Jaipreet Bharjからの技術サポート。この作業は、EU-FP7（SYSCILIA -241955）とオランダの腎臓財団（CP11.18）からの補助金によってサポートされていました。

倫理声明：動物のメンテナンス、畜産、および手続きは動物によって定義され、制御されている（科学的処置）法1986年のすべての動物実験は、生物学的に適合して内務大臣（PIL号7892分の70）によって与えられたライセンスの下で実施されましたサービス管理グループと生物サービス倫理委員会、SGUL、ロンドン、英国。すべての努力は、使用される動物の数を減少させ、苦痛を最小にし、福祉を向上させるために、手順および飼育の両方を洗練するために行われた。 楽器、麻酔剤、蛍光色素の調製<ol><li> （フィラメントなしで）マイクロピペットプラーとホウケイ標準壁毛細血管を使用して、マイクロインジェクション（ 図1A）のための適切な長さの針を引っ張る。 </li><li>心膜（ 図1B）への容易な注射のための胚の向きのためにアガロースの金型を作成します。のり約10ガラス顕微鏡SL一緒のIDEオフセットスライドの「階段」を形成する。最良の結果を得るには、各スライドの中央に急速なセットエポキシ樹脂接着剤のドロップを使用。 </li><li>ブンゼンバーナー加熱されたメスを用いてプラスチック製のピペット2 10ミリリットルを通じて長さを半で約78ミリメートルのセクションを切り取り、ピペットは、必要に応じて終了し削除します。金型90のペトリ皿中に浸漬することを可能にするために安定性を提供するために、積み重ねられたガラススライドにピペット部を取り付け、接着剤（エポキシ樹脂）。スライドの角をペトリ皿の床に垂直に整列することを確認するためにあらゆる努力をする。糊時間が設定できるようにする。 </li><li> （水族館から入手）の魚を水に作ら2％アガロース溶液中に金型にキャスト。 90ミリメートルペトリ皿にアガロース注ぎ、オープンペトリ皿の上に金型を置き、積み重ねられたスライドはアガロース表面の下の角度で水没するエッジ許可する。 30分間の実験台に設定することにしておきます。 </li><li>スライドキャストを取り外し、スライドインプリント新鮮な魚の水でアガロースをカバートリカイン麻酔薬を含む1：25の比率で（ステップ1.9を参照）。 </li><li>ローダミンデキストラン（RD）染料のソリューションを作成します。ローダミンB、10,000MWの50 mg / mlのストック濃度を作るためにオートクレーブした超純水に標識デキストランを再懸濁する。マイクロインジェクションのために、さらにオートクレーブした超純水中5mg / mlの最終濃度にストックを希釈する。 注：色素沈着細胞を24時間後に受精（HPF）からゼブラフィッシュに分化し始める。これらは、画像取得中蛍光マーカーを曖昧にすることができます。 </li><li>ブロックは、チロシナーゼの阻害を介してメラニンN -Phenylthiourea（PTU）を使用してメラニン形成を阻害する。完全に可溶化するために60℃の水槽水、熱溶液にPTU粉末を溶解することによりPTU 0.003％原液を作る。 </li><li>真菌ブルームを防止し、生存率を高めるために、メチレンブルー溶液、穏やかな殺菌剤でゼブラフィッシュ胚を培養する。 Uの0.1％メチレンブルーを含む、メチレンブルー原液の2ミリリットルを追加します。ltrapure水、標準的な胚培地として、水槽の水および使用の1 Lに。 </li><li> 「ゼブラフィッシュブック」23の手順に従って、トリカイン/エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩の15 mMストック濃度を構成している。胚を麻酔し、結果的にマイクロインジェクションの手順を実行するためにそれらを固定化した。 </li><li>胚を麻酔した後、メチルセルロースの非毒性および粘性の特性を利用して画像化するために、それらを方向付ける。 、3％メチルセルロース200mlの準備を行う氷上で30分間置き、-20℃で130mlの水を冷却した。ガラスビーカー中で80℃の熱水70mlを、メチルセルロース6gのを追加し、全ての粒子が濡れ均一に分散されるまで、ガラス棒を用いて攪拌する。氷冷した水を加え混合し、製剤を50 mlチューブに等分する前に、30分間、4℃で冷却する。 注：温度を下げることはメチルセルロースが可溶性になることができます。溶液は濃厚になります粉末水和物として。 3％のメチルセルロースを、細菌を4℃で一週間の短期間増殖または-20℃で長くすることなく保存することができる。メチルセルロースは、使用前にRTに達していることを確認してください。 </li><li>ゼブラフィッシュへの蛍光色素の注入を実行するには、標準的なマイクロインジェクションのセットアップ（ 図1C）を使用します。これは、1.0外径毛細管で使用するためのストレートピペットホルダに供給する圧力調整器システムに接続された空気圧縮機で構成されている。ピペットホルダは、磁気スタンドにより鋼製基板に固定MM33コンパクトな3軸制御マニピュレーター内に収容されるべきである。胚を操作し、可視化し、立体解剖顕微鏡を用いて注入することができる。 </li></ol> 2.ゼブラフィッシュ畜産とプレ噴射トリートメント<ol><li>以前に23を説明したようにゼブラフィッシュを維持します。 28.5℃の一定温度で供給される循環水を供給する水槽セットアップを使用、pHを6.8に調整 - 7.2と重炭酸ナトリウムとインスタントオーシャン海塩、と450〜550μSの導電率をそれぞれ。 8 Lタンクあたり15人の女性に15人の男性の飼育密度を維持し、実験に適するように、野生型またはトランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用してください。午後11時 - 午前9時との間に日光の14時間に魚ファシリティ光サイクルを設定します。 </li><li>ゼブラフィッシュ産卵はライトが午前中に電源を入れたときに、光サイクルの開始時に開始する。最大の卵が魚を乱すことなく収集することができるようにするには、コレクションの前に夕方野生ストックタンクに（ゼブラフィッシュの専門家から入手可能なメッシュインサートを含む、）繁殖タンクを水没。 </li><li>収集し、茶こし、新鮮な水槽の水を使用して卵を洗い流した後、魚が産卵するための40分 - コレクションの日に、30を許可する。胚培地を含む90ミリメートルペトリ皿にきれいに卵を堆積し、28.5℃でインキュベートする。 </li><li>メラノを阻害するためにPTUで胚を扱う創世記。 8 HPFでは、1を含む新鮮なペトリ皿に最小限の液体中の生存胚を転送：胚培地に100 PTUをし、さらに72 HPFまで28.5℃でインキュベートする。 注：PTUので8 HPF段階を投稿する制限する必要があり、以前の段階で使用した場合発達障害を引き起こす可能性がありますが、遅くとも24 HPFとして扱うことができます。 PTUの後期に加え、完全に目の色素沈着をブロックするが、一般的には成功したとトランクメラニン形成を阻害されていません。 </li></ol> 3.マイクロインジェクション注：心膜は心臓を包むが、心膜キャビティ内の流体によって保護と心臓の動きを容易にするために分離されている。この手順の目的は、これは、脈管系への染料の迅速な取り込みを可能にする、心膜腔にRDを注入することである。 <ol><li> 6μlのロード針は - microloaderのヒントを使用して、RDに希釈し、マイクロマニピュレーターの針ホルダーに固定します。細かいティップを使用した針の端を破るED鉗子（ 図1A）。一度完全なミリ秒に切り替える、微細な設定にパルス持続時間を最大化することにより、針の先端にRDソリューションを移動します。 </li><li>直径が100μmに放出液滴のサイズを調整する（鉗子を用いて）針先端の長さに対するステージマイクロメーター、圧力調整器、および改良を使用し、これは0.5 nlの体積（ 図2A）に等しい。 注：針を壊した場合、それ以外の場合は難しい注入量を校正するようになりますからあまりを壊さないように注意してください。必要であれば、さらなる液滴サイズを増加させるために針の先端を破るが、過度の屈曲または組織に損傷を与えることなく、心膜への進入を可能にする針の厚さを維持する。 </li><li>注射の前に、トリカインを含む胚培地中で胚を麻酔。 5ミリリットル胚培地、ラベル1」トリカイン」と他の「回復」を含む2×35ミリメートルペトリ皿を設定します。 </li><li> 200を追加適切に標識された皿に株式トリカインのμL。注入する準備ができたら、72 HPFで個々の胚を選択して、トリカイン皿に最小限の液体中に移す。胚のアクティビティを監視し、胚を麻酔と切り捨てmicroloaderチップを用いて穏やかな攪拌により固定化されたテスト。 </li><li>射出成形金型に麻酔をかけた胚を移し、左側が視野の左に心を配置する、上を向いているので、アガローストラフ内の胚を方向付ける。 </li><li>心にRDを注入するために、針で心膜を貫通し、麻酔した胚（ 図2B、右パネル）の心膜腔にRDの1 NLを注入する。注射後に針を撤回。 「回復ディッシュ &#39;に最小限の液体中に注入された胚を移し、1分間監視します。適切に1ミリリットルの新鮮胚培地（PTUを含む）とラベルを含む24ウェルプレートに、個々の胚を転送します。 注意：心膜は厳しいです、しかし心膜が腹-尾咽頭アーチと背吻側卵黄嚢（ 図2Bの矢印）を満たしている交差点で注目すべき弱点があります。針はこの溝に向けられるべき。針が所定の位置にあるときに、マイクロマニピュレータの上に指をしっかりとタップが心膜腔への侵入を容易にする。 </li><li> 、実験群あたり少なくとも10の胚のために3.6別々のウェル内の各魚を置き、独自にlabelto許可個々の実験的なフォローアップ - 繰り返して、3.2を繰り返します。 3時間28.5℃でインキュベートする。 </li></ol> 4.イメージング買収<ol><li>前述のように3時間後に注射（hpiの）で胚を麻酔し、3％メチルセルロースを含む35ミリメートルのペトリ皿に移す。静かメチルセルロースに胚をプッシュし、側面を画像化することができるので、方向付ける。 </li><li>可視化oについてフィルターを使用して、UV下での胚の画像を取得する570nmで（ 図2C）で放出された光fは。画像取得後、胚がよく指定されたに交換する前に回復することができます。すべての注入した胚のための画像を取得し、さらに28.5℃でインキュベートする。 注：このプロトコルでは、我々はTXRフィルターセット、DFC300FXカメラと、それぞれのアプリケーション·ソフトウェアと蛍光実体顕微鏡を使用していました。次の画像取得のための正確な取得の設定をメモします。 </li><li>上記のように24 HPIでは、画像の第二ラウンドを獲得。すべての画像が取得された後、3 HPIと24 HPIの両方で、人道的に胚を処分するか、他の実験的な手段例えば、免疫組織化学のために使用します。 </li></ol> 5.画像処理<ol><li> NIHのImageJソフトウェアを用いて画像を解析することによって、3のhpi、24 hpiので、各注入された胚の蛍光強度を定量化する。 、蛍光強度を測定したImageJで画像を開いて、1から関心領域（ROI）を指定するには00 PX 2（編集→選択→指定）。 </li><li> ROI（ 図2C）の中心に心を置き、（→対策の分析）測定を行い、（→セットの測定値を分析します）は、平均グレースケールと面積を含めるように測定値を設定する。胚あたり、3 HPIと24 HPIで、画像のセットごとに記入し、さらなる処理のためにスプレッドシートに平均グレイスケール値を転送する。 注：これは、胚間の個々の心をも包含するとして、私たちは100 PX 2の固定ROIサイズを選択しました。心臓が原因の前に腎臓に入る血液の蛍光量を測定するために便利な場所を可能にする、その大きなサイズに測定を行うために選択した。 </li><li>適切な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。スチューデントのt検定を用いて統計的有意性のためのグループを比較する。 </li></ol>

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	<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+zebrafish+kidney:+a+tale+of+two+tubes.">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li><li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct.">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome.">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li><li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies.">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).</li><li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1.">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li><li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies.">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease:+the+last+3+years.">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li><li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects.">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li><li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+kidney+disease.+1:+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect.">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li><li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease.">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li><li>Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease.">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li><li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycystic+kidney+disease+proteins,+polycystin-1,+polycystin-2,+polaris,+and+cystin,+are+co-localized+in+renal+cilia.">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li><li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+cilia+in+disease:+the+human+ciliopathies.">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li><li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development,+health+and+disease.">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li><li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish.">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome).">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li><li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism.">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li><li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9/PTHB1+leads+to+cilia+defects.">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).</li><li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran.">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病をモデル化するための貴重なツールを提供し、in vivoでの研究のための科学的な楽器としてのそれらの使用は、腎臓を含む多くの生物学的システムの遺伝内訳の詳細な研究を可能にしてきた。多くは今ゼブラフィッシュ腎臓の発達や機能方法について理解されている。病気の原因遺伝子と人間の腎形成と相同性に印象的な類似点21は、ゼブラ?...

ヒト腎臓は、血液からの代謝老廃物を濾過し、細胞の恒常性を維持するために必要な溶質を回収することに重要な役割を果たしている。腎機能障害の原因となるヒトの遺伝疾患がいくつかあります。最も一般的な遺伝性腎疾患は腎炎尿細管内の流体満たされた嚢の開発によって特徴付けられる常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）です。嚢胞形成に起因する損傷は、腎臓機能10にとって有害である。 1,000 8占める-末期腎不全（ESRF）11の患者の10％：800から1：ADPKD 1の発生がある。いくつかの遺伝子は約85％と、それぞれ12,13症例の15％を占め、ポリシスチン1（PKD1）および-2（PKD2）を含む、ADPKDを引き起こすことが関係している。さらに、遺伝子PKD1のための製品と-2は、繊毛に局在し、繊毛形成14,15の基本である。として知られているヒトの遺伝性疾患の認識の家族は、用意されました繊毛の機能に影響を与え、CKD 16もたらすciliopathies。 毛様体の発達と機能に影響を与える人間の遺伝性疾患の増加数は、このかつて考えられて残留細胞小器官におけるグローバル関心を集めている。繊毛、毛様細胞性突起は、重要な細胞シグナル伝達事象の伝達に必要な受容体及びイオンチャンネルに濃縮される。繊毛は、一般的に、または一重微小管の中央ペアなしで9放射状に配置された微小管のダブレットに構造化微小管ベースの軸糸で構成されています。軸糸構造は、繊毛作用の種類とモードを定義します。 9 + 2微小管の配置は、それが上皮表面を横切る流体の移動に利用されている繊毛に運動を付与する。 9 + 0構成は、非運動性であるが、主に細胞のシグナル伝達事象17において機能すると考えられている。別にCKDから、毛様体機能障害の影響は、特徴のセットです、肥満、網膜変性、多指症、及び認知障害16を含むciliopathy機能。しかし、CKDは、患者の生活の質に最も有害なので、毛様体関連CKDのためのin vivoモデルで適切なの発展の主要な推進力の中で。 ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病の病因を理解するための優れたモデルです。彼らの迅速な開発は、卵の大多数、透明な組織、および子宮外の成長の生産は、ゼブラフィッシュの発生過程を可視化し、生物学的事象が、かなり簡単に操作することができるようになります。遺伝子は、遺伝的に、ゲノム編集ツール（CRISPR 18とTALENS 19）の最近の成功を使用して変更するアンチセンスモルホリノ技術20を用いてノックダウン、または薬理学的に彼らの水生環境に対する化合物の添加によって調節することができる。確かに、ゼブラフィッシュは、電子を実施するためのプラットフォームを提供します他の動物モデルにおいて許容されないxperiments。ゼブラフィッシュ一方で、彼らは人間と共通する多くの機能的に保存された臓器、遺伝子、およびシグナル伝達プロセスを共有する（ヒトに比べて）比較的単純な脊椎動物である。例えば、ゼブラフィッシュの腎臓は、人間21,22に比べて構造及び機能で非常に似ています。しかし、位相の連続を通じて開発した哺乳動物の腎臓とは異なり、それぞれがより発展腎臓（前腎、中腎、および後腎）でマークされ、胚のゼブラフィッシュは、前腎、腎臓の最も未熟型を開発しています。ネフロン数百万の哺乳類の腎臓のビルディングブロックを形成見つけることができる一方で、ゼブラフィッシュ胚2つだけを持っている。初期の血液濾過液を可能に糸球体は、大動脈のちょうど腹側正中で融合されている。排出腔を経由して終了する前に融合させ、軸に沿って尾側に実行する前腎細管への糸球体を通して血液フィルター。前腎TUbulesは重く尾側の出口3,4に向けたろ液の流れに許容され、運動性繊毛と繊毛されている。この単純な前腎構造は、彼らが最終的にはより複雑な中腎構造21へと発展幼虫の成長の数週間を通じてゼブラフィッシュの恒常性を維持します。しかし、ゼブラフィッシュは、後腎21を開発したことがない。ゼブラフィッシュ特異性にもかかわらず、ゼブラフィッシュネフロンは、哺乳類で観察されたものと同等の遺伝子発現プロファイルでセグメント化され、したがって腎形成3,22のための生体モデルで他の追随を許さないを提供しています。 日常的に患者の血液および尿検査の一連の腎機能について試験される。典型的には、血液を溶解した塩、尿素およびクレアチニンについて分析する。尿素、クレアチニンおよび異常な塩濃度の高いレベルは、腎機能の問題を示している。比色ディップスティックを使用して尿検査は、タンパク質、する当館の異常なレベルを検出し、dは、膿、細菌および尿サンプル中に存在する糖。 10ミリリットルの血液 - このようなテストは、通常、約30ミリリットルの尿または5が必要です。これは、主として、アッセイを行うために十分な血液や尿を収集不可能な性質のために、そのようなゼブラフィッシュのような生体内モデル生物、 小にこれらのタイプのアッセイを翻訳することは困難であった。ここでは、適切なゼブラフィッシュ腎機能検査の不足に対処し、その研究のための革新的な技術が記載されている。血流中に蛍光色素を注入することにより、我々は、腎臓を介して血液からろ過し、蛍光活性の排泄を監視し、個別に時間をかけて定量化することができる。この方法では、我々は、例を提供する病気によって引き起こされる腎障害を研究するために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

ゼブラフィッシュ胚は、器官形成を研究し、人間の遺伝病をモデル化するための扱いやすいモデルを提供しています。その相対的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュ腎臓が開発し、人間とほぼ同じように機能します。ヒト腎臓の建設に大きな違いは、唯一の2があるゼブラフィッシュに比べネフロンの数百万の存在である。しかし、基本的な機能単位にそのような複雑なシステムを簡素化することは、腎臓が開発し、どのように動作するかの理解を助けている。ゼブラフィッシュでは、正中線に位置する糸球体は、排出腔で互いに融合する前に、胚軸上下左右対称に実行するように分岐する2前腎細管への最初の血液濾過を担当しています。前腎 ​​細管は重く最終的に排出腔2-4を経由して、終了する前に、各種の溶質の交換を可能にする、セグメント化された尿細管に沿って、ろ液の移動を容易に運動性の繊毛が移入されている。 CKD株式会社の責任多くの遺伝子繊毛形成に関連するものをluding、ゼブラフィッシュ5に研究されている。しかし、主要なドローバック、遺伝子操作した後にゼブラフィッシュ腎機能を評価するのが困難となっている。ヒトで腎機能障害を測定するための伝統的なアッセイは、主に彼らの水生環境と小型サイズのため、ゼブラフィッシュに非翻訳を証明している。例えば、胚から血液を抽出するために、物理的に不可能であり、それらが小さすぎるように、尿素およびクレアチニン含有量の分析のために魚を上演した。また、ゼブラフィッシュは、多くの場合、最初の患者の検査中に実施されるシンプルな蛋白尿「ディップスティック」、上のテストのための十分な尿を生成しない。我々は、腎機能1,6-9からの読み出しを与えるように、血管系から出腎臓を介して、経時的に、定量的蛍光色素のクリアランスを監視するためにゼブラフィッシュの光透過性を利用した蛍光アッセイを記載する。

全世界で16万人16：バルデ-ビードル症候群（BBS）は約1に影響を与える稀な異質ciliopathyです。多嚢胞腎臓を含む関連する問題の数が存在する患者は、その後の患者は頻繁に腎臓透析や移植が24を必要とする。 ESRFはCKD 16を開発した患者の約30％で、BBSの死亡の最も一般的な原因である。現在、20の非関連遺伝子が公表遺伝子型 - 表現型関連でBBSに関与している。 B...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K ビュー.  University College London. ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。 

ビデオ: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...