著者は彼らの技術支援のためにブライアンMuntean、シャオ·ロー、マキ高橋ブレアメルに感謝します。この作品は、NIH（DK080640）とDr。スーリヤNauliにトレド＆ProMedicaトランスレーショナルリサーチ刺激のための賞の大学からの賞によってサポートされていました。

1。細胞の前処理と中期の準備<ol><li>彼らは70から80パーセントがコンフルエントに達するまで細胞は、5％CO 2インキュベーターで37で10〜15％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン°Cを含むイーグル培地（DMEM）のダルベッコの改変で栽培されています。 </li><li> 30〜60分間は0.05μg/ mlのコルセミド溶液で細胞を処理します。 </li><li> 50 mlの滅菌ファルコン遠心チューブ内の任意の浮遊細胞を含む培地を収集します。 sterile1X-PBSでプレート上で細胞を洗浄します。 1〜2分間滅菌したトリプシンでインキュベートした後、収穫し、同じチューブに残りの細胞を収集します。 </li><li> 5分間1000rpmでチューブを回転させ、上清を残して0.5 mlを吸引し、唯一の指でフリックでペレットを緩めます。 </li><li>ペレットのサイズに応じて、dH 2 Oでの0.56％のKClの低張液の5〜10 mlを追加し、30から45分間37℃で懸濁液をインキュベートします。 </li><li>メタノール/酢酸の一滴を追加します。（3:1​​ vol / vol）のml当たり低張性の細胞懸濁液と混合するために穏やかにチューブを反転させる。 </li><li>継続的にペレットをフリックしながら5分間1200rpmで遠心分離し、ステップ1.4としてペレットを収集し、新鮮なメタノール/酢酸（3:1 vol / vol）の固定液を滴下し、5 mlを加える。この手順では、中期スプレッドは実験が損なわれる細胞の塊の中に閉じ込めされないようにすることが重要です。 </li><li> 5分間1200rpmで再び遠心し、チューブの壁に沿って氷冷メタノール/酢酸固定液の5〜10 mlを加える。必要に応じて、この段階で、細胞は短期または-80 -20°Cで締めて密封チューブ内に固定液に保存することができます°C今後の使用のために長期（年）。 </li><li>無水エタノールできれいにスライドし、スライドの表面に水の鞘を形成するためにapproximately10XためのdH 2 Oでスライドを浸す。 （ステップ1.8からの細胞懸濁液をガラス板とドロップ15-20μlの上でスライドを配置する） &quot;10からスライドの上に1-2分間65から70に設定され水浴°Cでスライドを置き、乾燥させます。 </li><li>中期染色体スプレッドは等間隔があることを確認すること10Xと40Xの乾燥の目標を使用して光学顕微鏡下でスライドを確認してください。染色体を周囲の細胞質の存在を確認してください。細胞質は、現在のスライドの前処理（ペプシン消化）を続行している場合には細胞質が存在しないと染色体は、優れた形態を持っている場合は、スライドの前処理の必要はありません。 </li></ol> 2。スライドの前処理（ペプシン処理） <ol><li> 24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスに2X-SSCに溶解し、1:200のRNase溶液（20 mg / ml）を120μLを適用し、優しく中期スライド面を反転してインキュベートし、カバーガラス上で中期のスライドを下向きに反転させる37℃で45分間。 </li><li>慎重にスライドを傷つけず​​にカバーガラスを除去し、コプリンジャーに2X-SSC緩衝液中で15分間毎に5分を洗う振とう。 </li><li>きれいなビーカーにペプシン原液の5〜15μL（dH 2 Oで100 mg / ml）を追加して、あらかじめ温めておいた100mlの追加（を37°C）0.01M HClを。 これは、ペプシンがクリーンに追加されることが重要です。直接HCl溶液に最初のではなく、ビーカー、それ以外の場合は、溶液に溶解しませんでした。で37塩酸/ペプシン溶液の入ったコプリンジャーにスライドをインキュベートし、3〜5分間°C。あまりにも多くの消化が染色体がoverdigestedされるようになりますし、少なすぎると消化は、プローブの非特異的な結合につながるとのハイブリダイゼーションシグナルに干渉する可能性のある細胞質消化のままになり、このステップは非常に重要です。 </li><li>室温で二回、5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>室温で5分間（1X-PBS 950 mlの1M MgCl 2の50ミリリットル）が100ミリリットル1X-PBS/MgCl 2を含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>コプリンジャーcontaininのスライドを配置する室温（1X-PBS/MgCl 2の100ミリリットルの37％ホルムアルデヒドの1.7 ml）をgで10分間100ミリリットル、1％ホルムアルデヒド。 </li><li> 5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>スライドが適切に消化されず、細胞質が存在しないと染色体の形態が保持されていることを確認する40X乾燥したレンズを使用して光学顕微鏡下でスライドを観察します。ダイヤモンドペンを用いたハイブリダイゼーションの領域を選択します。 </li></ol> 3。染色体とプローブの変性とハイブリダイゼーション<ol><li>新鮮な変性溶液（70％formamide/2X SSC、pH7.0）で70〜80にprewarm℃〜70℃の水浴で変性溶液を含むコプリンジャーにスライド水浴場所に置かれコプリンジャーに°を準備します。マウスの染色体と80°C、C 30-1.5分間のヒト染色体のために。 </li><li>直ちに3 80％と続いminと3分ごとに、空気乾燥した100％のエタノール、氷冷70％エタノールでスライドを配置します。スライドを調べる染色体の形態のために。優れた染色体の形態は、暗い染色体とされていません &quot;相光&quot;またはハロ染色体によって表されます。 </li><li>数秒間、1000rpmで簡単に20分、ボルテックスと遠心分離のために振とうしながら37℃で、SkyPaintプローブ（バイアル1位SKY塗装キット）を温める。 </li><li> preannealingのために標識プローブDNAを許可するように60分間37°Cに続いて5分サイクルの85℃で2段階のサイクルのためにプログラムサーモプローブを変性させる。 </li><li> 22ミリメートル×40 mmのカバーガラスには気泡をトラップしないようにして作るとのハイブリダイゼーションとカバーの領域に変性したプローブを10μlの適用されます。 48から72時間37℃で加湿チャンバーのゴムセメントとインキュベートするとカバーガラスの端をシールします。 </li></ol> 4。蛍光プローブの検出<ol><li>慎重にカバーガラスを除去し、（45°C）、洗浄液I（2×SSCで新たに調製し、50％ホルムアミド）予熱を含むコプリンジャーにスライドを配置します。 5分間洗浄45三回45回転で振とう水浴中°C </li><li>振とうしながら45回溶液II（1X SSC）℃で5分間の洗浄でスライドを洗浄します。 </li><li> 45℃で5分間解IIIを（4X SSC/0.1％Tween 20）で洗浄℃の振とうしながらスライドを洗浄します。 </li><li>ブロッキング試薬80μlの（SKYのペイントキット、バイアル＃2）を適用し、30分間37℃でカバースリップとインキュベートを配置します。 </li><li>スライドを削除し、流体が流出することができます。 Cy5で染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃3）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを適用します。 </li><li>振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。 </li><li> Cy5.5染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃4）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを配置します。 </li><li>振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。 </li><li>スライドを傾けて、流体を許可<html>ドレイン。アンチフェード試薬DAPI（SKYのペイントキット、バイアル＃5）の20μlを適用し、24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスを配置します。慎重に形成されているかもしれない空気の泡を削除します。スライドはすぐに撮影さまたは4℃で保存し1週間を超えないために暗闇の中でCすることができます。 </li></ol> 5。画像収集と分析<ol><li>画像の取得は60X油浸レンズを搭載したオリンパス顕微鏡、スペクトルキューブ（カスタム設計されたトリプルバンドパスフィルタ）、DAPIフィルターとCCDカメラによるサニャック干渉計モジュールを使用して、中期のスライドを表示することによって達成されます。 </li><li>スペクトル核型は、ユーザーズマニュアルは、次のスカイビュー·ソフトウェア（応用分光イメージングバージョン1.62）を用いて行った。 </li><li>画像を分析した後、染色体はカラー画像（特定の蛍光色を含む）、擬似カラー画像（分類のための色）と反転DAPI画像（特定のバンディングパターン）と見なすことができます。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 6。代表的な結果完全SKY手順は、通常1週間程度の時間（ 図1）をとります 。これは、中期細胞が十分に供給されていることを提供された画像の取得と分析が含まれています。核型分析では、野生型マウス（ 図2a）からの細胞の正常なマウスの核型（40、XY）を明らかにする。対照的に、PKD1から細胞- / -マウス（PKDモデルマウス）染色体数や染色体欠失（染色体＃8）と転座（染色体＃11と19）（ 図2b）のような構造異常の有意な増加を示しています。また、ADPKD患者から血管組織を分析した。染色体の数を数えることによって、単純な研究では、非ADPKDといくつかのADPKD血管のサンプルは23対の染色体の正常な数値（ 図2c）を有していたことが示された。しかし、一般的に、我々は、染色体の46ペアで、その結果、染色体分離の障害を観察したDPKDサンプルの代わりに23対（ 図2d）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> 図1。 SKYプロトコルのフローチャート。SKYプロトコルは細胞の前処理と中期の準備からの画像取得と解析を開始する実験を完了する手順を示しています。のフローチャートおおよそ一週間のタイムラインは日ごとにステップバイステップの手順で左側に提示されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> 図2。不死化マウス細胞株と新たに単離されたヒト初代培養細胞のスペクトル核型分析。個々の染色体の色と反転DAPI画像は染色体のソートの前に示されています。並べ替えの後、染色体は&quot;分類&quot;テーブルに表示されます。）は、野生型マウスからの中期スプレッドのSKYイメージが正常核型（40、XY）が含まれています。B） </st栄PKD1から中期スプレッドの&gt;空画像- / -マウスは、異常な染色体数（68の代わりに40）、このような染色体欠失（染色体＃8）と染色体転座（染色体＃11と19）のような染色体異常を示しています。C）SKY非ADPKD患者の血管組織からの中期スプレッドのイメージは、正常な核型（46、XX）を備えています。d）は ADPKD患者の血管組織から広がる中期の空のイメージは、異常な核型（92、XXXX）が含まれています。データの一部は、以前報告され、許可14で再利用されています。

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M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. 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E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. 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N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体の組成を研究に使用される細胞遺伝学手法です。この手法では、染色体彩色プローブを活用し、これらのプローブの検出は、サニャック干渉計を介して取得されます。完全SKYプロセスは、通常1週間程度かかり、それはいくつかの重要なステップ（ 図1）が含まれます。 SKYは、最初のパディリャ、ナッシュら 3によって...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgroメディアテック株式会社</td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>ハイクローン</td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin /ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td>コルセミド</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10μg/ mlの</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> SKYペイントプローブキット（ヒト） </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKYペイントプローブキット（マウス） </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td>濃縮された抗体検出キット</td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td>ペプシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td>フルカ</td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>マリンクロット·ベーカー</td><td> 2106から02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td>プロメガ</td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フルカ</td><td> 47671 </td><td>使用直前に準備する</td></tr><tr><td> Tween-20を</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のスライドガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から549 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス24x60mm </td><td> VWRビスタビジョン</td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td>ゴムのり</td><td>エルマーの（ローカル小売店） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション/ humidifiedchamber /トレイ</td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td>下部の湿紙タオルを置く</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td>プラットフォーム/オービタルシェーカーを振る</td><td> Bellcoバイオテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>揺れ/水浴</td><td>精密科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPIフィルターキューブ</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKYフィルターキューブ</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反転した細胞培養顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコンのEclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX70 </td><td> 60X油</td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

識別し、個々の染色体を分類する従来の方法は、1、2を分析している特定の種の各染色体のユニークなバンドパターンに依存しています。この古典的なバンディング技術は、しかし、そのような癌に関連付けられているような複雑な染色体異常を識別するのに信頼できるものではありません。バンディング技術の限界を克服するために、スペクトル核型分析（SKY）は、染色体異常に多くの信頼できる情報を提供するために導入されています。 SKYは、スペクトル顕微鏡3、4と中期染色体を検出するために多色蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）テクニックです。 SKYは、遺伝的疾患や悪性腫瘍5、6の大規模な番号に関連付けられている染色体異常の広い範囲の細胞遺伝学的分析のための貴重なツールであることが実証されています。 SKYは、縮退oligonucleから調製された多色蛍光標識DNAプローブの使用を含むPCR法によるotideプライマー。したがって、すべての染色体は差蛍光染料（ローダミン、テキサスレッド、Cy5で、FITC及びCy5.5）の混合物で標識されたプローブとのin situハイブリダイゼーション後のユニークなスペクトル色を持っています。 SKYに使用されるプローブは、7月10日 55染色体特異的プローブまでで構成されています。 SKYの手順は、いくつかの手順を実行します（ 図1）が含まれます。 SKYは、正常または病気の組織や血液から高い分裂指数と細胞の可用性を必要とします。新たに単離した初代培養細胞または細胞株のいずれかから単一細胞の染色体は、ガラススライド上に広がっています。この染色体の広がりは、各染色体の特定の蛍光色素の異なる組み合わせで標識されている。プローブ検出と画像取得のために、スペクトルイメージングシステムは、サニャック干渉計とCCDカメラで構成されています。これは、サンプルから発せられる可視光スペクトルの測定を可能にし、あちこちスペクトル画像を取得するメートル、個々の染色体。 HiSKY、撮影した画像の結果を分析するために使用されるソフトウェアは、染色体異常の簡単な識別を提供しています。最終結果は、中期染色体の各ペアは、異なる色（ 図2）を有する核型分類のイメージです。これは染色体のアイデンティティと転座を簡単に識別することができます。詳細については、適用されるスペクトルイメージングのWebサイト（参照してください<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ）。 SKYは、最近、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、一次繊毛11-13の機能不全を特徴とする遺伝性疾患とヒトとマウスの染色体の分離の欠陥と染色体異常の同定に使用されていました。このテクニックを使用して、我々は異常な染色体の分離とADPKD患者およびマウスモデル14の染色体の欠陥の存在を実証。 SKYを使用して更なる分析は、私たちは、染色体数とIDを識別するためだけでなく、正確にそのような染色体欠失と転（ 図2）のような非常に複雑な染色体異常を検出することはできませんだけ。

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体異常を識別するための高度な細胞遺伝学的手法です。この手法は、すべての染色体の分類を可能にする染色体ペインティングプローブ、を利用しています。 SKYはまた、多発性嚢胞腎疾患を含む様々な疾患を持つマウスとヒトの複雑な染色体異常や偏析欠陥を識別することができます。

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K ビュー.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体異常を識別するための高度な細胞遺伝学的手法です。この手法は、すべての染色体の分類を可能にする染色体ペインティングプローブ、を利用しています。 SKYはまた、多発性嚢胞腎疾患を含む様々な疾患を持つマウスとヒトの複雑な染色体異常や偏析欠陥を識別することができます。

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Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

血管疾患の研究のためのマウスにおける同所性大動脈移植

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

医学

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

高塩ダイエットとルイスラットにおける慢性腎臓病を誘発するために一酸化窒素合成酵素阻害と組み合わせた5/6thの腎摘出

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

慢性腎臓病患者における血管機能の評価

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン<em&gt; WNT5A</em&gt;ゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

のための多発性嚢胞腎疾患の小齧歯類モデルにおける超高磁場MRIの使用<em&gt;インビボ</em&gt;表現型と薬物モニタリング

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

対称Bihemispheric死後脳人間に健康と病理学的脳条件を研究するためにカッティング

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

モデルは、ヒトにおける臨床的に関連する低酸素症をシミュレートします

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...