腫瘍微小環境における免疫細胞の空間的組織は臨床的価値を有する。この戦略は、腫瘍組織内の免疫細胞の可視化、定量化、マッピングに容易に使用できます。免疫療法はがん治療に革命をもたらしています。
しかし、すべての患者がうまく反応するわけではありません。この戦略は、良好な抗腫瘍応答を予測できる組織免疫シグネチャを定義するのに役立つ可能性があります。実験を行う前に、抗体の組み合わせとストリップ技術を対照組織でテストし、ApPが目的のマーカーの検出に正確であることを確認します。
画像解析法の記述は、洗練された技術言語を使用して、テキストとビデオを組み合わせることで、方法論のより良い理解と複製を容易にします。ホルマリン固定のパラフィン埋め込み腫瘍組織切片の抗原検索のために、脱ワックス組織サンプルを抗原検索溶液のコプリン瓶に浸し、蛇口水を含む電気圧力鍋に瓶を入れる。水位は、水が抗原の検索溶液と混合しないように、瓶の高さの半分を超えてはならない。
調理器の蓋と圧力弁を閉じ、スライドを高圧で10分間処理します。処理の最後に、調理器具を抜き、圧力を解放し、蓋を開けます。スライドが調理器で30分間冷却された後、新しいコプリン瓶で洗浄ごとに新鮮なPBSでサンプルを5分間2回洗浄し、疎水性ペンを使用して各組織セクションの周りに障壁を描きます。
次に、スライドをPBSで15分間PBSに浸し、スライドをPBSで2回リンスする。2回目の洗浄後、スライドを湿度チャンバに移し、各組織セクションをブロッキング溶液で覆います。室温で30分後、洗浄ごとに新鮮なPBS-Tweenでセクションを5分間2回洗い流し、対象となる一次抗体をブロッキング溶液に希釈して、各スライドに加え、光から保護します。
インキュベーションの終わりに、新鮮なPBS-Tweenで1回5分間スライドを洗い流し、そのセクションに室温で1時間適切な二次抗体をラベル付けします。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBS-Tweenでスライドを1回5分間洗い流します。二重蒸留水で単一のすすいで従ってください。
各スライドから余分な水を取り除き、DAPIとカバースライドで補充された取り付け媒体で組織を取り付けます。余分な取り付け媒体を絞り出した後、スライドを室温で20分間乾燥させ、光から保護してから、スライド全体のスキャナを使用してすべてのチャンネルの画像を取得します。スキャン後、画像解析ソフトウェアで画像を開き、[組織配置]タブをクリックします。
位置合わせするイメージをスライド トレイに読み込むには、データベースから最初に整列するイメージを選択します。すべてのイメージが読み込まれたら、ワークフローステップで「次へ」をクリックして画像をリンクし、位置合わせするすべての画像を最初の画像にドラッグアンドドロップします。すべての画像が適切にリンクされている場合は、リンクされた画像内の相同組織の特徴を示す画像ごとに最低3つのピンを使用します。
ピンを使用して最初の画像をトレースし、結果として得られる線形の品質を確認します。適切な位置合わせが得られたら、[次へ] をクリックして画像レイヤーを表示し、複合画像をデータベースに保存します。ユーザー定義プロトコル APP 1 を使用して組織検出を実行するには、[画像解析] タブを開き、画像解析モジュールで合成画像を開きます。
[APP を開く] アイコンをクリックし、適切な APP を選択します。APP が動作していることを確認するには、選択した組織の場所に移動し、[プレビュー] をクリックします。結果が満足のいく場合は、選択した APP を使用して画像を処理する] をクリックします。
処理中、APPは、すべての組織関連ピクセルを対象領域に変換できるように、ピクセルが組織に関連しているかどうかを判断します。新しく作成された対象領域は、整列した任意の画像に転送できます。解析の最後で、[ファイルと保存]をクリックして、変更した画像を新しく作成した対象領域と共に保存します。
組織を間質およびパンキマに分節する場合は、[画像解析]タブを開き、データベースから目的のファイルを選択します。開いているAPP 2、APP 2はティッシュのセグメンテーションのためのPSR染色されたイメージを使用する。選択した視野で画像を処理して、APP 2をプレビューします。
結果が満足のいくものであれば、[実行] をクリックして、完全なイメージで APP 2 を処理します。組織の関心領域は、間質およびパレンチマにセグメント化され、それぞれの領域が決定される。新しく作成されたストロマとパレンチマの関心領域を整列した画像に転送し、変更された画像をエクスポートして保存します。
対象の細胞集団を特定して定量化するには、対象のセグメント化された画像を画像分析モジュールにインポートします。色を調整したら、APP 3を開きます。APP 3は、関心のある細胞集団を検出し、パレンチマと間質内でそれらを定量化します。
結果が満足のいくものであれば、完全なイメージで APP 3 を実行します。関心のある個々の細胞はすべて、それらの組織座標が保存され、そして、間質および小さな領域における対象細胞の密度が決定される。変更した画像は、実例どおりに保存できます。
関心のある細胞ラベルオブジェクトの組織ヒートマッピングを実行するには、APP 選択ウィンドウで適切なユーザー定義プロトコルを開き、[実行]をクリックして、抗体標識オブジェクトの座標を使用してヒート マップを生成するよう APP に求めます。赤でハイライト表示されたホット スポット領域には、対象となるセルの人口密度が最も高く、濃い青色の領域が最も低い領域が含まれています。特定の細胞集団のヒートマップを整列画像に重ね合わせ、腫瘍微小環境内で細胞がどのように組織されているかに関する追加情報を提供することができる。
その後、組織ヒートマップをエクスポートして保存します。ラベリングの特異性、設計された APPs の精度、および同じセクション上の異なる汚れの除去と再確認の効率を確認することが重要です。連続イメージング、シーケンシャルラベリング、組織アライメントを統合することで、より多くのマーカーを同時に可視化することができ、限られた臨床検体からより多くの情報を抽出することができます。
切除された腫瘍組織切片のH&E染色により、組織アーキテクチャ、細胞形態、悪性腫瘍の種類、腫瘍グレード、および全体的な免疫浸潤などの臨床的に関連するパラメータの評価が可能になります。CD34染色は、内皮細胞の検出を可能にする。サイトケラチン8/18染色は上皮細胞の存在を明らかにし、抗α平滑筋アクチン染色は線維原性、活性化された、肝星状細胞の同定を可能にする。
CD68およびデスミンに対する抗体による再確認は、それぞれマクロファージおよび筋線維芽細胞の検出を可能にする。腫瘍免疫浸潤をより良く特徴付けるために、T細胞マーカーおよびミエロペルオキシダーゼの染色を行うことができる。ピクロシリウスレッド染色は、線維素体コラーゲンを可視化し、間質およびパレンチマのセグメンテーションを容易にするためにも行うことができる。
染色されたセクション内の組織関連ピクセルは、関心のある特定の領域内の異なる区画のセグメンテーションを可能にするために同定することができる。その後、対象となる細胞集団を各領域内で同定し、特定の細胞集団の高密度領域をホットスポットとして表示し、比較的密度の低い領域をコールドスポットとして表示する組織マップを生成することができます。組織サンプル内の免疫細胞を同定、定量、マッピングするためのこの方法論は、特定の研究課題および関心マーカーに適合し、検証することができる。
この戦略は、高スループット分析のために組織マイクロアレイに適用できます。また、その場合のハイブリダイゼーションと組み合わせて、その場合のタンパク質と遺伝子発現を同時に調べることもできます。この戦略を用いて、患者の線維化肝組織のIL-17A産生細胞をその際に同定し、マッピングしました。
プロトコルに示されているように、いくつかの試薬は化学的に危険であり、関連する手順は適切な個人的な保護具および予防措置を使用して化学フードで行われるべきである。
