この量のフローサイトメトリー法を用いて、研究者は膜相互作用を持ち込まれた動態的および平衡習慣を計算し、PPH膜上の部位によってもたらされたタンパク質の数を推定することができる。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法は、基礎研究専用です。
このプロトコルは、血液計算におけるタンパク質脂質相互作用を研究するために開発され、タンパク質と様々な脂質膜との相互作用を特徴付けるために他の分野で使用することができる。この方法は、様々な細胞およびリガンドタイプ上のリガンド結合ダイナミクスの量評価に使用することができる。タイロード緩衝液中のリン脂質小胞を1マイクロモルの濃度および250マイクロリットルの総量に希釈することによって、動態結合実験を開始する。
次いで、蛍光標識凝固第X因子またはFX FDと500ナノモルの濃度とリン脂質小胞とを1対1の比率で混合し、500マイクロリットルの総体積を得る。直ちに500マイクロリットルの混合懸濁液をフローサイトメーターに注入する。励起波長が488ナノメートル、発光フィルターが585ナノメートルの流量で、チャネルFL2の幅は42です。
次に、チャネルFL4の平均蛍光を633ナノメートルの励起で測定し、発光フィルターを660ナノメートルで幅20で測定する。結合の飽和が達成されたら、試料をタイロード緩衝液で20倍に急速に希釈し、ベースライン蛍光またはプラトーに達するまで解離をモニターする。平衡結合実験のために、0から1000ナノモルまでのFX FDの様々な濃度を有する5マイクロモルの人工リン脂質小胞を、タイロードの緩衝液中で20分間インキュベートする。
インキュベーション後、各サンプルをタイロード緩衝液で最終容量200マイクロリットルまで20倍希釈し、希釈サンプルを30秒以内にフローサイトメトリーで分析します。データを分析するには、実験をFSC形式でサイトメトリーデータ収集ソフトウェアからサイトメーターソフトウェアにエクスポートしてデータ分析します。ファイルを選択し、[エクスポート]タブと[FSCファイル]タブをクリックします。
完了したら、コンピュータ上のファイルを選択し、ファイルをプログラムのワークスペースにドラッグして、FCSファイルをサイトメーターソフトウェアに開きます。マイクロベシクルをゲーティングするため、親油性色素、DIC163の蛍光によりマイクロベシクルの領域を特定する。次に、ワークシートのプロットボタンを使用して、対数座標でFL 2つのD I C 16からドットプロットSSCを作成します。
次に、長方形のゲートボタンを選択してゲート領域を描画します。運動学的実験を分析するために、小胞の領域についての経時的な蛍光の座標を使用してドットプロットを作成する。次に、時間の経過に伴う蛍光の変化に関するデータをCSV形式でエクスポートします;サンプルを選択してエクスポートタブを右クリックし、次にパラメータでFL 4時間を選択し、CSV形式を選択してエクスポートタブを押す前に保存するディレクトリを選択します。
転送後、統計ソフトでCSVファイルを開き、単純移動平均蛍光を算出し、指数依存性の仮定下での時間に対する単一移動平均蛍光の依存性のグラフを近似する1000イベント毎に時間、その値を用いて、式を用いて動態会合定数を算出する。次に、前述の式を使用して動力解離定数を計算します。平衡結合アッセイの日付を分析するには、FX FDの各選択された濃度について小胞の領域におけるFX FDの平均蛍光を決定し、次いで、単一部位結合の仮定において添加された因子の濃度から結合因子蛍光の依存性を近似する。
平均結合パラメータは、少なくとも3つの独立した繰り返しからの式を使用して計算します。ゲル濾過血小板をカルシウムIANA 4A 23、187と共に2.5ミリモル塩化カルシウムの存在下で室温で10分間インキュベートすることによって較正ビーズの調製を進める。活性化血小板に様々な濃度のFX FDを加え、血小板を2容量パーセントのホルムアルデヒドでインキュベートします。
1時間後、血小板を3モルのグリシンおよび5%BSAと共に室温で30分間インキュベートすることによって反応を停止させる。次いで、未反応染料から混合物を400倍Gで5分間遠心分離して精製する。0.5%BSAを含むTyrodeの緩衝液にペレットを再懸濁する前に、上着液を除去してください。
次に、分光蛍光計を用いて各試料中の較正ビーズの蛍光レベルを測定し、次いでフローサイトメーターを用いて測定する。セルカウンターの助けを借りて、各サンプル中のビーズの数を決定します。分光蛍光光度計を用いて各ビーズ試料の蛍光強度を可溶性蛍光色素の濃度に変換し、分光蛍光光度計分子数に対する蛍光色素濃度を再計算する。
各サンプルのフルロフォア分子の数に対するフローサイトメーター内のビーズの平均蛍光の依存性グラフを作成します。次に、解析フィッティングを使用して線比例によって依存関係を近似し、線形タブを順番に適合します。式中の近似から、結合部位に対する平均蛍光の変換係数を計算する。
後で目的の小胞あたりの結合部位の見かけ数を計算する。代表的な分析は、組み込まれた親油性蛍光色素、色素IC16を有する1マイクロメートルのサイズである人工蛍光体脂質小胞のゲーティングを示し、ゲート蛍光色素を含まない同じサイズの人工脂質小胞を含む試料に基づいて設定した。小胞に結合するタンパク質の動態を、試料を連続的に採取することによって第1段階で分析した。
得られたデータをフローサイトメトリーを用いて分析した。フローサイトメトリー測定は、溶液を混合し、タイロードの緩衝液で希釈した後、できるだけ早く開始する必要があります。提案された方法は、良好な一時的な分解能で高感度であり、送達をもたらす必要がない膜相互作用をもたらした研究のための表面血漿共鳴で補完することができるこの方法の主な利点は、そのアクセシビリティおよび単純さである。
