Os autores gostariam de agradecer a Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata para conselhos úteis sobre transplante planária, bem como membros do passado e do presente do laboratório Sánchez para discussões valiosas durante o desenvolvimento dessas técnicas. Este trabalho foi financiado pelo NIH Training Grant (5T32 HD0791) para OCG e R37GM057260 NIH para ASA. ASA é um Howard Hughes Medical Institute.

Nota: este protocolo sugere a utilização de materiais potencialmente perigosos (chumbo e chloretone). Adquira, leia e siga FDS para todos os materiais potencialmente perigosos. 1. Cultura Animal, Seleção e Preparação <ol><li> Para a cultura animal e água manuseamento planária utilização (1X sais Montjuïc 9) e pipetas de transferência de plástico. </li><li> Sexual biótipo Schmidtea mediterranea pode ser usado quando levantada no laboratório sob condições de cultura normal 10. Para produzir amostras de tamanho assexuadas requisito, S. mediterranea levantado à temperatura ambiente sob condições normais 9 deve ser alimentado ao dobro de frequência normal triplo (2-3 vezes por semana) por um a dois meses antes da utilização. Alternativamente, os animais alimentados com uma frequência assexuadas normal pode ser mantida a 10 graus Celsius indefinidamente, a fim de aumentar o seu tamanho médio. </li><li> Seleccionar animais que estão entre 1 a 2 cm emcomprimento e mais largo do que 2 mm, em seguida, fome animais 3-7 dias antes da utilização. </li><li> Se efectuar quaisquer tratamentos farmacológicos ou radiológica em hosts destinados, doadores, ou animais irradiados parcialmente, realizar o tratamento (s) neste momento. </li><li> Se os tratamentos farmacológicos foram realizados à exigida a alimentação dos animais, starve animais um período adicional de 3 a 7 dias antes da utilização. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e materiais <ol><li> Preparar a solução chloretone, um anestésico local, leve, por dissolução de 0,1-0,2% w / v em água chloretone planária e arrefecimento a solução sobre gelo. </li><li> Se realizar a irradiação parcial apenas, avance para o passo 2.7. Para o transplante de tecidos continue no passo 2.3. </li><li> Usando um bico de Bunsen, dobre 0,75 mm de diâmetro interior, utilizados para o corte do tecido do enxerto, e 0,7 mm de diâmetro exterior, usado para a criação de um buraco no hospedeiro que irá receber o enxerto, tubos capilares a um ângulo de 90 ° em 1-2 cm a partir da extremidade de bistubo ch. Para poupar material, dobre ambas as extremidades de cada tubo capilar e quebrar-los em meio para produzir duas ferramentas. Tome cuidado para não chama os confins dos tubos. </li><li> Corte os seguintes documentos para os tamanhos indicados: <ul><li> Negro de papel de filtro (cortado em rectângulos de aprox. 2,5 cm x 1,5 cm) </li><li> Whatman # 3 papel de filtro (cortado em rectângulos de aprox. 2 cm x 0,5 cm) </li><li> Kimwipe (dobrado e cortado em aprox chumaços. 3 cm x 0,5 cm x 4 ply) </li><li> Papel de cigarro rolando (remova a tira de goma e corte em retângulos. Aproximadamente 3 cm x 2 cm) </li></ul></li><li> Preparar solução modificada de Holtfreter (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO3, 0,05 g / L de KCl, 0,2 g / L MgSO4, 0,1 g / L de CaCl2, pH 7,0-7,5) e solução saturada de caseína Holtfreter e frio tanto a 4 ° C. </li><li> Anexar uma Kimwipe dobrado a um quadrado de Parafilm e coloque sobre Peltier placa refrigerador ou outro dispositivo de resfriamento situada sob um microscópio de dissecação. Saturar o Kimwipe com Holtf refrigeradossolução de reter e coloque dois retângulos pretos de papel de filtro sobre o Kimwipe. </li><li> Linha de pratos de Petri com papel Whatman n º 2 do filtro. Umedeça o papel de filtro com a solução Holtfreter e relaxar os pratos de gelo. Para a irradiação parcial um prato maior eo revestimento de papel de filtro pode ser usado. </li></ol> 3. Anestesiados e Imobilização <ol><li> Encha uma placa de Petri com solução chloretone refrigerados e vermes pipeta no prato. Para o transplante apenas anestesiar um hospedeiro e um doador de cada vez. Para irradiação parcial muitos (n&gt; 10) os animais podem ser anestesiados de uma só vez. </li><li> Permitir vermes de molho na solução chloretone até que se tornem imóvel (5-10 minutos). </li><li> Lavar vermes pipetando-los em um prato cheio com solução refrigerada de Holtfreter. </li><li> Imobilizar animais pipetando-los em papel de filtro preto saturado com solução Holtfreter refrigerados e orientá-los lado ventral para baixo com uma pinça. Se os animais são capazes de locomote, absorva o excesso da solução Holtfreter, diminuir um pouco a temperatura do seu Peltier ou placa fria, ou aumentar a duração do tratamento chloretone. </li></ol> 4. Irradiação parcial Nota: Siga estes passos para preparar animais para irradiação parcial. Se realizar o transplante em vez disso, vá para a seção 5. <ol><li> Coloque uma placa de Petri refrigeradas a partir do passo 2,7 no gelo em um balde de gelo que vai caber dentro de uma fonte superior de raios-X irradiador. </li><li> Dispor animais anestesiados em uma placa de Petri, movendo o papel preto filtro sobre a qual estão imobilizados. Utilizando uma pinça para mover vermes anestesiados directamente, podem prejudicá-las. </li><li> Transporte dispostas animais para um topo fonte de raios-X irradiador e situar o balde de gelo de tal modo que a distância do tubo de cátodo para os animais é minimizado, maximizando assim a taxa de dose eficaz. </li><li> Posição de chumbo blindagem (s) (Figura 1) entre os animais e para o cátodo tUbe, como desejado. Escudos deve ser de 4,5 a 6 mm de espessura para permitir a 97-99% de atenuação de um raio-X 325kV feixe 11. </li><li> Entregar X-ray dose. Se ablação completa de células-tronco a partir de regiões não-blindados é desejada, entregar 30 Gy ou mais usando um irradiador de raios-X. Para referência, 30 Gy é equivalente a 3,6 minutos a 320 kilovolts e 10 miliamperes em uma precisão X-Ray Inc. XRAD320 com uma distância de campo-a-fonte de 30 centímetros. </li><li> Imediatamente após a administração é completa, lidar com vermes pelo filtro de papel preto, animais de transferência em água refrigerada planária. Permitir que a água planária aquecer até à temperatura ambiente e os animais para desalojar-se a partir do papel de filtro preto. O procedimento de irradiação parcial está concluída. </li></ol> 5. Transplante de Tecidos <ol><li> Usando uma pipeta de transferência e fórceps, organizar anfitrião anestesiados e vermes doadores em retângulos de papel separadas filtro preto no Kimwipe que tem sido arrefecido no Peltier ou resfriador sob o microscópio de dissecação. </li><li> Usando um tubo de 0,75 milímetros de diâmetro interno capilar cortar a ficha enxerto do doador e, usando uma pinça, coloque-o sobre um fora da porção caminho do host. Se o material do enxerto fica preso no tubo capilar, desalojar com uma pinça. </li><li> Usando um tubo de 0,7 milímetros de diâmetro exterior capilar remover um tampão a partir do hospedeiro e usando fórceps posição do enxerto dentro do orifício que é deixado para trás. </li><li> Transfira o anfitrião transplantado em seu retângulo de papel preto do filtro em placa de Petri preparada no passo 2.7. </li><li> Molhar um pedaço de papel de rolamento com uma solução de caseína Holtfreter saturada e colocá-lo na parte superior do hospedeiro transplantado como ilustrado na Figura 2A. </li><li> Embeber quatro pedaços de papel de filtro em solução saturada de caseína Holtfreter e envolvem o hospedeiro transplantado como ilustrado na Figura 2B. </li><li> Mergulhe quatro maços de Kimwipe corte em caseína solução saturada Holtfreter e colocá-los sobreo papel de filtro a partir do passo 5.6 (Figura 2B). Colocar a tampa e colocar a placa de Petri sobre gelo. </li><li> Transfira o worm doador em água planária para recuperar, curar e regenerar. </li><li> Quando todos os transplantes são completadas, colocar os vermes transplantadas para um incubador a 10 ° C durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, tomando cuidado para não perturbar o enxerto, descobrir a minhoca e transferi-lo (em seu papel preto filtro) para uma placa de Petri com água planaria. </li><li> Permitir que o worm para desalojar-se do papel de filtro ou removê-lo suavemente com uma pinça. </li><li> Troque a água planária uma vez a cada 2-3 dias. </li></ol> 6. Os resultados representativos Imediatamente após planaria irradiação parcial vai parecer normal e não afetado. Dependendo da dose administrada e da geometria da blindagem usado, tecido irradiado pode regredir e até mesmo se desintegram 7. Tecido blindado deve permanecer intacta. Follregressão tecido devido e uma perda da integridade dos tecidos, uma blastema irá formar estruturas e ausentes serão regenerada (Figura 3A). Se uma amputação é feita na região parcialmente irradiado, o tecido irradiado será resgatado (isto é impedido de regressão ou de desintegração) (Figura 3B). Em ambos os não lesionado e à regeneração caso amputado será atrasada, em comparação com um amputado não irradiado planaria (Figura 3C). Se uma dose de raios-X de 30 Gy foi entregue eo animal foi parcialmente irradiado não lesionado, a ablação de células estaminais bem sucedida em um padrão correspondente com o escudo de chumbo utilizado pode ser confirmado 2 a 3 dias após a irradiação parcial por hibridização in situ para a célula haste marcador Smed-piwi-1 12 (aka smedwi-1) (Figura 4). Na manhã após o transplante, um enxerto bem sucedida do tecido transplantado deve ser w óbviasithin o tecido do hospedeiro, tendo adere a ambas as superfícies dorsal e ventral do hospedeiro (Figura 5A). Ocasionalmente, o enxerto irá aderir ao apenas a superfície ventral ou dorsal. Se o transplante foi completamente bem sucedida, nenhum sinal do enxerto será visível a partir de qualquer superfície dorsal ou ventral do hospedeiro (Figura 5B). Pouco tempo depois de um enxerto bem sucedida de não irradiado tecido num hospedeiro que tinha sido ablated de células estaminais por irradiação letal 13,14, hibridização in situ para Smed-piwi-1 irá revelar que as células estaminais estão presentes principalmente dentro do enxerto (Figura 5C ). Além disso, os enxertos de sucesso de tecido não irradiado em hospedeiros letalmente irradiados irá resultar em salvamento do tecido do hospedeiro e sobrevivência a longo prazo do hospedeiro 15. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> Figura 1. Arranjo geral do componente básicos para irradiação parcial. Em um irradiador de raios-X com um topo posicionado fonte de raios X (tubo de cátodo) a planária anestesiados está posicionado directamente por baixo da fonte de raios X no interior do campo de irradiação. A fim de maximizar a taxa de dose de raios-X, a distância entre a planária ea fonte de raios-X deve ser minimizada. Um escudo de chumbo deve ser posicionado entre o tubo de cátodo e do verme anestesiados, o mais próximo do verme como prático. O escudo de chumbo deve ser projetado, fabricado, e posicionado de modo que ele protege o tecido desejado, mas completamente expõe o resto do worm. Muitos comercial fabrica irá produzir escudos de chumbo personalizados a partir do diagrama de design simples, temos utilizado com sucesso Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT). O chumbo deve ser suficientemente espessa para permitir a quantidade desejada de blindagem. Por exemplo, se quase completa da blindagem de um kV 320 feixe de raios X é desejado, o chumbo deve ser de 4,5 a 6 mm de espessura. A planária e escudo são posicionadas sobrepapel embebido um Holtfreter do filtro alinhada placa de Petri, que descansa em um balde de gelo. Dado um campo de irradiação suficientemente grande de raios-X e um número de escudos de chumbo idênticas, as amostras de muitos pode ser parcialmente irradiadas a um tempo (não ilustrado). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> Figura 2. Construindo a câmara de recuperação. (A) Uma vista explodida da câmara de recuperação do tecido do transplante, mostrando todos os componentes que são mergulhados no topo de uma outra depois de ser embebido em solução saturada de caseína Holtfreter do. (B) Uma câmara de recuperação quase completa, ilustrando a colocação de encravamento da Whatman # 3 rectângulos de papel de filtro que se ajustem envolvem o planária anestesiados, impedindo o movimento durante a cura. A construção cuidadosa da câmara de recuperação impede o movimento dos animais e dessecação, promovendo uma rápida cicatrização e maior eficácia dos transplantes de tecidos. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados representativos de irradiação posterior parcial simples. Como Dubois descritos 7, (A) quando a metade posterior da planárias foram protegidos com chumbo e em seguida exposto a irradiação de raios-x do tecido anterior foi observada a regredir de volta para o limite entre o irradiado e blindado tecido em que blastemas ponto sem pigmento formado e os animais começaram a regenerar. (B) Por outro lado, quando os animais foram decapitados após a irradiação mesmo parcial realizada em (A), regressão do tecido não foi observada eo tecido irradiado restante anterior foi resgatado. O decapitados animais irradiados parcialmente cabeças regenerada (B), no entanto, a regeneração foi significativamente retardada em comparação com controlos não irradiados decapitados (C). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> Figura 4. Representante outcome de ablação parcial de células estaminais na sequência de irradiação parcial. montagem Whole-A hibridação in situ (pedido) para o marcador de células estaminais Smed-piwi-1 revela que planaria tipo selvagem têm células estaminais distribuído por todo o corpo com a excepção de o tecido anterior à fotorreceptores (ponta de seta) e da faringe adequada (asterisco) 14. (A) Desejo de Smed-piwi-1 no controle irradiado mas totalmente blindado planaria fixado três dias após a irradiação apresenta uma distribuição de células-tronco que é indistinguível da planaria tipo selvagem. (B) Por outro lado, desejam para Smed-piwi-1 em animais que foram apenas parcialmente protegidos, deixando o exposto anterior e posterior, mas também foram fixadas três dias a seguir mostra irradiação que as células estaminais são ablacionados a partir das regiões não blindados . Barras de escala são 500 microns. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> Figura 5. Examples de transplante de tecido com sucesso e insucesso. (A) ao vivo imagens de vistas dorsal e ventral de uma planária transplantado com sucesso três dias após o transplante. O enxerto (indicado) é claramente visível em ambas as superfícies dorsal e ventral e está rodeada com o tecido não pigmentado característica na interface enxerto-hospedeiro. (B) correspondente, transplantes mal sucedidos não apresentam qualquer tecido do enxerto visível no local de transplante (indicada) e, em vez mostrar um curada, ferida, despigmentado lateral do transplante falhou. Um enxerto que adere à apenas dorsal ou a superfície ventral pode assemelhar-se um transplante bem sucedido (A) quando visto de um lado e um transplante de insucesso (B) quando visto a partir do outro. (C) Quando tecidual de tipo selvagem (wt) é enxertado em um hospedeiro que tenha sido irradiado ablated de células estaminais residentes e as células transplantadas são posteriormente revelado por desejo de Smed-piwi-1 de dois dias após o transplante eo sucesso do transplante é claramente mostrado pela presença específica de células-tronco só ou em torno da localização do enxerto (pontas de seta). Barras de escala são 500 microns.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Importância da imobilização A imobilização é, de longe, o passo mais crítico para a conclusão com êxito de qualquer destes processos. Se planaria são indevidamente imobilizado antes da irradiação parcial, podem mover-se sob o escudo de chumbo, produzindo resultados inconsistentes e de confusão. Além disso, se os animais são insuficientemente imobilizada após o transplante, o verme hospedeiro provavelmente afastar-se do tecido do enxerto, o que resulta numa falha do enxerto para ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> General Purpose Transferência Pipetar </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Os tubos capilares (milímetros ID 0,75) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Os tubos capilares (OD 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Papel de filtro preto </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman n º 2 1002-055 papel de filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> Whatman # 3 papel de filtro 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Papel de cigarro rolando </td><td> Zig-Zag, original </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petripratos </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Pinças DUMONT, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Caseína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Chumbo Shields </td><td> Alfa Systems Corp, Bluffdale, UT </td><td> Design personalizado </td></tr><tr><td> XRAD-320 Irradiador Biológica </td><td> Precision X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

A planária, um verme de água doce, tem provado ser um poderoso sistema para dissecar regeneração metazoários e haste 1,2 biologia celular. Regeneração planária de quaisquer tecidos danificados ou ausentes é tornada possível pelas células estaminais adultas denominado neoblasts 3. Embora essas células-tronco foram definitivamente demonstrou ser pluripotentes e singularmente capaz de reconstituição de um animal inteiro 4, a heterogeneidade dentro da população de células-tronco ea dinâmica de seus comportamentos celulares permanecem sem solução. Devido ao grande número e distribuição ampla de células-tronco ao longo do plano do corpo planária, métodos avançados para a manipulação de subpopulações de células estaminais para o estudo molecular e funcional in vivo são necessários. Transplante de tecidos e irradiação parcial são dois métodos pelos quais uma subpopulação de células-tronco planária podem ser isoladas para estudo posterior. Cada técnica tem vantagens distintas. Ttransplante questão permite a introdução das células estaminais, num hospedeiro ingénuos, que são inerentemente qualquer geneticamente distintas ou que tenham sido previamente tratados farmacologicamente. Alternativamente, a irradiação parcial permite o isolamento de células-tronco dentro de um hospedeiro, justaposta ao tecido desprovido de células estaminais, sem a introdução de uma ferida ou qualquer culatra em integridade do tecido. Usando estes dois métodos, pode-se investigar os fatores celulares autónomos e não autónomos que controlam funções de células-tronco, tais como a proliferação, diferenciação e migração. Tanto o tecido transplante 5,6 e irradiação parcial 7 têm sido usado historicamente na definição de muitas das questões sobre regeneração planária que permanecem em estudo hoje. No entanto, estas técnicas têm permanecido subutilizada devido à natureza trabalhoso e inconsistente de métodos anteriores. Os protocolos apresentados aqui representam um grande passo na diminuição do tempond esforço necessário para gerar reproduzível um grande número de animais enxertados ou parcialmente irradiada com eficácias que se aproximam de 100 por cento. Nós cobrimos a cultura de animais de grande porte, imobilização, a preparação para irradiação parcial, o transplante de tecidos, ea otimização da recuperação de animais. Além disso, o trabalho aqui descrito demonstra a primeira aplicação do método de irradiação parcial para uso com o planária mais amplamente estudados, Schmidtea mediterranea. Além disso, o tecido eficiente enxertia em planaria abre a porta para o teste funcional de subpopulações de células-tronco ingênuos ou tratados nos ensaios de repovoamento, que tem sido o método padrão-ouro de se avaliar o potencial das células-tronco adultas em mamíferos 8. A ampla adoção destas técnicas irá sem dúvida levar a uma melhor compreensão dos comportamentos celulares de células-tronco adultas durante a homeostase e regeneração tecidual.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K visualizações.  University of Utah School of Medicine. Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.

Vídeo: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Transplante de pele murinos

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Biologia

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Um modelo do rato de obstrução Intestinal parcial

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching como uma leitura comportamental quantitativa para sensoriamento de estímulos nocivos

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

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