著者らは、この研究では貴重な援助のための氏スヴェン·ホルダー氏とスティーブン·コンリーに感謝したいと思います。この作品はヒース[グラント番号R00CA134920]と米国肺協会[グラント番号RG-194681-N]の国立研究所によって部分的に資金を供給された。 NinePointメディカル（株）は、この原稿に関連付けられたパブリケーション費を後援した。

1。結像系 OFDIの技術的な詳細は、4月6日以前に記載されている。円周OFDIは毎秒および円形断面画像ごとに512と2048軸深さプロファイル間25〜100フレーム間のイメージング速度で行った。本研究で使用したカスタム2.4 FR（0.8ミリメートル径）ヘリカルスキャンカテーテルは標準的な気管支のアクセスポートを介して動作するように設計されていた。カテーテルは気管支壁とシングルユースアウターシース上に光を集中させるインナー光コアで構成されていた。内核は25〜100 Hzと1.25〜5 mm /秒のプルバック速度で翻訳の間の速度で回転させながらカテーテル本体は、撮像中に静止したままであった。システムの軸方向の分解能は組織に6mmであったと7.3ミリメートル4-6の画像の範囲の深さを提供しました。カテーテルベースOFDI は 、in vivo気管支OFDI（FI で複製するために、この研究を行ったグレ1）。しかし、このプロトコルはまた、ベンチトップ型光学系（ 図3および4）でイメージングに適用してもよい。 2。セットアップイメージングシステム<ol><li>イメージングシステムの電源を入れ</li><li>撮像パラメータ（回転速度、プルバック速度、画像取得率等）を設定し、記録します。本研究で使用したOFDIイメージングシステムでは、画像は10から50 fpsで得られた。 </li><li>ロータリージャンクショ​​ンと引戻し装置にカテーテルを接続します。 </li><li>カテーテルを回転させて画質を確認してください。システムのアライメントを調整し、必要に応じてオフセット。 </li></ol> 3。組織標本<ol><li>ベンチトップに卓上使い捨て吸収パッドを配置して、パッドの上に肺標本を設定します。 </li><li>患者から手術をex vivo標本イメージング場合は、すべての切除マージン（、気管支血管、および実質マージン）は、文書化された評価、および/ ​​または病態によって削除されていることを確認するために病理部門に必ず相談してlogist。 </li><li>門での切除標本を入力し気管支気道を識別します。ボアシリンジを使用して気道内のいずれかの目に見える粘液を取り除きます。必要な場合は、気道内のより深い吸引に産んシリンジにプラスチックチューブの長いセグメントを添付してください。 </li><li>興味のある病変を識別するために、試験片の外面を触診する。 </li><li>微細な金属プローブを用いて、恐る恐る興味のある病変近くまで気管支のツリーをナビゲート。 </li><li>興味のある病変を可視または気道粘膜下に触知されるまで、プローブに沿って気道を開きます。 </li><li>慎重に綿棒を持つ病変の上に横たわって気道粘膜から血液や粘液を除去します。 </li><li>気道粘膜上OFDIカテーテルを入れ、病変が気道粘膜の根底であることを確認すると、組織学的相関のために興味のある高品質の撮像領域を識別するために画像を得る。 </li></ol> 4。マーキング組織<ol> &lt;LI&gt;ステップ3.8で前の画像所見に基づいて、気道内の関心領域を選択します。 </li><li>イメージングの目的の行に沿って組織上の2点を選択してください。ポイントは、目的の結果に応じて、気道の長手方向（ 図2）または円周（ 図3）側面のどちらかに平行であってもよい。スペースドットはこれ以上1.5センチメートル以下のものはばらばらになる組織の部分は、処理のための1つの組織型ブロックに収まる可能性があること。組織学ペア：&gt; 1.5cmの組織の長が必要な場合は、複数の長いマッチイメージングを作成するために関心領域を結んで複数1.5センチメートルに組織の長を分割します。 </li><li>罰金を浸し、色素を（トライアングルバイオサイエンス、ダーラム、ノースカロライナ州）マーキング組織に開いた穴針（ すなわち 25ゲージ7/8 &quot;長）をひっくり返した。 </li><li>慎重にのみ針穴の中に組織マーキングインクを残して、ガーゼと針の外から余分なインクを拭き取ってください。 </li><li>で気道粘膜への穿刺組織に対して垂直にイメージングのラインに沿ったポイントを選択した。 </li><li>気道粘膜上の第2の点について、手順3.5から3.3を繰り返します。 </li><li>インクが離れて穿刺部位から粘膜表面上で動作する場合は、慎重に余分なインクを除去するために、綿棒を使用しています。 </li><li>存在する場合は、綿棒で気道粘膜の表面に粘液や血液を除去する。 </li><li>インクドットを気道内に円周方向に配置されている場合、それはイメージング分野（ 図3a）で組織をフラット化して気道の二つの側面を開いて固定するのに便利です。 </li></ol> 5。イメージングティッシュ<ol><li>マークがOFDI上に表示されないよう保証するには、各インクマークとイメージ上OFDIカテーテルを置きます。マークは非常に散乱粒子を覆うと穿刺部位（ 図3b、図4a、図4g内のインクの粒子に対応する迅速な信号の減衰を、根底に持つ組織構造内の焦点混乱のように表示されます。 </stronグラム&gt;）。 </li><li>インクマーク（s）はOFDI、手順、非可視マークのための4.3から4.7に表示されていない場合。インクマークがOFDIと表示されている場合、5.3に進みます。 </li><li>カテーテル光学系は最初のインクマーク（ 図2b）を超えて組織を覆っているような気道粘膜表面上の2つのインクマークにカテーテルを平行に置きます。軽量のオブジェクトを使用してカテーテルの近位端を固定し、先端部を確保することはモーションアーチファクトを軽減することができます。 </li><li> OFDIのプルバックを収集するに進みます。 </li><li>両方のインクマークがイメージングで確認できるもので、モーションアーチファクト（ 図3、図4）をチェックするために確保するOFDIプルバック画像を見ることができます。マークが表示されていない場合は、5.4の手順5.1を繰り返します。 </li></ol> 6。ティッシュの収集と処理<ol><li>イメージングスキャンの開始、0.3 30cm離れ番目から東洋に気道粘膜組織に緑のインクドット（トライアングルバイオサイエンス、ダーラム、ノースカロライナ州）を配置イメージングのプルバック（ 図2c）で最初に登場した電子インクマーク。 </li><li> 2ブラックインクマークやグリーンインクマークを取り囲む組織を除去する。標準組織学処理カセットに適合するように組織を整える。新鮮な組織を切断することが困難である場合、組織は組織学のために組織を除去する前に固定してもよい。 </li><li>少なくとも48時間、10％ホルマリンで組織学的処理カセットと修正に置き組織。 </li><li>どんな組織学部門を通じて利用組織プロセッサにおけるプロセス組織、。 </li><li>カットのセクションでは、気道表面上の2つのブラックインクのマークに平行になるようなパラフィンで組織を埋め込む。 </li><li>インクマークのいずれかが表示されているか、全体の組織切片は、いずれか早い方、表示されるまで、パラフィンブロックに直面する組織ミクロトームを使用しています。 </li><li>一度両方の黒インクマークは、表示されている1厚さ5μmのセクションをカットし、ガラススライド上にマウントします。 </li><li>ごとに5μmの厚さの切片をカットしてマウントし続ける黒インクのマークまでは50μm、可視または組織が終了されなくなりました、いずれか早い方。 </li><li>標準ヘマトキシリン​​染色するとエオシン（H＆E）染色プロトコールとカバーグラススライドに従ってください。 </li></ol> 7。画像処理画像は卓上スキャナ、またはその両方のインクマークは、単一の断面画像で表示されていた他のスキャン技術で取得した場合、画像は直接対応する組織像と相関させることができる。体積データセットはヘリカルスキャンカテーテルで取得された場合、画像が再補間ので単一の2D画像は組織型との相関のための両方のインクマークを二分することになる必要があります。これは、ImageJのか、他の画像処理ソフトを用いて達成することができる。いくつかのインスタンスでは、インクが隣接切片/スライドを検討すべきで、その場合に容易に見えないかもしれません。

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早期の肺悪性腫瘍の評価は非常に症状や放射線学的または気管支早期の腫瘍性変化を可視化することができないことの不足のために挑戦することができます。 OFDIは組織学的分解能、広い面積リアルタイム2-6の組織微細構造の3次元ビューの近くに用意されています。気管支OFDIは肺気道11月13日 （ アニメーション ）に長い気道セグメント上で高解像度の体積のデータセットを得るために使用することができる安全な手法として患者で実証されている。しかし、わずかな生検は、肺の病理のための撮像基準の開発のためのOFDIに十分な相関を提供していないin vivo環境での組織病 ​​理学的対応として得られる。正確に肺イメージングで見OFDI機能を評価するためには、組織学的相関に正確に一致する画像を得ることが不可欠である。我々はoに、正確に1つのシンプルで効果的な方法を提示するOFDIと組織学間のNEの相関は、ほぼすべてのex vivoでの組織型にも適用可能であるのex vivo肺切除標本の気道イメージングに適用。撮像条件が一致一対一の組織学とex vivoで確立された後、これらの基準は、次にin vivoイメージングに適用することができます。 関心の撮像領域をマークするために使用される組織色素はOFDIと組織学の両方にはっきりと見える。オリエント組織に簡単なテクニックを使用することによって、インクマークは組織病理の特定可能な撮像特性を決定するためにOFDI機能と組織学的所見の一から一の比較を可能にするイメージングと組織学の両方に相関させることができる。技術は、このように多くの光学イメージングアプリケーションに役立ちながら、安価で実用的です。 生体内環境の中では、このようなレーザーマーキングなどの方法は、組織の方向25に使用されるかもしれません。しかし、t彼気管支生検の小さいサイズはまだ肺の病理のための具体的なイメージング基準を開発するためにin vivo試験で使用する際の制限要因である。 ex vivoでの研究では、in vivoイメージングへの適切な代替として機能するが、いくつかの制限があります。 エクスビボ肺標本は膨張していないとしばしば正常な肺胞構造の外観を変更し、外科的に誘発される無気肺を表示しています。ほとんどの手術肺標本は胸膜表面が検体インフレを妨害、破壊された時に病理凍結切片の評価後に受信されている組織構造の相関に関するマーキングティッシュで外科的に切除された肺組織を膨らませることは技術的に困難である。非病理学的な無気肺は 、in vivo環境の中で見られるアーティファクトでなく、したがって、この制限は 、in vivo肺イメージングにに関係ないでしょう。また、ex vivoでの試験片の血管内の血液の不足がdistinguすることが困難になる可能性が他の信号ボイド構造から血管構造をっぽい。 の in vivo の設定では 、構造上の10月/ OFDIにドップラーOCT / OFDI 26から28のほか、船舶の識別に役立つだろう。 それらが存在してex vivoでないところモーションアーチファクトは 、in vivo で見られるかもしれない。これは遅い買収率を持つ標準のOCTシステムで潜在的に問題が多いかもしれません。しかし、OFDIシステムの迅速なフレームレートは、現在のところ&gt; 200 fpsの29から31。したがって、それはモーションアーチファクトが大きな問題になることが期待されていません。 生体 OCTおよびOFDIイメージング研究の前には微イメージング機能14,15,18,19の成功の可視化を実証した。 本研究では、肺の病理学を評価するための組織ベースの診断への正確な相関関係で体積OFDIを実証している。説明する手順は、金standaとして使用されるように正確にマッチした組織像を提供することを意図しているOFDI画像の解釈のためのRD。 一度肺の病理のための具体的なイメージング基準が開発され、一致した一対一の組織学とex vivoで検証されて、基準は、イメージングの金本位アセスメントとして気管支生検の使用と生体イメージング研究の後続にも適用することができる機能が見られる。この手法は、肺切除標本への応用として表示されますが、正常および病理組織両方の微細イメージング機能を決定するために必要な組織構造の相関に正確な画像を提供するために、ほぼすべての組織型に適用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>組織マーキング染料</td><td>トライアングルメディカル</td><td> TMD-BK、TMD-G </td><td></td></tr></tbody></table>

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

黒インクマークが1の間でなければなりません - 1.5センチは離して関心の撮像領域を示すために。緑色のインクマークはオリエント標本（ 図2及び図3a）の最初の黒インクマークの前に、画像スキャンの先頭に配置する必要があります。組織インクマークがOFDIイメージングと組織学（ 図3、図4）の両方で表示されるはずです。通常の豚（ 図3）、ヒト気道（ 図4）では、典型的な気道の階層化が見えるはずです。上皮（E）は、気道の内腔の側面に薄い、適度に信号高密度、均一な層として表示されます。粘膜固有層は、エラスチンとコラーゲン（EL）を含む信号の強い結合組織などの粘膜固有層（LP）の様々なコンポーネントに対応する組織、および信号貧しい唾液型腺組織（G - 貧しい人々を合図するために組織化された信号強烈で構成されています）。 respiを横断する可視信号貧しいダクト（D）が時折ありますratory上皮は気管支内腔に接続することができます。平滑筋は不連続、散在する平滑筋束のように表示されますので、OFDIで特定することはできません。上の表在密弾性とコラーゲン組織が ​​、深い青色の基礎となる平滑筋現れるトリクロームH＆Eとトリクローム染色、気道の階層化されます（ 図3C、3D、3F、3G、4B、4C、4E、4Fの ）可視化することができ、上汚れ赤（SM）。軟骨リング（C）は、豚気道にオーバーラップし、ヒト気道に重ならないように明確に定義された境界を持つ信号貧しい三日月形の構造として表示されます。軟骨のリングを囲む軟骨膜は、信号貧しい軟骨リングを取り囲む信号激しい組織の薄い層として表示されます。で末梢気道人間（ 図4グラムと4H）、歯槽添付ファイル（A）は、信号ボイド肺胞腔を備えた細い信号激しい格子状の肺胞壁のように見える。粘膜固有層内の血管のスペースはV軽度の基礎となるシャドウ·アーティファクト（矢印）を持つ信号のボイド状または環状構造などisible。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> 図1。豚気道のOFDI。機械換気下豚気道から得られた体内画像で 。近位気道の（a）はODFI断面。末梢気道の（b）のOFDIの断面。近位気道の（c）にODFI縦断面、赤いハイライト領域でのパネルeの高倍率の画像。末梢気道の（d）にOFDI縦断面図、緑色で強調表示領域でのパネルeの高倍率の画像。近位から遠位への気道の（e）のODFI縦断面図（左から右）。カテーテルの直径は0.8mmであり、目盛りは0.5mm刻みを表します。気道壁と歯槽添付ファイルの異なる層がOFDI画像で識別可能であるが、それは正確な解剖学的協力を解釈することは困難で直接登録することなく、組織学OFDI信号のrrelate。 E：上皮、LP：粘膜固有層、SM：粘膜下層、C：軟骨、：歯槽添付。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> 図2。豚気道のマーキング組織が ​​あり、（a）1.5センチは離して気道の長手方向の側面に平行に配置された管腔の表面上の2つのブラックインクマークで気道を開いた。 （b）の二つの黒いインクの上に置かOFDIカテーテルはOFDIのプルバック内符の両方が含まれるようにマークします。オリエントへの追加緑色インクマーク試料上イメージングスキャンの開始と（c）の気道。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> 図3。正確なCORを示す豚気道のOFDIと組織学マーキング組織を使用して関係が。（）気道の周側面に平行に配置腔側表面上の2つのブラックインクマークで気道を開いた。ピンはさらに気道（矢印）を開くために使用されます。両方のインクが見えるマークと（b）の豚気道のOFDIは（アスタリスク）と（c）は正確に相関して組織像はH＆Eで染色（アスタリスク：黒インクが気道上皮に見えるマーク）と（d）の相関は、汚れトリクローム。スケールバー：2ミリメートル。 （f）に対応する組織像はH＆Eで染色及び（g）の相関トリクローム染色とOFDI画像の（e）の高倍率を表示します。 E：気道上皮、EL：濃厚コラーゲンと弾性組織、SM：平滑筋、C：軟骨リング（組織学的アーティファクトは軟骨リングの人工的な分離をもたらした）、G：唾液腺組織、D：上皮を入力唾液管。スケールバー：250μmである。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> 図4。ヒト気道のOFDIと組織学は、マーキング組織を使用して正確な相関性を示している。（a）の両方のインクを用いてヒト近位気道のOFDIは（アスタリスク）は、可視マーク。黒インクで、H＆Eと（b）を正確に相関して組織型ステンドは、気道上皮（アスタリスク）で表示されるマークと、（c）相関三重染色。スケールバー：2ミリメートル。 （d）はOFDI画像の高倍率図、（e）の対応する組織像はH＆Eと（f）はクロームで染色した。スケールバー：250μmである。 E：気道上皮、LP：粘膜固有層、G：唾液腺組織は、C：軟骨リング、PC：軟骨膜。ヒト気道では、典型的なレイヤリングが見えるようになります。疎性結合組織の中では、赤染色平滑筋の束（SM、パネルCおよびF）が散在している、連続的なバンドを形成しないので、OFDI内の個別の層として表示されていないかどちら。 （g）ヒト末梢気道や呼吸上皮（アスタリスク）で表示される黒インクマークの付いた（h）を正確に相関し、H＆E組織学のOFDI。スケールバー：2ミリメートル。歯槽添付ファイル（A）は、信号のvoid歯槽スペースを持つ信号強烈な格子状の肺胞の壁のように見える。粘膜固有層内の血管のスペースは、根本的な軽度のシャドウイング（矢印）を持つ信号の空隙構造のように見える。

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

画像への方法<em&gt; ex vivoで</em&gt;光周波数領域イメージング（OFDI）と肺切除標本と組織学への正確な相関を得るが、肺病理のための特定のOFDIの解釈基準を開発するために不可欠である、記載されている。この方法では、正確な画像の解釈と評価のための組織構造相関に正確な画像を得るために他の組織型とイメージング技術に適用可能である。この手法で確立イメージング基準は、将来における画像評価に応用できるでしょう<em生体内で&gt;</em&gt;研究。

の光周波数領域イメージング<em&gt;エクスビボ</em&gt;肺切除標本：組織病理相関へのOne to Oneイメージの入手

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

optical-frequency-domain-imaging-ex-vivo-pulmonary-resection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K ビュー.  Harvard Medical School. 画像への方法 ex vivoで光周波数領域イメージング（OFDI）と肺切除標本と組織学への正確な相関を得るが、肺病理のための特定のOFDIの解釈基準を開発するために不可欠である、記載されている。この方法では、正確な画像の解釈と評価のための組織構造相関に正確な画像を得るために他の組織型とイメージング技術に適用可能である。この手法?...

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

統合された光音響眼底検査とスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

1分Porphysomesを使用してサブワンワット光熱腫瘍焼灼、真性多機能ナノベシクル

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

の使用<em&gt;生体外</em&gt;チャンドラーループ装置は、改質ポリマー血液導管の生体適合性を評価するための

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

破壊を使用してデジタル画像相関法を試験中に死体大腿骨皮質系統を推定する方法

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...