博士 Arnulfo メンドーサ プーマ技術のトレーニングを提供者に感謝したいと思います。 さらに、この研究の過程で、顕微鏡の使用を提供するため夫妻チャンド khanna 博士、スーザン ガーフィールド (NCI/NIH) とサム アパリシオ (紀元前がん庁) を確認したいと思います。この研究は、癌研究、小児腫瘍学の支部センター国立歯科衛生研究の学内研究プログラムによって (の一部) に支えられました。M.M.L.、国家機関の健康学内研究員の研修 (15335 賞)、によって支えられた、現在転移研究のジョアン ・ パーカー交わりに支えられています。P.H.S. は、ブリティッシュ コロンビア州がん財団によってサポートされます。

画像データが得られた動物のすべてのプロトコルを動物愛護や国立がん研究所の利用委員会、国立衛生研究所の承認を得て行った。説明ビデオの資料に描かれているすべての動物プロトコルは、ブリティッシュ コロンビア大学動物の世話委員会によって承認されています。
1. 注入とプーマのモデルのための材料の腫瘍細胞の準備
注: ソリューションおよび細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。メディアのレシピは、表 1と表 2を参照してください。
<ol><li>中古 A メディア 37 oC の水のお風呂に 15 mL の円錐管に 5 mL を温めます。</li>
	<li>1.2% 低融点アガロース ソリューション (滅菌水) ラボ電子レンジを使用してを溶かします。</li>
	<li>溶融 agarose の 5 mL を 15 mL の円錐管に転送し、37 oC の水浴で保温します。37 oC と肺吸入工程の前に液体に溶かしたアガロースを確認します。</li>
	<li>細胞培養グレード氷バケットに 1 X ペン/球菌を添加した PBS の事前チル 30 mL。</li>
	<li>6 ウェル プレートの 1 つも前 B メディアの 1.5 mL でゼラチン スポンジを浸しなさい。スポンジは、肺のスライスのアンカーをサポートになります。</li>
	<li>OS 細胞が約 70-90% を確保する手術の日に合流。過剰合流またはメディアがオレンジから黄色のセルは通常を強調している、この時点での生存率を減少しているので、電池は使用しないでください。骨肉腫細胞株, MNNG、HOS、100 μ L のボリュームで 5 × 105 1 マウスの尾静脈に注入する使用されます。それに応じての高級以上のマウスを研究に使用する場合。</li>
	<li>0.25% トリプシン-EDTA (3 mL T75 フラスコまたは 10 cm の培養皿で 2 mL) を使用して腫瘍細胞を収穫します。セルは、プレートから持ち上げて始めている、完全なメディアとトリプシン-EDTA を中和します。スピン ・ ダウン細胞と細胞培養グレード PBS で一度すすいでください。5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞数を標準的な方法で実行します。細胞懸濁液の損失はしばしば針ドロー アップ中に発生し、インジェクションの試みが失敗したので、何が実際に必要なより多くの細胞懸濁液を確認することをお勧めします。</li>
	<li>細胞の生存率を評価するために細胞懸濁液のサンプルでトリパン ブルー排除分析を実行します。セルは、90% の生存率を示す場合にのみ続行またはより高い。</li>
	<li>100 μ L のボリュームで 5 x 10 の5セルを挿入します。この金額の 2 倍の過剰を準備するには、1 x 10 の6セルにスピンダウン [HBSS の 0.2 mL で再停止されます。</li>
	<li>注射用マウスを準備している間氷バケットに細胞懸濁液を配置します。</li>
</ol>2. 尾静脈注射および肺吸入
注: このセクション中のソリューションと細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。機器、材料および次の手順で使用される手術器械のリストは、表 3 表 4を参照してください。
<ol><li>雌マウス (年齢 6-8 週間) を 5 分間加熱ランプの下で彼らの尾静脈より目に見えて明らかにするために暖かい。マウスの K7M2 や K12 セル使用 Balb/c マウス;MG63.3、mg 63、MNNG、HOS 細胞、重症複合免疫不全マウスを使用します。</li>
	<li>細胞懸濁液がチューブを優しく揺することによって均一であることを確認します。慎重に 1 mL 注射器針なしに細胞懸濁液を作成します。キャップ注射器、27 ゲージの針。針ベベル針のボリュームのマーキングと同じ側にあることを確認します。</li>
	<li>落にマウスを置き、アルコール ワイプでテールを綿棒します。</li>
	<li>尾静脈注射を行い、細胞懸濁液 100 μ L を注入に進みます。注入後 5 分は CO2チャンバーにマウスを置き、安楽死の標準操作手順 (概要、制度上のアニマル ・ ケア委員会) を開始します。プロシージャは気管に損傷を与えるので、安楽死の手段として頚部転位を使用しない必要があります。</li>
	<li>マウスを解剖すると、一度は、アガロース/A-メディア ソリューションのマウス肺の吸入の層流フードの準備を開始します。層流フード内滅菌パッドとワークエリアを設定します。このパッドには、滅菌器具、IV カテーテル、IV 延長セット、重力灌流装置 (補足図 1を参照) を配置します。</li>
	<li>背 recumbancy にマウスを配置します。滅菌の小さなハサミで慎重に胸腔内を公開する胸骨を分析します。アガロース/A-メディア ソリューションに肺を吹き込むために使用されるので、肺がパンクしないように注意します。</li>
	<li>胸骨を切り裂く場合両側に胸郭入口過去気管を解剖します。周囲の軟部組織を離れて解剖で気管を公開します。</li>
	<li>20 ゲージ IV カテーテルと気管を cannulate します。緩く ● キャニュレイテッド気管の周り滅菌腸線縫合糸を使用して外科的結び目を作る。</li>
	<li>カテーテル気管から重力灌流装置の 10 mL の注射器に設定 IV 拡張を取り付けます。</li>
	<li>1:1 の混合物に、予め温めておいた 37 oC agarose (5 mL)、A メディア (5 mL) を組み合わせます。アガロース/A-メディア液を重力灌流装置の 10 mL の注射器に注ぐ。アガロース/A-メディア ソリューションを有する肺のガス注入前、拡張セットの全体の長さはアガロース/A-メディア、これにより空気と肺試料の不注意な吸入を否定でプライミングされてことを確認します。</li>
	<li>肺が完全に充満するまで肺アガロース/A-メディア ソリューションを入力します。</li>
	<li>肺が完全に充満、カニューレを削除、気管を通じて agarase/A-メディア液漏れを防ぐために手術の結び目をしっかりと縛る。</li>
	<li>胸腔内から抜く (気管、心臓及び肺) を分析に進みます。肺の表面に損傷を与えるやない穿刺に注意してください。</li>
	<li>場所中古冷蔵 30 mL の PBS で (ない特定の向き) で抜く 1 X ペン/連鎖球菌性、添加でき、20 分間を固めるアガロース/A-メディア。</li>
	<li>高級はさみやピンセット、図 1 aに示すように、肺 (3 mm × 1.5 mm) の小さな断片をカットを使用してください。小さい肺のスライスは、2.5 X 目的を使用して簡単にイメージすることができます。複数のスライスは、実験条件ごとグループごと通常 4-10 スライス カットできます。 注:, 各実験群 B メディアにあらかじめ浸して 2 × 2 cm ゼラチン スポンジを含む個別井戸 (6 ウェル プレート) に肺のスライスを配置します。ウェルあたりのメディアの量は 1.5 mL をする必要があります。2-3 日毎にメディアを変更します。創薬研究、メディア/薬物を変更する頻度は決定ユーザーです。</li>
</ol>3 肺のスライスと解析広視野蛍光イメージング
注: 広視野蛍光イメージング、小さくスライス、カット (3 × 1.5 × 1 mm) 肺セクションを 2.5 × 対物を使用して 1 つのイメージに合わせるため。
広視野の蛍光顕微鏡画像の取得:
<ol><li>通常、0、3、7、14 日間投与後に肺のスライスが作成されます。生物学的なキャビネットの無菌環境で慎重に転送肺のスライス、ゼラチンから滅菌 35 mm のガラス底にスポンジ丸皿。余分な水分はミラーとして機能し、腫瘍細胞からの蛍光光を反映して、肺のスライスから余分な水分を軽くたたくように注意します。</li>
	<li>図 1 aに示されている同様の方法で肺のスライスを配置します。各列には、異なる実験条件を表すと思います。ない、肺のクロスをピンセットで汚染に注意してください。70% エタノールでリンスし、別の実験群から肺のスライスの処理前に乾燥します。</li>
	<li>撮像パラメーターの最適化 (すなわち。 ゲイン、オフセット、露出時間、ビニング) 蛍光腫瘍細胞と制御 (放置車両) の肺組織を背景と最高のコントラストを提供するグループです。制御グループから同じパラメーターを使用して、実験群をイメージします。Tiff 画像形式として保存します。</li>
	<li>スケールの参考のためには、同じ目的でマイクロメータのデジタル写真を撮る。</li>
	<li>肺自己蛍光が変わるので撮像パラメーターする必要があります調整するコントロールの肺に各撮像セッション。1 つのセッションのため撮像パラメーター必ずしも最適の後続のイメージング セッション。</li>
</ol>画像解析: 注: 次の画像処理手順は、ImageJ 1.51 h ソフトウェア パッケージ17で行われます。
<ol><li>ImageJ (図 3 a) で画像ファイルを開きます。</li>
	<li>背景を減算: プロセス > 引く背景 > ローリング ボール半径 (50 ピクセルで開始)、「光の背景」(図 3 b) オフにします。</li>
	<li>画像を 8 ビットの形式に変換: 画像 > タイプ > 8 - ビット (図 3)。</li>
	<li>単位をピクセルに設定: 画像 > Enter「ピクセル」単位の長さで「ピクセル幅」「ピクセルの高さ」、「ボクセルの深さ」1 を入力。後続の画像に適用する「グローバル」ボックスをを確認します。</li>
	<li>多角形選択ツールを使用して、全体の肺のスライスの形をアウトラインし、総肺のスライスの領域 (ピクセル2) を決定します。この値は、肺の腫瘍パーセント負担の計算に使用されます。</li>
	<li>しきい値画像: イメージ > 調整 > しきい値 >"Default"と"B & W"を強調表示 > 腫瘍のセルの大部分を正確に強調表示するようなイメージのしきい値スライダーを使用します。「適用」を押すと、肺はすべて黒、蛍光の病変は白い黒と白のイメージになります (図 3 D)。2 回の「適用」を押すと、イメージのすべての蛍光灯の構造が黒い図形 (図 3E) で、今を反転します。</li>
	<li>数と病変の形状の定量化: 分析 > 測定を設定 >「領域」を確認してください。他のすべてのボックスをオフにします。 粒子を分析 > サイズ (ピクセル2): 0-無限は ImageJ を列挙する図形の範囲を表します。0 日目車両画像の単一腫瘍細胞とみなされる最小の病変は経験的に判断します。データ セット内の残りの画像の下限値としてこの単一の腫瘍のセルの領域を使用します。本書で挙げた仕事のため 11 ピクセル2が下限値として設定されます。ビデオの例で提示いただき、24 ピクセル2が下限値として設定されます。「真円度」の範囲 0-1 のまま。設定することができます「表示」「何も」。また、「ショー」と「アウトライン」を選択すると、すべて形状アウトライン描画が生成されます。別のウィンドウにポップアップする測定の結果の表示] をチェックします。必要に応じて、チェック「マネージャーに追加」ボックスを持つすべての図形は、将来の参照用に保存できる ROI マネージャーに定量化が保存されます。OK を押すと、「結果」ウィンドウがポップアップすべての列挙された図形と面積 (図 3 f) を含みます。</li>
	<li>コピーして「結果」ウィンドウからデータをスプレッドシートに貼り付けます。Excel で合計数学関数を使用して、その特定の肺のスライスの転移巣のすべての領域の合計します。肺のスライスのパーセント肺腫瘍負荷を評価するために肺のスライスの面積によって病変の面積の合計を分割します。このパラメーターはまたとして知られている面積率 (A) 記述されているアンダーウッド18によってさらに。 肺腫瘍の負担 = 肺のスライスの転移巣エリア/総面積の合計</li>
	<li>コントロール グループおよびグループの残りの肺セクションの残りの部分の肺腫瘍負荷を計算します。0、3、7、14 日間 1 グループあたり平均肺腫瘍量をプロットします。進歩的な時点でプーマ モデルで成長している高低転移 OS 細胞の代表広視野蛍光写真 (図 4 a) のとおりです。パーセントの転移性腫瘍の負担で一定期間 (0 日目に正規化) フォールドの変更を示す線グラフを表示 (図 4 b)。</li>
</ol>4 プーマ モデルの共焦点蛍光イメージング
注: 共焦点イメージングのためティッシュの処理は、前のセクションと同様以外大きい肺のスライスは、イメージを作成するより多くの Roi を許可する (完全な横断、1-2 mm 厚) がカットされます。
DAR4M 肺組織のラベル。
<ol><li>37 ° C で 45 分間 (HBSS) で DAR4M の 10 μμM の肺のスライスを浸すDAR4M は、肺の細胞内活性窒素種をラベル付けします。</li>
	<li>インキュベーションの 45 分後に、新鮮な HBSS と肺のスライスをすすいでください。</li>
	<li>丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。</li>
	<li>図 5に示す例の画像撮像パラメーターの表 5のとおりです。</li>
	<li>関心領域の Z スタックを取得します。ナイキスト ・ サンプリングの推奨の Z スライス厚を使用します。DAR4M ラベルの肺組織に緑色蛍光 OS セルを表示する 3 D スタックの代表的な映画は、映画 1と補足的な映画 1で提供されます。</li>
</ol>例の共焦点画像を図 5に示すように、イメージング セッションをターミナルでした。生活に少ない光損傷があるので縦イメージングが必要な場合、2 光子または多光子の整った LSM 顕微鏡イメージングのための使用はお勧め組織19,20。 プーマ モデルで水戸 RFP 発現 mg 63 細胞のイメージング。
<ol><li>ステップ 1 や水戸 RFP 作成を表現する mg 63 セルを用いた 2 でアウトラインとしてプーマ プロトコルを実行します。</li>
	<li>丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。</li>
	<li>図 6に示す例の画像撮像パラメーターの表 6のとおりです。映画 2の補足の映画 2蛍光ミトコンドリアを提供の赤と緑の蛍光 OS 細胞を示す 3 D スタックの代表的な映画。</li>
</ol>

<ol>
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次の技術資料では、OS で肺を植民地化の勉強にプーマのモデルのいくつかの実用的な側面について説明します。研究者が細心の注意を取る必要がありますプロトコルのいくつかの重要なステップは次のとおりです。
) の気管カニューレ装着。気管は、周囲の筋肉や結合組織を解剖しながら簡単に破損することができます。さらに、カテーテルの針は気管を通じて簡単にプ...

転移性骨肉腫 (OS) の小児患者に対する改善結果重要な満たされていない臨床必要性1が残っています。これは、新しい分子標的療法の開発の重要性を強調します。ターゲット腫瘍細胞の増殖転移性疾患, とこのように新しい戦略の治療に有効であることを証明されていない従来の化学療法は2転移プロセス自体をターゲットする必要があります。現在の記事、メンドーサと同僚3、新しい発見に有用なツールを提供するによって開発された肺転移アッセイ (プーマ)前のヴィヴォ肺転移モデルの比較的新しいタイプの実用的な側面をについて説明しますOS 4,5で肺転移の進行で分子のドライバー。前に、しかし、転移、いくつかの現在のモデルは簡単に触れることが賢明だろう、試金する方法プーマ モデルは従来の in vitroでのいくつかの利点を提供しています。
特定のステップまたは転移の翼列のいくつかの手順を要約の in vitroとin vivoの系の転移を研究に使用される最も実験的モデルを構成します。これらの手順が含まれます: セカンダリ サイト、4) 血管外漏出およびセカンダリ サイト、5) 形成の生存で原発腫瘍、2) intravasation から移行して近くの血管 (血液あるいはリンパ管) との循環の中のトランジットに 1) 腫瘍細胞 3) 逮捕微小、および 6) の血管転移 (図 1) に成長。転移のin vitroモデルの 2 次元 (2 D) 移行を含めることができますで検討している 3 次元 (3 D) マトリゲル浸潤アッセイ細部6では別の場所で。生体内でモデルの 2 つの一般的なモデル システムが含まれます: 1)自然転移モデルは、腫瘍細胞ががん転移細胞を自発的に投げかけているローカル腫瘍を形成する特定の組織型に注入遠いサイト;2)実験的転移モデルは、標的臓器の上流血管に腫瘍細胞を注入するところです。たとえば、開発肺転移5,7,8で腫瘍細胞結果の尾静脈注射など。実験的転移の他のモデルには、脾臓や肝臓転移9,10の開発に起因する腸間膜静脈に腫瘍細胞の注入が含まれます。これらの体内モデルの実用的な考慮事項は、ウェルチ11で詳しく説明します。もう一つは、体内の小児肉腫の転移を研究するために使用モデルは、肺12,13ローカル腫瘍形成および自然転移で起因する腎の腎被膜下腫瘍移植モデルです。生体顕微鏡など技術的に厳しい技術直接視覚化に転移性癌細胞と転移巣の微細血管系のリアルタイム相互作用 (すなわち肺や肝臓) マクドナルド14 のとおり。と Entenberg15、または前述の金16漿尿膜にがん細胞浸潤。
プーマ モデルは肺組織植前のヴィヴォ、閉じた文化システム、蛍光腫瘍細胞の成長混入すること縦蛍光顕微鏡による 1 ヶ月の期間にわたって (図 2 a参照)。このモデルは、転移のカスケードの肺植民地化 (手順 3 から 5) の最初の段階を繰り返します。従来の in vitroモデル プーマ モデルのいくつかの主要な利点がある: 1) で縦肺微小環境の多くの機能を保持する 3 D の微小環境の転移性癌細胞の成長を測定する機会を提供しますvivo 3;2) プーマにより候補遺伝子や薬物治療のノックダウンは、3 D 肺微小環境; のコンテキストで抗転移活性を持つかどうかを評価するために研究員3) プーマ モデルは、柔軟性に蛍光顕微鏡プラットフォーム (図 2 b) 広視野蛍光顕微鏡やレーザー走査型共焦点顕微鏡などの多くの種類とそれぞれの例図 2開発、それぞれ。プーマ モデルを使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) の転移の成長に縦の画像データを取得する方法を説明します-表現する、人間の高と低転移性骨肉腫細胞 (MNNG、HOS 細胞それぞれ) を使用して低倍率広視野蛍光。肺実質をラベル蛍光染料と OS 内のミトコンドリアを分類する遺伝のレポーター細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いたプーマ赤色蛍光タンパク質のイメージングの例についても説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Table 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNNG-HOS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1547</td>
			<td>highly metastatic OS cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1543</td>
			<td>poorly metastatic OS cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG63.3</td>
			<td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>highly metastatic OS cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG63</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1427</td>
			<td>poorly metastatic OS cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X M199 media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11825015</td>
			<td>Base media for A-media and B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water (sterilized)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15230-147</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25080094</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortizone</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol acetate-water soluable</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>R0635-5MG</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media, complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin solution (10mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td>Component of A-media &#38; B-media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base media of Complete Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Component of Complete Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Component of Complete Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Used in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Used to resuspend cell pellet prior to injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25200114</td>
			<td>Used in cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAR4M</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-620-069-M001</td>
			<td>Used to label lung parenchyma.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for PuMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 Confocal LSM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Upright LSM confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780 Confocal LSM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted LSM confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCID mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>59-9863</td>
			<td>Used as a support for lung tissue sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50100</td>
			<td>Used during insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27 gauge needle</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>14-826-87</td>
			<td>Used for tail vein injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td>Used for insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge catheter</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR-OX2032CA</td>
			<td>Used during insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbott IV extension set (30&#34;, Sterile)</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>8342</td>
			<td>Used during insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td>For wiping tail vein before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>Varies with size</td>
			<td>Asceptic handing of mouse lungs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 cm ruler</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Used for insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support stand for ruler</td>
			<td>Pipette.com</td>
			<td>HS29022A</td>
			<td>Used for insufflation of the lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottomed culture dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>Used during imaging of lung slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56617-014</td>
			<td>Used to line the sterile work area in the biological hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catgut Plain Absorbable Suture</td>
			<td>Braun</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to tie off cannulated trachea.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments for PuMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors 3.5&#34; Straight Sharp/Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>For cutting lung sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5132</td>
			<td>For manipulating/holding lung sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS5135</td>
			<td>For manipulating/holding lung sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5&#34; Length; 1.3 mm Tip Width</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps 4.5&#34; Serrated 2.2 mm Tip Width</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5&#34; Straight Sharp/Sharp, 20mm blade</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4&#34; Overall Length</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations in studying metastatic lung colonization in osteosarcoma using the pulmonary metastasis assay

肺転移アッセイ (プーマ) は、肺植前のヴィヴォと閉じた細胞培養系蛍光顕微鏡による骨肉腫 (OS) で肺を植民地化の生物学を研究する研究者を許可します。この資料では、プロトコルの詳細な説明を提供し、広視野または共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して転移の成長上の画像データを得るの例について説明します。プーマ モデルの柔軟性により、肺微小環境の OS 細胞の成長だけでなく研究にも時間をかけて抗転移治療の効果を評価する研究者です。共焦点顕微鏡による肺実質と OS 細胞相互作用の前例のない、高解像度のイメージングが可能です。また、プーマ モデルを蛍光色素や蛍光タンパク質遺伝子記者と組み合わせれば、肺微小環境、細胞および細胞レベル下の構造、遺伝子機能および転移の OS 細胞におけるプロモーター活性研究者の研究することができます。プーマ モデルは、骨肉腫の研究者から新しい転移生物を発見し、新規抗転移、ターゲットを絞った治療法のアクティビティを評価するための新しいツールを提供します。

低倍率広視野蛍光顕微鏡
プーマ肺のスライスの広視野蛍光顕微鏡、代表的な画像と定量化データは図 2、および図 4 aとBで示されています。高と低転移細胞の転移の性癖は進行時間のポイントを視覚的に明らかにされます。効率的に、MNNG セルは?...

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Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.0K ビュー.  National Institutes of Health. この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。

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Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

がん研究

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform necropsies rapidly and efficiently from studies without sacrificing the quality of the tissues procured. The goal of this protocol is to present a method to rapidly perfuse, inflate, and fix mouse lungs for downstream histological analysis. This method does not standardize lung inflation; thus, it does not require any special procedures or equipment and instead simply instills fixative directly through the trachea following perfusion through the heart. This allows for sufficient estimation of tumor size, histology, and scoring. This also allows for the collection of frozen tissue prior to lung tissue fixation. This method is limited in that it does not allow for later morphometric quantification of the lung; however, it is more than sufficient for lung tumor analysis from genetically engineered mouse models (GEMMs), syngeneic models, as well as xenograft tumor and metastasis studies.

The purpose of this method is to present a simple and efficient method for the perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs for the examination of lung tumor pathology and evaluation of metastases to the lung.

腫瘍組織学におけるマウス肺の多灌流とインフレーション

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...