培養ボトルとゴムコルクを殺菌。アルミ箔で培養瓶をラップし、水のビーカーにゴムコークスボトルを配置し、オートクレーブで滅菌する。 </li><li>文化を開始する前に、70％アルコールスプレーし、37℃に加温して、培養室（精密インキュベータユニット）滅菌する。培養チャンバは、Eである培養ボトルを保持している中央のローリングディスクと皮肉を言った。チャンバ内へのガス流は、圧力計によって調節され、流量は、端部にガラス管中の水を介しての気泡の流出を観察することによって調整することができる。このローリングボトル培養装置は、新機能とコックロフト17によって導入され、元の装置の変形バージョンです。 </li><li>培養室に95％O 2/5％CO 2のガス混合物を含有するガスボンベを接続した50cc /分の流速を与え、十分な酸素供給を確実にする&quot;1秒に1回の気泡として「ガス流量を調整する培養胚へ。 </li></ol> 3。マウス胚コレクションと文化のための準備<ol><li>野生型マウス胚を得るために、我々は、C57BL/6J及びCD-1（チャールズ·リバー·ラボラトリーズ）の遺伝的バックグラウンド系統のマウスを用いた。 </li><li>毎日の朝の膣プラグ用雌マウスをチェックしてください。目を発見当日の正午E膣プラグがE0.5 DPC（日性交後）として考慮されるべきである。 </li><li>標準プロトコルに従って妊娠マウスを安楽死させることで、E10.5、DPCでマウス胚を収集します。動物の安楽死（2013年）のためのアメリカ獣医師会（AVMA）のガイドラインで指定されたマウスをCO 2吸入装置を使用して安楽死させた。死を確実にするために、頸椎脱臼がCO 2への曝露後に実施した。 </li><li>機器に腹部の毛の付着を回避するために腹側の腹部表面に70％エタノールをスプレー。その後、子宮を見つけるために鉗子をmicrodissectingに鋭い鈍い運転はさみや4-3/4のペアを使用して腹腹腔を開きます。 microdissecting鉗子4を使用すると、子宮全体を持ち上げ、子宮体時および子宮角の先端に軽い操作ハサミで切断することにより、本体から分離。 </li><li>すぐに洗い流し1X PBS中子宮全体を37℃に加温し子宮に任意の血液付着を除去し、直ちにDMEMに配置するペトリ皿中で37℃に温めた。さらに使用する前に70％エタノールスプレーで楽器を殺菌。 注意：PBS、DMEMおよび培養液を含むソリューションを予熱し、全体の手順の間、37℃でそれらを維持することをお勧めします。 </li><li>解剖顕微鏡下で、子宮は分節軽い操作ハサミで切開しなければならない。これは、（末端を平滑化）修飾microdissectingのピンセットを穏やかに開口部を広げること挿通可能なセグメント化された子宮の両側に小さな開口を生じる。これはゆっく​​りライヘルト膜と頭頂卵黄嚢（PYS）を公開するmicrodissectingのピンセットで引き裂くことによって除去することができる胎盤脱落膜の露出を可能にします。ピンセットの1辺を使用すると、静かにPYSとともにライヘルト膜を貫通し、目とは別E基盤となる内臓卵黄嚢（VYS）はそのままVYSで胚を露出するために層を形成する。栄養膜コーンと栄養外胚葉誘導体は、胎盤の脱落膜の有無ライヘルト膜のいずれかで削除することができます。ケアは胚がすぐに飛び出しとしてVYSの破裂を避けるようにしなければならない。 </li><li>無傷VYS有する胚を、次いで、培養培地をプラスチックトランスファーピペットを用いて37℃に温め含むペトリ皿に移されるべきである。 注意：すぐに子宮から分離した後、培養培地に移し、培養中の胚のより良い発展のために役立ちます。 </li><li>小さな開口部は、主要な血管を避けmicrodissectingのピンセットで卵黄嚢になされるべきである。ピンセットの鋭い一対穏やか頭部領域に隣接する領域に穿孔することによって、開口部を作製するために使用することができる。代替的に鈍いピンセット二対の小さな開口部を作るために卵黄嚢、穏やかに涙を保持するために使用することができる。ゆっくり胚の頭にフィットするだけで十分な大きさにピンセットで拡張することで開口部を広げる。密接に胚をラップしている羊膜優しく身体から離れて保持され、ピンセットを使用して引き裂かれるべきである。卵黄嚢15のそれと胚血管系の整合性を維持しながら、胚の頭とそれ以降の全胚を静かに卵黄嚢から体外にする必要があります。 注意：卵黄嚢血管系への任意の損傷は、潜在的に、培養中の胚の発達に影響を与えることができます。損傷した血管系を有するこのような胚培養のために使用すべきではないし、後で廃棄することができる胚のステージング用に使用することができます。 </li><li>胚ステージング基準：各グループから少なくとも2胚について体節の数（複数可）をカウントすることにより、四肢と目、形態とステージ、身体と頭の大きさなどの形態学的基準によって解剖顕微鏡およびグループの下胚を調べます。 &lt;強い&gt;注意：通常胚が子宮内で開発中の同腹ショーの違いから得られ、体の大きさ、形態的特徴や体節の数が異なる。しかし、我々は我々の形態学的基準によってグループ化された胚は、通常、同様の体節の数（±1）を示したことがわかった。この理由から、これは、培養を開始するための時間を遅らせるであろうように、各胚のための体節をカウントする必要はない。 注：培養のための体節をカウントするために使用された胚を使用しないでください。培養を開始する時間遅延を回避するために、他の胚培養開始後の体節を数える。子宮からの分離後の培養に遅れが出た胚は通常、貧しい発展を示す。 </li><li>新鮮な培養培地でペトリ皿にすぐに胚を移し、37℃に加温し、胚は再度滅菌culturでペトリ皿に転送されるべき培養フードに持っていくEメディアは、メディアとの培養瓶にそれらを入れる前に培養を開始します。 注：胚のために複数のメディア転送を培養は、胚の収集と解剖の異なるステップを培養フード内に設置されなかった解剖顕微鏡下で実施したように、汚染の防止に役立ちます前に。 ゴミサイズが大きい（&gt; 12胚）である場合は、ステップ半分の胚や文化を開始したり、培養液で皿に入れ、37℃のCO 2インキュベータに入れてください。注意胚を長期間（&gt; 35〜40分）のために外に残っていたとき、我々は減速するハートビートを観察し、これは文化の中で後の開発に影響を与えます。 </li></ol> 4。マウス胚を培養する<ol><li>培養フードでオートクレーブ培養瓶を開き、適切にラベルを付けます。転写培地3mlを、tの各々に37℃に温め彼は、ボトルや、マウス胚を滅菌プラスチックホールピペットを用いて培養ボトルに静かに転送する必要があります。培養ボトルは、培養装置内のローリングディスクに培養瓶を保持するために役立つゴムコークスボトルでキャップされるべきである。 注：メディアで培養瓶、マウスを安楽死前に調製し、培養装置のローリングディスク上に配置することができる。これは、培養ボトル中に胚の転送に時間が短縮される。 注：マウス胚は、個々に、または同じ培養ボトル中の二、三の胚と共培養物として培養することができる。 </li><li>培養ボトルに無菌的37℃で培養装置へ搬送し、しっかりとゴムコルクと転がりディスクの穴にそれらをフックする必要があります。 EMBRの自由浮上を可能にする、毎分35回転（rpm）の一定速度で回転するローリングディスクの電源を入れますメディアでのYOSとも胚組織による遊離ガス交換に役立ちます。培養チャンバに接続されたシリンダからのガスは培養ボトルに圧延ディスク、ゴムコルク流れる。 </li><li>文化を定期的に16〜40時間とするための胚はガス流出、培養室の温度を確認してください。 注：培養液中のマウス胚操作：胚を少なくとも30分間培養条件に適応しましょう。次いで、パフォーマンスが低下し、微弱な心拍を示す胚を廃棄することができ、残りの胚は、さらなる操作の研究のために利用することができる。例えば、エレクトロポレーション5,9,16、マイクロインジェクション18、ビード16移植、薬物治療や他の手順などの胚操作は、この時点で行うことができる。我々は、正常に初期の眼の発生におけるそれらの役割を研究するために、特定のシグナル伝達分子で処理しアフィゲルアガロースビーズの移植を行う。胚の後操作は、新鮮な培地中に戻さ、培養を継続することができる。 </li><li> 9月10日時間と文化の18〜19時間の培養を40時間継続した後に特定の間隔で完全に新鮮な培地で培養培地を交換してください。 注：培養は16〜18時間で停止した場合に培養培地の交換が必要とされない場合があります。 </li><li>文化の中での成功の尺度：培養での胚の成長は体の大きさの増加、体節の数や頭、手足、心臓や目の形態学的発達によって評価されるべきであるが、培養中の胚の生存率は、体内に表示心拍、血液の​​循環によって決定されるべきである。 </li><li> E11.0 DPC（〜40〜41秒）とE12.0 DPC（〜49-50 s）で子宮内発生した胚では 、それぞれ16〜18時間と38〜40時間、培養した胚を比較するためのコントロールとして使用する必要があります。 </li><li>培養中および子宮内段階で CAPTが可能のための種々の時点で胚発生解剖顕微鏡下ured。スポットイメージングソフトウェアは、画像をキャプチャするために利用され、それ以降の画像処理ソフトウェアを用いて処理した。 </li></ol>

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	<li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup.">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Tam, P. 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Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li><li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin,+insulin-like+growth+factor-1,+and+epidermal+growth+factor.">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li><li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation.">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li><li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos.">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li><li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development.">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis.">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li><li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li></ol>

私たちはどんな競合する経済的利益を持っていません。

妊娠中期段階のマウス胚は、37℃でのローリングボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気下で無血清培地中で培養した。胚発生の元の子宮は、子宮は培養終了します（ 図1）に安楽死させたマウスから単離した時点から手術中の各段階で複数の要因に決定的に依存していた。現像に影響を与えた最も重要な要因は、培養を開始するのに要する時間であった。最も注意...

全体の胚を用いた体外培養法では子宮内でアクセスしにくい胚の器官形成に関与するメカニズムのシグナリングの研究に非常に適しています。全胚組織の完全性を提供し、必要不可欠なシグナル伝達機構の適時発生に重要である組織の相互作用のための適切なサポート器官形成中に異なる細胞プロセスのため。全胚培養物は、移植研究、遺伝的および組織操作、ビード移植研究、毒物学的研究等のような用途の過多のためのプラットフォームを提供しているが、現在利用胚培養システムは、胚の適切な成長および維持のために血清に主に依存している文化1-9。 血清は、培養培地6-8、10、11 10〜100％の範囲の主要成分の一つとして利用されている。;しかし、血清の組成物は、明確なものではなく、動物に、動物異なり、血清が収集されるたびにすることができる。血清の実験室の準備は時間がかかり、厳しい手順が含まれますが、血清調達は、商業的に異なるロット間でかなりのばらつきを示し、実験的なコストを発生させます。これらに加え、血清は、潜在的に特定の実験の結果に影響を与えることができ、このような成長因子、ホルモン、または他のタンパク質などの未知の要因、組織の相互作用において重要なシグナル伝達分子の研究を含むことを特に含むことができる。研究は、培養物への血清の添加は潜在的にそのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）および分裂促進シグナル伝達およびホスホイノシチド3に関与するタンパク質（PI 3） -キナーゼ経路の12-14シグナルのような特定のシグナル伝達分子の細胞内レベルを変化させることができることを示している。これらとは逆に、無血清培養系は、抗原を含まない環境の利点を提供する細胞プロセスを変化させ、実験間の一貫性を可能にすることができ、生物学的に活性な酵素から禁欲。 本研究では、37℃で圧延ボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気中で培養妊娠中期段階の胚全体に市販されている幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を利用したC 15,16°。これらの定義された条件の下で16から40時間培養したマウス胚は、細胞の増殖、遊走、分化および組織の相互作用の適切なレベルを示す全体的な胚の体と、心臓、手足、脳や目などの異なる構造の形態的発展の進行を示した。眼などの複雑な器官系の1のため、培養中の胚発生の分子解析はEMBRで眼組織で観察されたものと一致するように、眼の開発を明らかにした（準備中、Kalaskarとローダーデール）の子宮内での開発ヨーヨー。したがって、私たちは、妊娠中期段階で培養したマウス胚は、 子宮内で発生中の胚で観察されたものに匹敵する進歩的な成長と形態的発展を示すことを示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

妊娠中期段階のマウス胚の酸素圧延ボトル培養系で商業的に入手可能な幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を用いて培養した。 E10.5でのマウス胚を慎重に無傷の卵黄嚢と子宮から単離し、卵黄嚢と胎児の血管の連続性を維持しながら、正確な外科的手技を含むプロセスにおいて胚をゆっくりと卵黄嚢から体外た。無傷の卵黄嚢または削除卵黄嚢を用いて調製した胚と比較して、これらの胚は、優れた生存率と同様の条件下で培養し、発生の進行を示した。我々は、これらのマウス胚は、ときに16〜40時間、37℃で95％O圧延ボトル培養装置での2/5％CO 2の雰囲気中で定義された培地で培養し、匹敵する形態学的成長と発展を示すことを示して胚は子宮内での開発。我々は目を信じるこの方法は、胚器官形成において重要なシグナル伝達相互作用を研究するために全胚培養を利用する必要が捜査のために有用である。

マウス胚の開発は子宮外子宮が受精卵を培養する時に、本 ​​体から分離された時点から開始して、複数の要因によって異なります。 図1に示されるように、手順は、身体から妊娠子宮の分離（ 図1A）、インタクトな卵黄嚢（ 図1B）を有する胚の単離、を含む一連の工程を含む、卵黄嚢からの胚の具象化（ 図1C）、および37℃でのロー...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K ビュー.  University of Georgia. 胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。 

ビデオ: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

ヒト胚性幹細胞の文化とメンテナンス

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

生物学

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

腱板断型ボトルの培養システムを使用してげっ歯類全胚培養の方法

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.