この作品は、CIRM早期トランスレーショナルII研究賞TR2-01821、NIH / NIDCR（助成金R21 DE0177711とRO1 DE01607）、UCディスカバリーグラント07から10677まで、アブレシブウォータージェット用とRKSによってサポートされていました持っているT32の訓練フェローシップ賞（5T32DE007296-14）、JNZ CIRM研修フェローシップ（TG2-01169）があります。

1。血管幹細胞の分離これはM. Corselli らによって、隣接した記事&quot;ヒト白色脂肪組織からの血管周囲性幹細胞の精製&quot;で詳細に説明されています。 2。足場の作成<ol><li>足場は、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA、Burminghamポリマー）ハイドロキシアパタイトコーティング4-6から以前に発行されたプロトコルごとにカスタムメイドされています。アパタイトコーティングPLGA足場は溶媒キャストと粒子浸出プロセスによってPLGA 15分の85から製造される。足場は、筋肉の袋注入、大腿骨分節性欠損のために円板状頭蓋冠注入の形状（直径4ミリメートル）、または円筒形（直径4mm、長さ6ミリメートル）の球形（直径2mm）で作成されます。 </li><li>簡単に言えば、PLGA /クロロホルムソリューションは、カスタムメイドの短所を作成するには、200から300μmの直径のテフロン型にキャストされ、ショ糖（高分子/スクロース比5/95、w / w）のと混合truct。一晩凍結乾燥した後、足場は、テフロン製の型から削除され、ショ糖を溶解するためのddH 2 O中に浸漬した。足場は、DDH 2 O 3のリンスに続いて、30分間70％エタノールに浸漬して消毒されている</li><li>アパタイトコーティングのために、擬似体液（SBF）溶液を順次のCaCl 2、MgCl 2を溶解して調製します。•6H 2 O、飽和NaHCO 3、K 2 HPO 4のddH 2 Oの•3H 2 O溶液のpHは、溶解性を高めるために1M塩酸を加えて6に低下します。のNa 2 SO 4は、KClおよびNaClが追加され、最終的なpHは6.5（SBF 1）に調整されます。 </li><li> Mg2 +とHCO 3 -無料のSBF（SBF 2）CaCl 2とのddH 2 O中のK 2 HPO 4•3H 2 Oを添加し、pHを6に下げられることにより調製される。 KClおよびNaClを添加して最終pHを6.8に調整されます。すべてのソリューションは、0.22μmのPES membrに通して濾過滅菌していますANE（ナルゲン）。コー​​ティングプロセスの直前に、乾燥したPLGA足場は濡れおよびコーティングの均一性を向上させるためにグロー放電アルゴンプラズマエッチング（Harrickサイエンティフィック）に供されています。 </li><li>エッチングされた足場は、その後12時間SBF 1でインキュベートし、Mg2 +とHCO 3に変更されます- 37で別の12時間無料のSBF 2°C穏やかに撹拌下に。コーティングされた足場は、過剰なイオンを除去するためのddH 2 Oで洗浄し、事前の詳細な検討を行うために凍結乾燥されています。 </li></ol> 3。筋肉ポーチモデル注入<ol><li> PBSでPSCの懸濁液（リン酸緩衝生理食塩水）100μlを静かに注入する直前に球状PLGAベースのインプラントの上にドロップされます。細胞は、in vivo追跡後注入で許可するように、ホタルルシフェラーゼのレンチウイルス挿入によって事前に標識されています。細胞密度は、インプラントあたり2.5×10 5である。 </li><li> SCID（重症複合免疫不全）マウス6週齢で使用されます。動物はanesです。イソフルラン吸入thetizedとブプレノルフィン（ベッドフォードラボ）とpremedicated。標準Betadine準備した後、後肢の二国間切開（長さで縦2 mm）を作られています。 </li><li>ポケットは筋線維長軸に平行な鈍的切開により大腿二頭筋の筋肉にカットされています。各マウスについては、PSCのとPLGAベースのインプラントが挿入され、筋肉を覆う筋膜は、5から0 Vicryl（エチコン）で縫合されています。 </li><li>皮膚は、次のクチクラパターンで5から0 Vicrylで閉じられます。 10日間、動物は48時間とTMP / SMX（Qualitestトリメトプリム/スルファメトキサゾール）のブプレノルフィンと術後に扱われます。 </li></ol> 4。頭蓋骨欠損モデル注入<ol><li> SCIDマウス（12-14週齢）のイソフルラン麻酔した後、髪が切り取られ、皮膚は、プロトコルごとにbetadineで消毒。 </li><li> 8 mmの皮膚切開は、マウスの頭蓋冠の中央矢状縫合に沿って行われます。次に、calvArialの骨膜は優しくQ-Tipのアプリケーションによって削除されます。 </li><li>次に、高速歯科用ドリルのダイヤモンドコーティングされたトレパンビットを使用して、4 mmの頭頂骨欠損が作成されます。欠陥は、完全な厚さである - しかし、ケアは、基礎となる硬膜を傷つけないように注意されています。 </li><li>移植されたPSCのとカスタムメイドのPLGAベースのインプラントは、その後、欠陥部位に優しく置かれます。細胞密度は、インプラントあたり2.5×10 5である。最後に、皮膚は6から0 Vicrylで縫合されています。動物は、10日間の48時間とTMP / SMX用のブプレノルフィンと術後に扱われます。 </li></ol> 5。大腿骨部分欠損モデル注入<ol><li>無胸腺ラット（12-14週齢）は、イソフルラン吸入麻酔下にあります。大腿骨は、スクラブとbetadine（ 図1）標準プロトコルごとに用意されています。 </li><li> 27から30 mmの縦切開を大腿骨の前外側面を介して行われています。大腿骨骨幹部は、その後広LATを分離することによって公開されているeralisと大腿二頭筋の筋肉（ 図2）。 </li><li>骨再生の一貫性を最大限にするために、大腿部の欠陥を覆う骨膜が完全に切除大腿セグメントで削除されます。 </li><li>ポリエチレン板（長さ23ミリメートル、幅4ミリメートル、高さ4 mm）の大腿骨の前外側面に配置されます。プレートは0.9 mm径のねじキルシュナー鋼線（ジマー）を収容するために6つのプレあけられた穴を含んでいます。テンプレートとしてプレートを取って、6スレッドのキルシュナー鋼線は、プレートの両方野（ 図3）を介して掘削されています。 </li><li>次に、小さな振動鋸刃（ストライカー、MI）で、6 mmの半ば骨幹欠陥が作成されます。分節欠陥は、プロトコルに従って細胞（ 図4）を積んであったPLGAベースのインプラントを挿入することにより処理されます。 </li><li>覆っている筋肉や筋膜が所定の位置にインプラントを確保するために4から0 Vicryl吸収性縫合糸で閉じられており、皮膚を縫合しています。 </li&gt; </ol> （6） 生体内評価では <ol><li> X線評価は高解像度XRと高解像度μCT（マイクロコンピュータ断層撮影）分析の両方によって長手方向の方法で実行されています。 μCT解析（Skyscan 1172F）の場合、画像は、19.73μmの（100 kVおよび100 mAの放射線源、0.5ミリメートルアルミフィルターを使用）の解像度でスキャンされます。画像はDataViewer、偵察、CTAN、とCTVolソフトウェアを用いて分析されています。 </li><li>生物発光イメージングは​​、細胞の生着、生存、増殖を評価し、インプラントのサイトの移行を除外するには、シリアル方法で行われます。生物発光イメージングは​​、IVISルミナIIデバイス（キャリパーライフサイエンス）を使用して実行されます。光出力は、リビングイメージのソフトウェア（Xenogen）を用いて定量されています。全光出力が光子/平方/秒CM /ステラジアンに記録されます。 </li><li>組織学的および組織形態分析は、事後に実行されます。採用ルーチン汚れマッソントリクローム、アニリンブルー、pを含むentachrome、とPicrosirius赤。組織形態計測学的分析は骨は、それぞれ青と黄色の暗い表示される、アニリンブルーまたはpentachrome汚れのいずれかで容易に実行されます。ハイパワーフ​​ィールドあたりのピクセル数は、Adobe Photoshopの魔法の杖ツールを使って計算されます。 </li></ol> 7。代表的な結果頭蓋骨と大腿部の欠陥の両方が重要なサイズであるため、有意な治癒は、増殖因子または外因性幹細胞を治療せずに期待するべきではありません。 手術手技の面では、筋肉の袋郭清は、筋膜面に沿ってなければならないため、最小限の出血が発生する必要があります。筋肉のポーチモデルは両側実行されているにもかかわらず、マウスは術後1日目で容易に歩行する必要があります。頭蓋冠の欠陥のために、出血が発生しているが、Q-ティップに浸漬させたことができます。細心の注意は、基礎となる硬膜を傷つけないように注意すべきである - これが干渉しますので正常な治癒である。 FSDモデルでは、注意が神経学的損傷を防ぐために、過度の出血や大腿神経を引き起こすことがないように主要な血管を傷つけないように注意されています。キルシュナー鋼線はようにプロセスの皮質骨を損傷しないように穏やかな圧力で掘削されています。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> 図1。無胸腺ラットの大腿骨部分欠損に対する術前準備（FSD）。雄性ラット（12-14週齢）は、イソフルラン吸入麻酔下にあります。大腿骨は、スクラブでbetadine標準プロトコルごとに整形処理。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> 図2。大腿骨分節障害（FSD）を作成するための外科的露出 。 27〜30ミリメートル縦切開を大腿骨の前外側面を介して行われています。大腿骨軸の外側面は、その後外側広筋を分離することによって公開されていると大腿二頭筋の筋肉。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> 図3。大腿骨分節障害（FSD）を作成するための固定 。ポリエチレン板（長さ23ミリメートル、幅4ミリメートル、高さ4 mm）の大腿骨の前外側面に配置されます。プレートは0.9 mm径のねじキルシュナー鋼線を収容するために6プレあけられた穴を含んでいます。テンプレートとしてプレートを取って、6スレッドのキルシュナー鋼線は、プレートの両方野貫通されています。次に、6ミリメートル半ば骨幹欠陥が作成されます。これが実行されると、カスタムメイドの足場を直接正確に欠陥部位（図示せず）を嵌合する挿入されます。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> 図4。術後頭蓋骨欠陥の例を示します 。 4ミリメートル、円形の頭蓋骨欠損は無胸腺マウスの右頭頂骨に作成されます。ここでイメージングを移植した欠陥サイトです。術後8週でのPSC。欠陥サイト内の新生骨の存在を注意してください。

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KT、BP、およびCSは、UCLAから提出血管幹細胞関連特許の発明者である。博士。 KTと、CSはUCリージェンツから血管幹細胞関連特許をサブライセンス傷を残さない·ラボラトリーズ社の創設者である。博士嘉秀も傷の研究所、株式会社の役員です。

PSCsの分離がよく、特にPSCの分離プロトコルとメソッドを扱う別々に提出されJoveの出版物を含め、他の1から3に記載されています。この記事の特定の目的は、骨形成/再生のためのin vivoでのアプリケーションで PSCの3プロトコルを記述し、実証することである。 SCIDマウスの筋肉のポーチは異所性ヒト骨形成の7の一般的に説明したモデルです。重要な違いは、ホストの骨形成細胞8と同様に骨格欠陥の微小環境に存在する骨形成シグナル伝達因子の豊富とのパラクリン相互作用を含む、骨の異所性及び同所性（欠陥）のモデルの間に存在しています。 2つの欠陥は、ここでは頭蓋骨defect8と大腿骨分節性欠損4表示されます。両方が（つまり、自分自身で治癒されません）サイズ重要であることがよく記載されています。 興味深い違いは、頭蓋骨や大腿骨の欠陥との間に存在する。最初に、セル：異種移植のPSCと内因性の細胞間の細胞の相互作用は非常に異なっている。頭蓋冠の欠陥の面では、PSCは、基礎となる硬膜（髄膜の最外層）と同様に、欠陥サイトに外接するそれらの骨芽細胞および骨膜細胞と相互作用します。重要なのは、移植細胞と周囲の骨芽細胞8、または移植細胞とその下の硬膜（レビら 、印刷中）の間の相互作用が進行し骨形成を媒介し、通常の幹細胞のために重要である。大腿骨分節性欠損（FSD）の面では、異種移植PSCのは非常に異なる細胞とサイトカイン環境にさらされています。たとえば、FSDサイトは骨髄とそれに付随する間葉系幹細胞と同様に、骨内膜、骨膜および長期の骨芽細胞で構成されています。理論的には、各セルは損傷への独自の反応があり、各セルを持つことができます。PSC異種移植と細胞の相互作用。 他の明確な違いは、頭蓋冠の間に存在すると大腿骨の欠陥。長い骨は軟骨中間体（軟骨内骨化）を介して形成しながら頭蓋冠の骨は最初に、膜内骨化によって形成されます。また、修復過程の損傷後も、これらの発達の起源を模倣しています。ない軟骨中間体が頭頂骨欠損内に形成されていないのに対し、後のFSD、軟骨カルス形成が観察される。最後に、頭蓋骨の胚起源は長骨のそれとは異なる場合があります。頭蓋骨（ -周皮細胞-血管周囲の細胞を含む全体の頭部領域における）の大部分は四肢の骨格が沿軸中胚葉誘導9であるが、神経堤（外中胚葉）から派生しています。すべてのこれらの違いはPSC媒介骨修復の面で有意な差になることがあります。 PSCの使用は、従来の脂肪由来間質細胞（ASCS）に比べていくつかの利点があります。 PSCは文化を必要とし、精製した細胞集団WHIではありません。とにも悪影響を調節することができます- -骨分化、例えば10血管内皮細胞などのchはに参加していない他の間質細胞が含まれていません。対照的に、例えば、ASCのクローン分析は、唯一の集団は 、in vitro 11 の骨分化を受けることができることを示している。最終的に、骨格組織工学への取り組みは、おそらく最高の骨格欠陥を癒すように、外因性増殖因子とosteocompetent幹細胞（例えば、極成層圏雲など）と骨伝導足場（例えば、HA-PLGAとして本発明の方法で使用される）が組み込まれています。

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

人間の血管幹細胞（PSCの）1-3骨格組織工学の目的のために複数の組織から十分な数で分離することができます。 PSCは &#39;周皮細胞 &quot;（CD146 + CD34-CD45-）、我々は以前に間葉系幹細胞の性質を有することが報告されているそれぞれの&quot;外膜の細胞 &quot;（CD146-CD34 + CD45-）のFACSソート集団である。 PSCは、MSCのように、骨分化と同様に、分泌するプロ骨形成サイトカイン1,2を受けることができます。現在のプロトコルでは、SCIDの筋肉ポーチの注入を含むいくつかの動物モデルにおいて、PSCのosteogenicityを実証する（重症複合免疫不全）マウス、SCIDマウス頭蓋冠欠損と胸腺ラットの大腿骨分節性欠損（FSD）を。大腿筋ポーチモデルは、異所性骨形成を評価するために使用されています。頭蓋冠の欠陥は頭頂骨を中心に標準で直径4ミリメートル（非常にサイズ）8であるされています。 FSDにはbicorticalあるとして安定化されているポリエチレンバーとK-ワイヤ4。説明したFSDも大幅に独自の4に治らない臨界サイズの欠陥です。幹細胞や成長因子が欠損サイトに追加されている場合とは対照的に、有意な骨再生が理解することができます。 PSCのxenograftingの全体的な目標は、異所性と同所両方骨再生モデルでは、このセル型の骨形成能力を実証することである。

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。 PSCのは、標準的な脂肪吸引の手順中に調達脂肪組織からFACS（蛍光活性化セルソーティング）で単離することができるし、骨形成を達成するために骨誘導足場と組み合わせて<emin vivoでの&gt;</em&gt;。

骨再生のための人間の血管周囲の幹細胞の使用

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K ビュー.  School of Dentistry, UCLA. 人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。 PSCのは、標準的な脂肪吸引の手順中に調達脂肪組織からFACS（蛍光活性化セルソーティング）で単離することができるし、骨形成を達成するために骨誘導足場と組み合わせて。

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

生物工学

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632を用いた初原ヒト歯肉上皮細胞の単離と培養

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...