Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Sven Holder e Sr. Stephen Conley por sua inestimável ajuda neste estudo. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Heath [número Grant R00CA134920] e da American Lung Association [número Grant RG-194681-N]. NinePoint Medical Inc. patrocinou os custos de publicação associada a este manuscrito.

1. Imaging System Os pormenores técnicos da OFDI foram descritos anteriormente 4-6. OFDI circunferencial foi conduzido a uma velocidade de imagem, entre 25 e 100 imagens por segundo, e entre 512 e 2048 perfis de profundidade axial por imagem da secção transversal circular. Costume 2,4 Fr (0,8 mm de diâmetro) cateteres exploração helicoidal utilizados neste estudo foram concebidos para funcionar através da porta de acesso do broncoscópio padrão. Os cateteres consistiam de um núcleo interior óptico para focar a luz para a parede brônquica e uma bainha exterior de utilização única. O corpo do cateter permanece estacionária durante o exame, enquanto que o núcleo interno foi feito rodar a uma velocidade entre 25 e 100 Hz e traduzida, a uma velocidade de recuo entre 1,25 e 5 mm / seg. A resolução axial do sistema era de 6 mm de tecido e forneceu uma imagem profundidade que varia de 7,3 milímetros 4-6. Cateter baseada OFDI foi realizada neste estudo para replicar in vivo broncoscópica OFDI (Figura 1). No entanto, este protocolo pode também ser aplicado à geração de imagens com um sistema de bancada óptica (Figura 3 e 4). 2. Imaging System Set-up <ol><li> Ligue sistema de imagem </li><li> Definir e registrar os parâmetros de imagem (velocidade de rotação, velocidade de recuo, taxa de aquisição de imagem, etc.) Para o sistema de imagem OFDI utilizada neste estudo, foram obtidas imagens de 10-50 fps. </li><li> Anexar cateter de junção rotativa e um dispositivo de retirada. </li><li> Girar cateter e verificar a qualidade de imagem. Ajustar o alinhamento do sistema de deslocamento e, se necessário. </li></ol> 3. Preparação de Tecidos <ol><li> Coloque uma mesa almofada absorvente descartável na bancada e amostras de pulmão conjunto na almofada. </li><li> Se a imagem de um espécime vivo cirúrgica ex de um paciente, não se esqueça de consultar o departamento de patologia para garantir que todas as margens de ressecção (margens brônquicas, vascular e parênquima) foram avaliados, documentados e / ou removido por um patoLogist. </li><li> Identificar as vias respiratórias brônquica entrar no espécime ressecção no hilo. Remova qualquer muco visível dentro da via aérea, utilizando uma seringa furo. Se necessário, instale um longo segmento de tubos de plástico para a seringa deu a aspiração mais profunda dentro da via aérea. </li><li> Apalpar a superfície exterior da amostra para identificar a lesão de interesse. </li><li> Usando uma sonda de metal fino, cautelosamente navegar pela árvore brônquica até perto da lesão de interesse. </li><li> Abrir as vias aéreas ao longo da sonda, até a lesão do interesse é visível ou palpável sob a mucosa das vias aéreas. </li><li> Remova cuidadosamente qualquer sangue ou muco da mucosa das vias aéreas que recobre a lesão com um aplicador com ponta de algodão. </li><li> Colocar o cateter OFDI acima da mucosa das vias aéreas e de obter uma imagem para confirmar a lesão é subjacente à mucosa das vias aéreas e para identificar uma região de imagem de alta qualidade de interesse para a correlação de histologia. </li></ol> 4. Tecido Marcação <ol> &lt;li&gt; Selecione a região de interesse na via aérea com base em achados anteriores em Passo 3.8. </li><li> Escolha dois pontos sobre o tecido ao longo da linha desejada de imagem. Os pontos podem ser paralelas, quer ao longitudinal (Figura 2) ou circunferencial aspecto (Figura 3) das vias aéreas, dependendo dos resultados desejados. Pontos espaciais não mais do que 1,5 cm, de modo que a porção de tecido pode caber em um bloco de histologia para processamento. Se um comprimento de tecido&gt; 1,5 cm é necessário, em seguida, dividir a extensão de tecido em vários 1,5 cm de comprimento com tinta regiões de interesse para criar imagens combinados múltipla: pares de histologia. </li><li> Mergulhe uma ponta fina agulha furo aberto (ou seja calibre 25 7/8 &quot;de comprimento) para o tecido marcação corante (Triângulo Ciências Biomédicas, Durham, NC). </li><li> Limpar cuidadosamente o excesso de tinta para fora da parte externa da agulha com uma gaze, deixando apenas a marcação de tinta de tecido no interior da agulha de orifício. </li><li> Perfurar o tecido perpendicular à mucosa das vias aéreas noponto escolhido ao longo da linha de imagem. </li><li> Repita os passos de 3,3-3,5 para o segundo ponto sobre a mucosa das vias aéreas. </li><li> Se a tinta corre ao longo da superfície da mucosa para longe do local de punção, utilizar um aplicador derrubado algodão para remover cuidadosamente o excesso de tinta. </li><li> Remover o muco ou sangue na superfície da mucosa das vias aéreas com um algodão aplicador derrubado, se presente. </li><li> Se os pontos de tinta são colocados circunferencialmente dentro da via aérea, é útil para o pino aberto nos dois lados da via aérea para achatar o tecido no campo de imagem (Figura 3a). </li></ol> 5. Tecido de imagem <ol><li> Coloque o cateter OFDI sobre cada marca de tinta e de imagem para assegurar as marcas são visíveis em OFDI. Marcas devem aparecer como rupturas focais dentro da estrutura do tecido com partículas altamente espalhamento sobrejacente e subjacente a atenuação de sinal rápida, a qual corresponde às partículas de tinta no interior do local de punção (Figura 3b, a figura 4a, Figura 4g </strong&gt;). </li><li> Se a tinta marca (s) não são visíveis na OFDI, repita os passos de 4,3-4,7 para as marcas não visíveis. Se as marcas de tinta são visíveis com OFDI, vá para o passo 5.3. </li><li> Colocar o cateter paralelo para as duas marcas de tinta sobre a superfície da mucosa das vias aéreas, tais que a óptica de cateter se sobrepor a tecido para além da marca de tinta primeiro (Figura 2b). A ancoragem da extremidade proximal do cateter com um objeto leve e fixando a extremidade distai pode ajudar a reduzir os artefactos de movimento. </li><li> Proceder com a coleta de um pullback OFDI. </li><li> Veja as imagens retirada OFDI para garantir ambas as marcas de tinta são visíveis na imagem e para verificar artefatos de movimento (Figura 3 e Figura 4). Se as marcas não são visíveis, repita os passos de 5,1-5,4. </li></ol> 6. Coleta e processamento de tecidos <ol><li> Coloque uma tinta verde dot (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) sobre o tecido das vias respiratórias da mucosa para orientar o início do exame de imagem, 0,3 cm de distância do thmarca e tinta que apareceu primeiro na retirada de imagem (Figura 2c). </li><li> Remover o tecido que engloba as duas marcas de tinta preta e marca de tinta verde. Apare tecido para caber em um cassete padrão histologia processamento. No caso de corte de tecido fresco é difícil, em seguida, o tecido pode ser fixado antes da remoção do tecido para exame histológico. </li><li> Tecidos lugar em um cassete de processamento histologia e correção em formalina a 10% por pelo menos 48 horas. </li><li> Tecidos processo em um processador de tecidos, disponível através de qualquer departamento de histologia. </li><li> Incorporar tecido em parafina de tal modo que as secções de corte será paralelo às duas marcas de tinta preta na superfície das vias aéreas. </li><li> Use um micrótomo de tecido para enfrentar o bloco de parafina até que uma marca de tinta é visível ou a secção de tecido inteiro é visível, o que ocorrer primeiro. </li><li> Uma vez que ambas as marcas de tinta preta são visíveis, cortar uma secção de 5 um de espessura e montar sobre uma lâmina de vidro. </li><li> Continuar a cortar e montar 5 um de espessura cada50 mm até as marcas de tinta preta não são mais visíveis ou as extremidades do tecido, o que ocorrer primeiro. </li><li> Siga padrão hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração protocolos para manchar e slides lamela. </li></ol> 7. Processamento de Imagem Se as imagens foram obtidas com um digitalizador de bancada, ou outra técnica de exploração em que ambas as marcas de tinta eram visíveis em uma imagem em corte transversal único, em seguida, a imagem pode ser directamente correlacionada com a histologia correspondente. Se dados volumétricos foram adquiridos com um cateter de varredura helicoidal, as imagens terão de ser re-interpolada, de modo que uma única imagem 2D corta ambas as marcas de tinta para a correlação com a histologia. Isto pode ser conseguido usando ImageJ ou outro software de processamento de imagem. Em alguns exemplos, a tinta pode não ser facilmente visível, caso em que as secções adjacentes / slides devem ser examinadas.

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Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela NinePoint Medical Inc.

Avaliação de neoplasias malignas pulmonares iniciais pode ser extremamente difícil devido à falta de sintomas e incapacidade de visualizar iniciais de alterações neoplásicas radiologicamente ou broncoscopia. OFDI fornece perto histológica resolução, grande área 3-dimensional vista microestrutura do tecido em tempo real 2-6. Endobrônquica OFDI tem sido demonstrada em pacientes como uma técnica segura, que pode ser usada para obter os conjuntos de dados de alta resolução volumétricas mais longos segmentos das vias aéreas na via aérea pulmonar 11-13 (Animação). No entanto, apenas pequenas biópsias são obtidas como contrapartes histopatológicas no in vivo configuração, que não proporcionam correlatos adequados para OFDI para o desenvolvimento de critérios de imagiologia para a patologia pulmonar. A fim de avaliar com precisão as características OFDI visto na imagem pulmonar, que é essencial para a obtenção da imagem precisamente de acordo com a correlação da histologia. Apresenta-se um método simples e eficaz para precisão, um para one correlação entre OFDI e histologia aplicada nas vias aéreas de imagiologia ex vivo amostras de ressecção pulmonar, que é aplicável a quase qualquer tipo de tecido ex vivo. Uma vez que os critérios de imagiologia foram estabelecidas ex vivo com correspondência histologia um-para-um, estes critérios podem então ser aplicada a imagem in vivo. O corante do tecido usado para marcar a região de imagem de interesse é claramente visível em ambos OFDI e histologia. Usando técnicas simples de orientar o tecido, marcas de tinta pode ser correlacionado tanto em imagem e histologia para permitir 1-1 comparações das características OFDI e descobertas histológicas para determinar as características de imagem de identificação do tecido da patologia. A técnica é barato e prático, tornando-se assim útil em muitas aplicações de imagem ópticos. Na configuração em vivo, tais como os métodos de marcação a laser pode ser utilizado para a orientação do tecido 25. No entanto, tele pequeno tamanho da biópsia brônquica ainda é um fator limitante na utilização de estudos in vivo para desenvolver critérios de imagem específicos para a patologia pulmonar. Embora estudos ex vivo servir como uma alternativa adequada para imagem in vivo, existem algumas limitações. Espécimes pulmonares ex vivo são uninflated e muitas vezes exibir atelectasia cirurgicamente induzida, o que altera a aparência de estruturas alveolares normais. Inflando tecido pulmonar cirurgicamente ressecada com tecido marcação para correlação histologia é tecnicamente desafiador como a maioria dos espécimes pulmonares cirúrgicas são recebidos após avaliação seção patologia congelado durante o qual a superfície pleural é interrompido, interferindo com a inflação espécime. Não-patológica atelectasia não é um artefato visto no na definição vivo, portanto, essa limitação não seria pertinente na imagem pulmonar vivo. Além disso, a falta de sangue dentro dos vasos em amostras ex vivo pode tornar difícil a distinguish estruturas vasculares a partir de estruturas de vazios de outros sinais. Na configuração em vivo, a adição de Doppler OCT / OFDI 26-28 de outubro estrutural / OFDI iria ajudar na identificação dos navios. Artefactos de movimento pode ser observado in vivo em que eles não são ex vivo presente. Isto poderia ser potencialmente problemáticos na norma outubro sistemas com taxas mais lentas de aquisição. No entanto, as taxas de quadro rápidas de sistemas OFDI atualmente&gt; 200 fps 29-31. Assim, não se espera que artefacto de movimento irá ser um problema significativo. Anterior, em outubro vivo e estudos de imagem OFDI demonstraram visualização bem-sucedida de recursos de imagem finas 14,15,18,19. Neste estudo nós demonstramos OFDI volumétrico com correlação precisa de tecido baseado diagnóstico para avaliar patologia pulmonar. O processo descrito destina-se a fornecer histologia combinados com precisão para ser usada como o ouro Standaª para a interpretação da imagem OFDI. Critérios de imagem uma vez específicos para a patologia pulmonar, foram desenvolvidos e validados ex vivo com correspondência histologia um-para-um, os critérios podem então ser aplicada para subsequente estudos in vivo de imagens com o uso de uma biópsia brônquica como uma avaliação padrão de ouro da imagiologia Características visto. Esta técnica é apresentada como uma aplicação para amostras de ressecção pulmonar, mas pode ser aplicado a praticamente qualquer tipo de tecido para proporcionar a imagem precisa de histologia correlação necessários para determinar as características de imagem finas de tecidos normais e patológicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tintura do tecido marcação </td><td> Triângulo Biomédica </td><td> DTM-BK, DTM-G </td><td></td></tr></tbody></table>

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

As marcas de tinta preta deve estar entre 1 - 1,5 cm para além de indicar a região de imagem de interesse. A marca de tinta verde deve ser colocado no início da análise de imagem, antes da primeira marca de tinta preta para orientar o espécime (Figura 2 e Figura 3a). Marcas de tinta de tecido devem ser visíveis em ambos OFDI imagem e histologia (Figura 3 e 4). Em porcos normais (Figura 3) e das vias respiratórias humanas (Figura 4), ​​em camadas da via aérea normal deve ser visível. O epitélio (E) é visível como uma fina camada de sinalizar moderadamente densa e homogénea no aspecto luminal das vias respiratórias. A lâmina própria consiste organizada sinal intenso de sinal pobre em tecido, correspondendo a vários componentes da lâmina própria (LP), tais como os tecidos conjuntivos de sinais intensos incluindo elastina e colagénio (EL), eo tecido salivar sinal de tipo glandular pobre (G ). Há canais de sinal ocasionalmente visíveis pobres (D) que atravessam a respiepitélio respiratório para se conectar com a luz brônquica. O músculo liso aparece como descontínuas, intercaladas fascículos musculares lisas e não é, portanto, na identificação OFDI. Na H &amp; E e manchas tricrômicos, camadas das vias aéreas pode ser visualizado (figura 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e e 4f), em que em tricromo superficiais densos tecidos elásticos e colagenosa aparecer azul profundo e o músculo subjacente suave manchas vermelhas (SM). Anéis cartilaginosos (C) aparecem como um sinal fraco em forma de crescente estruturas com limites bem definidos, que se sobrepõem nas vias aéreas suína e não se sobrepõem nas vias respiratórias humanas. O pericôndrio em torno dos anéis de cartilagem aparece como uma fina camada de tecido forte de sinal do sinal englobando os anéis de cartilagem pobres. No periférico humano das vias aéreas (figura 4g e 4h), ligações alveolares (A) são visíveis como finas, sinal intenso lattice-como paredes alveolares com espaços vazios de sinal alveolares. Espaços vasculares no interior da lâmina própria são visible como estruturas de sinal vazio linear ou circular com artefato sombreamento leve subjacente (setas). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> Figura 1. OFDI de suínos das vias aéreas. Nas imagens in vivo obtidos a partir de uma das vias respiratórias de suínos em ventilação mecânica. (A) ODFI secção transversal da via aérea proximal. (B) OFDI secção transversal da via aérea distal. (C) seção longitudinal da via aérea ODFI proximal, imagem maior ampliação do painel e na região destacado em vermelho. (D) seção longitudinal OFDI de via aérea distal, imagem maior ampliação de e painel na região destacada verde. (E) seção longitudinal ODFI das vias respiratórias de proximal para distal (esquerda para direita). Diâmetro do cateter é de 0,8 mm e marcas de escala representam incrementos de 0,5 mm. Embora diferentes camadas da parede das vias aéreas e ligações alveolares são discerníveis nas imagens OFDI, é difícil de interpretar precisamente o co anatómicarrelate dos sinais OFDI sem histologia directamente registadas. e: lp epitélio,: lâmina própria, sm: submucosa, c: cartilagem, um: ligações alveolares. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> Figura 2. Marcação de tecido das vias respiratórias de suínos. (A) das vias aéreas aberta com duas marcas de tinta preta na superfície luminal colocada paralelamente à face longitudinal da via aérea, a 1,5 cm de distância. (B) OFDI cateter colocado sobre duas marcas de tinta preta de modo a incluir ambas as marcas dentro do recuo OFDI. (C) das vias aéreas com marca de tinta verde adicional para orientar o início da análise de imagem do espécime. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> Figura 3. OFDI e histologia suína vias aéreas demonstrando cor precisorelação usando tecido de marcação. (a) das vias aéreas aberta com duas marcas de tinta preta na superfície luminal colocada paralelamente à face periférica da via aérea. Pinos são utilizados para abrir ainda mais as vias aéreas (setas). (B) OFDI de suíno vias aéreas com a tinta marca visível (asteriscos) com (c) manchado histologia precisamente correlacionada com H &amp; E (asteriscos: tinta preta marca visível no epitélio respiratório) e (d) correlacionada tricromo. Barra de escala: 2 mm. (E) Maior aumento de vista OFDI imagem com (f) histologia correspondente corados com H &amp; E e (g) correlacionada tricrômico. E: epitélio respiratório, EL: colagénio denso e tecidos elásticos, SM: músculo liso, C: anéis de cartilagem (artefato histológica resultou na separação artificial dos anéis de cartilagem), G: tecido da glândula salivar, D: ducto salivar entrar epitélio. Barra de escala: 250 m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> Figura 4. OFDI e histologia vias respiratórias humanas demonstrando correlação precisa usar tecido de marcação. (A) OFDI da via aérea proximal humano com a tinta marca visível (asteriscos). (B) histologia corado Precisamente correlacionada com H &amp; E, com tinta preta marca visível no epitélio respiratório (asteriscos) e (c) correlacionada tricromo. Barra de escala: 2 mm. (D) exibição de imagem Maior ampliação OFDI e (e) histologia correspondente corados com H &amp; E e (f) tricromo. Barra de escala: 250 m. E: epitélio respiratório, LP: lâmina própria, G: tecido da glândula salivar, C: anéis cartilaginosos, PC: pericôndrio. Nas vias respiratórias humanas, em camadas típica é visível. Dentro do tecido conjuntivo frouxo, não são intercaladas fascículos de coloração vermelho-do músculo liso (SM, painéis c e f), Que não formam uma banda contínua e, assim, não são visíveis como uma camada distinta no OFDI. (G) OFDI de via aérea distal humana e (h) precisamente correlacionada histologia H &amp; E, com marcas de tinta preta visíveis no epitélio respiratório (asteriscos). Barra de escala: 2 mm. Ligações alveolares (A) são visíveis como sinal intenso lattice-como paredes alveolares com espaços alveolares sinal vazio. Espaços vasculares no interior da lâmina própria também são visíveis como sinal de vácuo-estruturas com sombreamento ligeiro subjacente (setas).

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Um método para a imagem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Espécimes de ressecção pulmonar com óptica no domínio da frequência de imagem (OFDI) e obter correlação precisa de histologia é descrito, o que é essencial para o desenvolvimento de critérios de interpretação específicos para OFDI patologia pulmonar. Este método é aplicável a outros tipos de tecidos e técnicas de imagiologia para obter imagens precisas para correlação histológica para a interpretação de imagens precisas e avaliação. Critérios de imagem criados com esta técnica, então, seria aplicável à avaliação de imagem no futuro<em&gt; In vivo</em&gt; Estudos.

Imagem Domínio óptico Freqüência de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonares espécimes de ressecção: Obtenção de One to One Imagem para Histopatologia Correlação

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

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Bioengineering

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K visualizações.  Harvard Medical School. Um método para a imagem Ex vivo Espécimes de ressecção pulmonar com óptica no domínio da frequência de imagem (OFDI) e obter correlação precisa de histologia é descrito, o que é essencial para o desenvolvimento de critérios de interpretação específicos para OFDI patologia pulmonar. Este método é aplicável a outros tipos de tecidos e técnicas de imagiologia para obter imagens precisas para correlação histológica para a interpretação d...

Vídeo: Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bioengenharia

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Oftalmoscopia Fotoacústica integrada e Spectral-domínio Tomografia de Coerência Óptica

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

O uso do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler Circuito Aparelho para avaliar a biocompatibilidade de Modificados Condutas sangue Poliméricos

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Um método para estimar cepas Cortical de fêmur cadavérico durante fratura testes usando a correlação de imagem Digital

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...