著者らは、これらの技術の開発時に貴重な議論のためにプラナリア移植に関するアドバイスだけでなく、サンチェス·ラボの過去と現在のメンバーの千代子小林清和アガタに感謝します。この作品は、OCGおよびASAにNIH R37GM057260にNIHのトレーニンググラント（5T32 HD0791）によってサポートされていました。 ASAは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。

注：このプロトコルは、潜在的に有害物質の使用（鉛とクロレトン）を示唆している。取得する、読み取り、およびすべての潜在的に有害物質のMSDSに従ってください。 1。動物の文化、選択、および準備<ol><li>動物の培養と取り扱い利用プラナリアの水（1Xモンジュイック塩9）とプラスチック製の転送ピペットのために。 </li><li>通常の培養条件10の下に、実験室で発生したときに性的なバイオタイプSchmidteaメディを使用することができます。必要なサイズの無性標本を生成するために、S.通常の条件9下、室温で提起されたメディは、使用前に1〜2ヶ月は通常の頻度（週に2-3回）トリプルをダブルで供給する必要があります。また、通常の周波数で供給無性生殖動物はそれらの平均サイズを増加させるために、無期限に摂氏10度に保つことができる。 </li><li> 1〜2 cmの間である動物を選択します。長さ2 mmのより広いその後、動物に使用する前に3-7日を飢えさせる。 </li><li>意図ホスト、ドナー、または部分的に照射された動物の任意の薬理学的または放射線治療を行う場合は、この時点で治療（s）を実行します。 </li><li>薬理学的治療法が動物の餌を必要とすることが行われた場合、動物に使用する前に、さらに3〜7日を飢えさせる。 </li></ol> 2。ソリューションと材料の準備<ol><li>プラナリアの水に0.1から0.2パーセントw / vのクロレトンを溶解し、氷の上でソリューションを冷却することによりクロレトンソリューション、軽度の局所麻酔薬を準備します。 </li><li>部分照射を行う場合にのみ、2.​​7に進みます。組織移植のために2.3の手順に進みます。 </li><li>ブンゼンバーナーを使用して、90に移植組織を切断するために使用さ0.75ミリメートル内径、および移植片を受け取るホストの穴を作成するために使用さ0.7ミリメートル外径、キャピラリーチューブを曲げる℃で1〜2 cmの角EAの端からchの管。材料を節約するために、それぞれ毛細管の両端を曲げて二つのツールを生成するために半分に分割します。炎管の非常に端をしないように注意してください。 </li><li>指定されたサイズ以下の用紙をカット。 <ul><li>黒濾紙（長方形約に切る。2.5センチメートル×1.5センチ） </li><li>ワットマン＃3濾紙（長方形約に切る。2センチメートル×0.5センチ） </li><li>キムワイプ（折りたたみとワッ約に切る。3センチメートル×0.5㎝×4プライ） </li><li>たばこ圧延紙（長方形約にガムストリップカットを削除します。3センチメートル×2センチ） </li></ul></li><li>変更されたHoltfreterの溶液（3.5グラム/ LのNaCl、0.2グラム/ L NaHCO 3を 、0.05グラム/ LのKCl、0.2グラム/ L MgSO 4で 、0.1グラム/ LのCaCl 2、pHが7.0から7.5）を準備し、カゼインはHoltfreterのソリューションと寒さの飽和4℃の両方</li><li>ペルチェクーラープレートまたは解剖顕微鏡下に位置する他の冷却装置でパラと場所の正方形に折りたたまれたキムワイプを添付してください。チルドHoltfとキムワイプを飽和reterのソリューションとキムワイプ上の2つの黒濾紙の長方形を配置します。 </li><li>ワットマン＃2濾紙に沿ったペトリ皿。 Holtfreterの溶液をろ紙を湿らせ、氷上で料理を冷やす。部分的な照射のために大きい皿と濾紙のライナーを使用することができます。 </li></ol> 3。麻酔と固定<ol><li>皿に冷やしたクロレトンソリューションとピペットワームのペトリ皿を記入してください。移植の1つだけのホストと同時に一人のドナーの麻酔。部分的な照射のための多くの（N&gt; 10）動物は、一度に麻酔をすることができます。 </li><li>彼らが動かないようになるまでのワームはクロレトン溶液に浸漬することができます（5-10分）。 </li><li>チルドHoltfreterの溶液で満たさ皿にそれらをピペッティングすることによりワームをすすいでください。 </li><li>ピンセットで冷やしたHoltfreterのソリューションと東洋それらの腹側を下で飽和させた黒のろ紙上にそれらをピペッティングにより動物を固定する。動物は、LOCにできる場合表参道、過剰Holtfreterのソリューションを浴び、わずかにペルチェまたはコールドプレートの温度を下げる、またはクロレトン治療の長さを増加させる。 </li></ol> 4。部分照射注：部分的な照射のために動物を準備し、次の手順に従います。代わりに移植を行う場合は、セクション5に進みます。 <ol><li>トップソースのX線照射装置の内部に収まるようにアイスバケットの氷の上でステップ2.7から冷やしたペトリ皿を置きます。 </li><li>それらが固定化されている黒のろ紙を移動してペトリ皿の中の麻酔動物を配置します。直接麻酔ワームを移動するために鉗子を使用して、それらを傷つけることがあります。 </li><li>トランスポートは、最上位ソースX線照射に動物を配置し、動物に陰極管からの距離は、このように実効線量率を最大化、最小化されているような氷のバケツを置く。 </li><li>動物と陰極の間に位置トンの鉛シールド（S）（ 図1）UBEは、必要に応じて。シールズは、325kVのX線ビーム11の97から99パーセントの減衰を可能にするために、厚さ4.5〜6ミリメートルでなければなりません。 </li><li> X線線量を提供します。非シールドの領域から完全に幹細胞のアブレーションが必要な場合は、X線照射を使用して、30 Gyの以上を提供します。参考までに、30 Gyのは、320キロボルトと30センチのフィールドからソースへの距離と精度X線株式会社XRAD320 10ミリアンペアで3.6分に相当します。 </li><li>直ちに投与後黒濾紙、チルドプラナリアの水への転送動物のワームを処理、完了です。プラナリアの水は黒濾紙から自分自身を取り除くために、室温や動物に温めることをお勧めします。部分的な照射の手順はこれで完了です。 </li></ol> 5。組織移植<ol><li>ピペットと鉗子を用いて、Peltiに冷却されたキムワイプ上で黒濾紙の独立した四角形の上に麻酔をかけ、ホストとドナーワームを手配するerまたは解剖顕微鏡下でクーラープレート。 </li><li> 0.75ミリメートル、内径キャピラリチューブを使用すると、ドナーからの移植プラグを切り取って、鉗子を使用して、ホストの道の部分のうちの上に置きます。移植材料はキャピラリーチューブにはまり込む場合は、鉗子で取り除く。 </li><li> 0.7ミリメートル外径キャピラリーチューブは、ホストからプラグを取り外して使用して、残された穴に鉗子の位置グラフトを使用します。 </li><li>ステップ2.7に調製したペトリ皿に、その黒濾紙の長方形に移植されたホストに転送します。 </li><li>カゼイン飽和Holtfreterのソリューションを転がり一枚の紙を濡らし、 図2Aに図解として移植されたホストの上に置きます。 </li><li>カゼイン飽和Holtfreterの溶液に、 図2Bに図解として移植されたホスト包むろ紙4枚を浸す。 </li><li>カゼイン飽和Holtfreterの溶液中でカットキムワイプの4ワッドを浸し、それを上に置くステップ5.6ろ紙（ 図2B）。蓋を交換し、氷の上にペトリ皿を置く。 </li><li>癒す、回復するためにプラナリア水にドナーワームを転送し、再生成します。 </li><li>すべての移植が完了したら、一晩10℃のインキュベーターに移植されたワームを配置します。 </li><li>次の朝、移植を乱すワームを発見し、プラナリアの水で満たされたペトリ皿に（その黒濾紙上）それを転送しないように注意しながら。 </li><li>どちらのワームは、ろ紙から自分自身を取り除くか、静かにピンセットでそれを削除することができます。 </li><li> 2〜3日ごとに一度プラナリア水を変更します。 </li></ol> 6。代表的な結果すぐに部分的な照射プラナリアの後は、通常の影響を受けないと表示されます。線量および使用シールドのジオメトリに応じて、照射された組織が ​​退縮し、さらに7を分解することができます。シールドされた組織はそのまま維持する必要があります。 Follにより組織の回帰と組織の整合性の損失は、芽が形成され、不足している構造（ 図3A）再生成されます。切断が部分的に照射領域で行われている場合は、照射組織（ 図3B）（すなわち、回帰または崩壊防止）救出されます。切断された非照射プラナリア（ 図3C）と比較して、両方に無傷と切断された場合、再生が遅れます。 30 GyのX線線量が配信された、部分的に照射された動物が無傷されている場合は、使用される鉛シールドに対応するパターンで成功した幹細胞のアブレーションは、幹細胞のためのin situハイブリダイゼーションによる部分照射後2〜3日を確認することができるマーカーSMED-PIWI-1 12（別名smedwi-1）（ 図4）。 移植、移植組織の成功した移植片は、次の朝は明白ワットでなければなりませんホスト（ 図5A）の背腹両面に付着した、ホスト組織をithin。時折、移植だけで腹側または背側表面に付着します。移植は完全に失敗した場合、移植の兆候は、ホスト（ 図5B）のいずれかの背側または腹側表面から見えなくなります。まもなくSMED-PIWI-1（ 図5C主に移植内で幹細胞が存在することを明らかにするためのin situハイブリダイゼーション致死照射13,14によって、幹細胞のアブレーションされたホストに非照射組織の成功した移植後の。）さらに、致死的に照射されたホストへの非照射組織の成功した移植片は宿主組織とホスト15の長期生存の救助になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> 図1。基本的なコンポーネントの一般的な配置部分的な照射のためのsは、トップに配置X線源（陰極管）とX線照射では、麻酔プラナリアは、照射野内で直接X線源の下に配置されています。 X線の線量率を最大にするために、プラナリアとX線源との間の距離は最小限に抑える必要があります。鉛遮蔽体は、実用としてワームの近くに、冷陰極管と麻酔ワームの間に配置する必要があります。鉛シールドは、設計、製造、およびそれを盾所望の組織が完全にワームの残りの部分を公開するように配置する必要があります。多くの商業的製造には、シンプルなデザイン·ダイアグラムからカスタム鉛シールドを生成します。我々は正常にAlphaシステム株式会社（Bluffdale、UT）を使用しています。リード線はシールドの所望の量を可能にするために十分な厚さでなければなりません。 320 kVのX線ビームの遮蔽を完全に近い所望される場合、例えば、鉛は厚さ4.5〜6ミリメートルでなければなりません。プラナリアとシールドに配置されていますHoltfreterの浸したろ紙は、氷のバケツにかかっているペトリ皿に並んでいた。十分な大きさのX線照射野と同じ鉛シールドの数を考えると、多くの標本は、部分的に1時間（図示せず）に照射されることがあります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> 図2。回復室を構築しています。組織移植の回復室（A）分解図、カゼイン飽和Holtfreterの溶液に浸漬された後に互いの上に積層されているすべてのコンポーネントを示している。 （B）はほぼ完成し、回復室、治癒時の動きを防止するため麻酔プラナリア包むぴったり、ワットマン＃3濾紙の長方形の連動配置を示す。回復室の慎重な構造が迅速な治癒や組織の移植のより大きな効果を促進し、動物の動きや乾燥を防ぎます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> 図3。シンプルな後部部分照射の代表的な成果。デュボア7に記載されているように、（A）プラナリアの後部半分が鉛でシールドして、X線照射に前方の組織を暴露された照射とシールドの間の境界に戻って退縮が観察された組織その時点で無着色blastemasが形成され、動物が生成し始めた。 （B）一方、動物は（）で行われた同じ部分照射後に断頭したときに、組織の退縮は認められなかったし、残りの照射前組織が救助された。部分的に照射した動物は（B）の頭を再生し斬首斬首された非照射コントロール（C）と比較して、しかし、再生が大幅に遅れた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> 図4。代表outco部分照射は、次の部分幹細胞アブレーションの私。ホールマウントin situハイブリダイゼーション （ウィッシュ）幹細胞のマーカーSMED-PIWI-1は、野生型のプラナリアは、前方の組織を除いて自分の体全体に分散した幹細胞を持って明らかにする光受容体（矢印）と適切な咽頭（アスタリスク）14。 （A）照射が完全にシールドされたコントロールでSMED-PIWI-1を望むプラナリアは、照射後3日は、野生型プラナリアのものから区別がつかない幹細胞の分布を示しています修正しました。 （B）一方、前部と後部に露出したまま、部分的にしかシールドされた動物のSMED-PIWI-1を願うだけでなく、幹細胞は、非シールドの領域からアブレーションされていることを照射ショー後3日修正されました。スケールバーは500ミクロンです。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> 図5。エクサ成功および失敗した組織移植のmples。（）が正常に移植プラナリアの背腹ビュー移植後3日のライブ映像。移植は、（示されています）背腹両面にはっきりと表示され、移植片 - 宿主の界面での特性無着色組織で囲まれています。 （B）に対応して、失敗した移植は、移植部位（表示）で表示可能な移植組織を表示しない代わりに、失敗した移植から治癒、無着色、横方向の傷を示しています。 （B）他から見て背側または腹面のみに付着した一方の側から見たときに成功した移植（）似ている移植片と移植失敗した。 （C）野生型（wt）組織が ​​常駐し、幹細胞、移植幹細胞のアブレーションされた照射宿主に移植された場合、後で移植後SMED-PIWI-1の 2日間WISHによって明らかにされている移植の成功は、明確にのみ移植場所や周りの幹細胞（矢頭）の具体的な存在で表示されます。スケールバーは500ミクロンです。

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利害の衝突が宣言されません。

固定化の重要性固定化ははるかにこれらのプロセスのいずれかが正常に完了するための最も重要なステップです。プラナリアが不適切な部分照射の前に固定化されている場合、それらは矛盾した交絡結果を生成し、鉛シールドの下に移動する可能性があります。動物が不十分移植後の固定化している場合はさらに、ホストのワームは、おそらくホストに適切に癒すために移...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>汎用ピペット</td><td>サムコ</td><td> 691 </td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ（ID 0.75ミリメートル） </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ（外径0.7ミリメートル） </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td>パラフィルムM </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td>キムワイプ34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td>黒濾紙</td><td>シュライヒャー＆シュル</td><td> 10310809 </td></tr><tr><td>ワットマン＃2濾紙1002から055 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09-810B </td></tr><tr><td>ワットマン＃3濾紙1003から185 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09-820E </td></tr><tr><td>たばこローリングペーパー</td><td>ジグザグ、元の</td><td> NA </td></tr><tr><td>ペトリ料理</td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td>鉗子デュモン、INOX第5位</td><td> FST </td><td> 11251から20 </td></tr><tr><td>クロレトン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 112054 </td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3400 </td></tr><tr><td>シールズをリード</td><td>アルファシステム（株）、Bluffdale、UT </td><td>カスタム設計</td></tr><tr><td> XRAD-320の生物照射装置</td><td>精密X線、北ブランフォード、コネチカット州</td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

プラナリア、淡水扁形動物は、後生動物の再生と幹細胞生物学1,2を解剖するための強力なシステムであることが判明した。欠落または損傷した組織のプラナリア再生は成体幹細胞によって実現されていますneoblasts 3と呼ばれる。これらの幹細胞が決定的に多能性と全体の動物の4を再構成するの単独で可能であることが示されているが、幹細胞集団とそれらの細胞の行動のダイナミクス内の不均一性は、主に未解決のままである。多数とプラナリアのボディプラン全体の幹細胞の広範な分布のために、in vivoでの分子および機能的研究のための幹細胞の集団を操作するための高度な手法が必要とされている。 組織移植と部分的な照射プラナリア幹細胞の集団がさらなる研究のために分離することのできる2つの方法です。各手法は、異なる利点があります。 T問題移植のいずれかの本質的に遺伝的に異なっている、または以前に薬理学的に扱われているライブラリー - 全曲無料試聴できるホストに、幹細胞の導入を可能にします。また、部分照射は、創傷の導入や組織の整合性の任意の逆子なく、幹細胞を欠いている組織に並置ホスト内で幹細胞の単離を可能にします。これら二つのメソッドを使用して、1つは、増殖、分化、および移行などの幹細胞機能を制御する細胞自律非自律因子を調べることができます。 組織移植5,6および部分照射7の両方が、今日研究されて残っているプラナリアの再生に関する質問の多くを定義するのに歴史的に使用されている。しかし、これらの技術は、従来の方法の骨の折れると矛盾した性質のために十分に活用残っています。ここで提示されたプロトコルは、時間を減少させる前方に大きな一歩を表してND再現性100％に近い効能を持つグラフトまたは部分的に照射した動物を大量に生成するために必要な努力。我々は、大型動物の培養、固定化、部分的な照射のための準備、組織移植、動物の回復の最適化をカバーしています。さらに、ここで説明する作業は、最も広く研究されているプラナリア、Schmidteaメディで使用するための部分的な照射法の最初のアプリケーションを示しています。さらに、プラナリアに移植効率的な組織が ​​長い哺乳類8に成体幹細胞の可能性をアッセイの金の標準的な方法されている再投入アッセイにおけるナイーブまたは処理された幹細胞の集団の機能テストのためにドアを開きます。これらの技術の幅広い採用は組織の恒常性や再生中の成体幹細胞の細胞挙動の理解につながるのは間違いない。

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

プラナリアの間に定義された一貫性のある大きさの組織を移植するための効果的な方法が記載されている。も含まれて移植に使用される固定化技術が生きた動物の部分的な照射のために、鉛の盾と一緒に、適合させることができる方法の説明です。

プラナリアの固定化、部分照射し、組織移植

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K ビュー.  University of Utah School of Medicine. プラナリアの間に定義された一貫性のある大きさの組織を移植するための効果的な方法が記載されている。も含まれて移植に使用される固定化技術が生きた動物の部分的な照射のために、鉛の盾と一緒に、適合させることができる方法の説明です。

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Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

マウス皮膚移植

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

生物学

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

マウスでXenografting胚細胞移植と精巣組織

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

腸の部分的な閉塞のマウス モデル

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.