著者は、彼らの実験室で細胞周期の研究に資金を提供するための健康研究（CIHR）とカナダの癌協会のカナダの研究所に感謝したい。 MJCは、CIHRからMD /博士号フェローシップの受賞者です。 MJCとMAはCaRTTのトレーニングプログラムのメンバーです。

1。細胞の標識と固定<ol><li>細胞増殖の標識試薬（BrdU）の1mLあたりの細胞培養培地（1〜1000希釈）収穫前に1時間の1μLを加える。標識期間が遅く増殖する細胞のために長くする必要があります。 </li><li>収穫の細胞に、吸引培養液とリン酸塩で十分に洗浄は生理食塩水（PBS）を。徹底的に培地のトレースを削除する繰り返します。 </li><li>すぐにPBSが3mmのEDTAを含むと三度目の文化を洗い、よく吸引除去する。 </li><li>各ディッシュに3mmのEDTAを含むPBSの小さなボリュームを追加、6 cmディッシュ用0.5 mLのが理想的です。 ° C、細胞を分離するために約5分間、22でインキュベートする。 15 mLコニカルチューブに移す。 </li><li>ペレットに5分間500 × gで細胞を遠心、上清を除去し、PBS 100μLで徹底的に再懸濁します。 </li><li>ボルテックスしながら、95％エタノール、滴下5 mLを加えることによって細胞を固定する。このステップでは、細胞は少なくとも4℃で保存することができます月。 </li></ol> 2。 BrdUとDNAの変性と染色<ol><li>細胞をペレット化まで5分間500 × gで細胞を遠心分離し、95％EtOHを削除します。ボルテックスしながら滴下方式で追加することで、2NのHClを1 mLおよび0.5％TX - 100で再懸濁します。 30分間室温でインキュベートする。 </li><li>セクション2.1で以前と同様に遠心し、細胞がこの段階では非常に緩いペレットを形成するので、慎重に上清を吸引除去する。優しく0.1M NAB 4 O 7液（pH8.5）1mlに再懸濁し、室温で少なくとも30分間インキュベート。 </li><li>上記のセクション2.1およびマウス抗BrdU抗体を用いた抗体の溶液0.5mL（PBS、1％BSAおよび0.2％Tween - 20を含む）に再懸濁させるなど、細胞をペレット化は、1から50件を希釈。 30分間室温でインキュベートする。 </li><li>細胞をペレット化は、再びとFITCに結合したウサギ抗マウス二次抗体を含む抗体溶液50mLに再懸濁し25対1に希釈。上で30分間インキュベートベンチトップと光から保護する。 </li><li>遠心細胞ヨウ化プロピジウムおよびRNase溶液0.5mL（1％BSA、10 mg / mLのヨウ化プロピジウム、0.25 mg / mLのRNase Aを持つPI - RNase A液、PBS）で最終的な時間と再懸をし、37℃暗所でインキュベートします30分間。またRNAは、4℃で一晩消化することができます℃の暗所で。 </li><li>凝集物を除去して、フローサイトメーターでサンプルの取り込みのための適切なチューブに単一細胞を収集するために、セルストレーナーを通してソリューションを渡します。再び、サンプルは光を直接浴びることから保護する必要があります。 </li></ol> 3。フローサイトメトリーによる解析<ol><li>細胞はヨウ化プロピジウムおよびFITCのための適切な検出機能を備えた二重線（一つとしてフローセルを通過する2セル）を差別することができる標準的なフローサイトメーターで分析する必要があります。単一の細胞は前方散乱と側方散乱のポップに基づいてイベントのゲーティングすることで、このフローサイトメトリーのアプリケーションで検出することができますulations、およびヨウ化プロピジウムによってDNA染色のプロパティを使用します。二重特異なドットプロットの外観は、フローサイトメーターの間で変化すると、ヨウ化プロピジウム染色の特性に依存している、あなたの分析でダブレット識別器のセットアップのアドバイスについては、地域のフローサイトメトリー機能を参照してください。一般的に、細胞の非同期的に増殖人口で、単一の細胞は通常、二重特異なプロットの中で、最も豊富なピーク（2Nと4N DNA）であり、ゲートは、その周りに描画する必要があります。これは、以下のすべてのその後の分析に使用される単一のセルのイベントを選択します。 </li><li>分析する最初のサンプルは、染色とフローサイトメーターのセットアップのためのポジティブコントロールとして機能する非同期で増殖して文化にする必要があります。一細胞から2Nと4NのピークがX軸上に200〜400（任意単位）を中心としているように、ヨウ化プロピジウム染色に光電子増倍管の感度を調整します。私たちはしばしば豊富なのを染色フローサイトメーターのすべてのパラメータが、このサンプルを使用することなく適切に調整されていることを保証するためにこれらの細胞のupply。新しいユーザーはフローサイトメーターの操作に慣れるためには、このポジティブコントロールにも便利です。 </li><li> G1とG2 / M集団がバックグラウンドより上になるようにFITC検出用光電子増倍管の感度を調整します。のBrdU陽性細胞は約10倍明るくし、Y軸を対数目盛として表示する必要があるはずです。それは明らかに陽性染色細胞を区別するために、BrdU染色用のネガティブコントロールを（上記の手順2.3で非特異的IgGと抗BrdU抗体を置き換えることによって）インクルードすると便利な場合があります。 </li><li>単一のイベントがG2 / Mの右下にS相とダウンするまでの左下にあるフローサイトメーターの形でG1から馬蹄形の弧をキャプチャするような、ヨウ化プロピジウムとFITCとの間の補償を調整する深さDISの詳細については、次のリファレンスを参照してください。特定のアプリケーション2の中のあるフローサイトメトリーおよび参照の原理と使用のcussion。 </li></ol> 4。データ分析<ol><li> DNA含有量の所望の範囲で5 000〜10 000単セルのイベントは、培養中の細胞の集団が徹底的にサンプリングされているという自信を持たせるために、各サンプルのために収集する必要があります。 </li><li>一度細胞が彼らはG1、S、またはG2 / M期に割り当てる必要がヨウ化プロピジウムとBrdUのコンテンツのために測定されている。 200および400（それぞれG1及びG2 / M）を中心とtwoのBrdU陰性の集団の周囲にゲートを描画することによってこれを行います。これらのボックスの上のすべては、S相（図1A）を測定する単一のゲートに含まれるべきです。各ゲートの細胞の割合は、G1、S、およびG2 / M（図1B）における細胞の相対数を表します。 </li></ol> 5。細胞の混合集団における細胞周期の分析のための代替プロトコル<ol><li>この代替プロトコルは、最も有用な時に細胞の純粋な集団を選択するために薬物治療が不可能な発現ベクターのトランスフェクションは、日常的に関心の遺伝子産物を発現する細胞の割合が低いの結果、または。 untransduced細胞の大集団で汚染されている目的の細胞の比較的小さな割合でこの結果。そのようなGFP 3をアンカー膜、またはそのようなCD19 4などの外国の細胞表面マーカーとして、フローサイトメトリーでトランスフェクトした細胞を検出するためのマーカーを発現するプラスミドと共にあなたの遺伝子や関心のshRNAを発現するこの場合は、同時トランスフェクションプラスミド、またはCD20 5。 </li><li>このプロトコルの目的のために我々は例として、CD20染色を使用する、しかし、CD19についての染色は基本的に同じです。 CD20とトランスフェクションの場合、i上のセルに20μLFITC結合抗CD20抗体を加えることによって1.2から1.5まで上記の手順で説明したように、単に収穫の細胞、のBrdUラベルする必要があると汚れはありません暗所で20分間CE。として、ステップ1.6で説明されているセルを修正。細胞を再び4℃で1か月間保存することができます。·ダークのC。 GFPの検出のために、このステップと修正から抗体染色を省略して説明したように細胞を保存する。 </li><li> 5分間500 × gで遠心分離でペレット化し、PBS、1％BSAを含む5mLに懸濁することにより再水和物細胞。 </li><li>セクション2.5で説明したように、ヨウ化プロピジウムおよびRNase溶液0.5 mLを5分間再懸濁します細胞500 × gで再ペレット細胞。 </li><li> 3.1と3.2で2.6のセルの準備手順と解析の指示に従って続行。 </li><li>未染色細胞が背景より上になるようにFITC検出用光電子増倍管の感度を調整します。理想的には、CD20 - FITC陽性細胞は100倍より強く染色されたバックグラウンドよりも最大10倍となり、このプロットのY軸は対数目盛（図2A）として表示されます。 backgより10倍明るいCD20陽性細胞図に示すように円形に（と200と400の間にヨウ化プロピジウム染色による）ヒストグラム、ヨウ化プロピジウムとセル数で表示するために選択する必要があります。 2C。容易に（100倍背景上記のすなわち10倍）明るく染色されているマーカーを発現する細胞株の場合はCD20陽性カットオフは、10Xの背景に設定する必要があります。目的の遺伝子をも弱く、これらの細胞で発現されているため、弱い染色細胞の包含は、おそらく、これらの実験でばらつきが増大します。だけ弱く染色されたCD20陽性を（10X背景未満すなわち）を得た細胞株の場合は、カットオフの決定は、CD20染色した、トランスフェクトされていない細胞から成るネガティブコントロールを使用して行う必要があります。 </li><li>少なくとも1000 CD20陽性のイベントは、各サンプルのために収集する必要があります。 1000イベントは、高い変動性を生み出すことが少ないとの実験。このようなModFit LT（Verityのソフトウェア）、マルチサイクルのAV（フェニックスフローシステム）、およびフロージョー（木スター）などのソフトウェアパッケージは、数学的な推定値を使用このような図に示すようなヒストグラムのカーブの形状に寄与G1、S、およびG2 / M集団。 2BとC. </li></ol> 6。代表的な結果： 私達は私達のアプローチを使用して実験的な細胞周期の分析の3つの例を提供します。最初は、マウス胚性線維芽細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のp27KIP1のレトロウイルス発現を使用しています。ウイルス感染のための薬剤の選択が完了した二十四時間後、細胞は、パルスが1時間のBrdUで標識した。この実験では阻害剤の異所性発現は、細胞（図3AとB）の増殖を阻止するために使用されます。図に示す。 3B少しBrdUのポジティブイベントはP27に対応してS期のゲートで顕著となっている。図diagramedとして同様に、p27の発現細胞のS相の細胞の割合はかなり低いです。 3C。このタイプの分析では、gの様々な系統由来の細胞における細胞周期制御の欠陥を特徴付けるに非常に効果的であったマウス6、7、8 -エンを対象。 第二の実験では、非形質転換乳腺上皮細胞（MCF10A）は24時間成長因子ベータつ（TGF -β1）を変換する、増殖抑制サイトカインで処理した。細胞は、収穫の直前に四時間のBrdUで標識した。図に示す。 S期細胞の4 BrdUラベリングが大幅にTGF -β1シグナリングによって減少され、私たちの染色の特異性は、IgG抗体陰性対照（図4C）で検証されます。細胞周期の異なる相の定量化は、TGF -β1は、主にこの段階での蓄積につながる、細胞周期のG1期で増殖を阻害する確認する。 私たちの最後の例では、pRBの欠損SaOS - 2細胞は、CMV - CD20発現ベクター及びCMV - RBまたは対照としてCMV -β- Galのいずれかでトランスフェクトされる。三日後、次のトランスフェクション細胞を染色し、収穫、そして修正されました。これらの細胞のフローサイトメトリー分析のを図に示します。 5。これはpRBの発現（図5B）の72時間以下のディストリビューションと比較して、ネガティブコントロール、トランスフェクト細胞（図5A）の細胞周期の分布を示しています。マルチサイクルソフトウェアによるカーブフィッティングに続いて、細胞周期の比率の直接比較をFig。 5C。これはG1以下pRBの発現における細胞の蓄積とS及びG2 / M期からの細胞の相対的な枯渇を明らかにする。我々は、G1期停止機構広範囲に9、10、11、12、13をプローブするために、このアッセイのバリエーションを使用している。 これらの例は、細胞周期の制御が刺激や細胞の操作、様々に対応して測定できる方法を示しています。このアプローチは、したがって、文化の型の実験における細胞周期の位置の測定を必要とする多くのアプリケーションに適合させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> 図1。Quantit複合ヨウ化プロピジウムおよびBrdU染色（PI - BrdU）のによる細胞周期のフェーズについて注意深く検討する必要があります。 （A）このパネルには、ヨウ化プロピジウムおよびBrdU染色された細胞の三次元フローサイトメトリーを表示します。 2Nと4N DNA含量を持つ細胞はヨウ化プロピジウム染色強度のX軸のスケール上で200と400マークの中心にされることに注意してください。 BrdUの染色強度をY軸に対数目盛で測定されます。細胞周期のG1、S、およびG2 / M期で細胞を定量するために使用するゲートの位置に注意してください。 （B）からG1、S、およびG2 / Mゲートのそれぞれの細胞の相対的な割合は、このグラフに示されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> 図2。ヨウ化プロピジウムと細胞表面マーカーCD20を使用して、選択した細胞における細胞周期相の定量。 （A）このパネルには、ヨウ化プロピジウムおよび異所性にCD20とpRBのを表現するそのうちのいくつかの細胞、の混合物のためのCD20染色を示す。なお、ある細胞2Nと4NのDNA（最も豊富な集団）がX軸上に200と400符以上集中している。 CD20 +ゲートの位置は、バックグラウンドより少なくとも10倍以上の明るく染色されているセルを選択します。 （B）ヨウ化プロピジウム染色対細胞数のグラフは、非同期的に増殖しているパネルのCD20陰性細胞のために示されています。 （C）のようなグラフは、pRBの発現を阻止し、主に2NのDNA含量と細胞を含むように誘導されているパネルからのCD20陽性細胞のために示されています。これは、この染色の技法を使用してこの文化の中で他の細胞と区別することができます逮捕されたサブ母集団ことを示している。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> p27KIP1による細胞増殖の図3。抑制。 （A）PI - BrdUの分析は、空のpBABEレトロウイルスvectoで形質導入した細胞の非同期的に増殖集団における細胞周期の段階を測定するために使用されるR. （B）細胞の同様の分析は、pBABE - P27で形質導入。 S期とG1とG2 / Mゲートでのイベントの大きい強度で細胞の有無に注意してください。非同期的に増殖制御とp27の発現細胞における細胞周期の各相における細胞の（C）定量。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> 図4。TGF -β1による細胞増殖の阻害非同期MCF10A細胞を増殖さの（）PI - BrdUの分析。 24時間TGF -β1の100 pMので処理した細胞の（B）の分析。主に細胞周期のG1期の細胞の蓄積に注意してください。非同期的に増殖する細胞の非特異的IgGコントロールと抗BrdU一次抗体を置き換えることにより、BrdU染色の（C）検証。 AとBからそれぞれの細胞周期の（D）グラフィカル定量<img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; 図5。pRBのによる細胞増殖の阻害。 （）CD20のヨウ化プロピジウム染色とβ- galをトランスフェクトされた細胞対細胞数が表示されます。亜集団トランスフェクトするための不適切なコントロールとして - トランスフェクションは、部分的にトランスフェクトされていない人口（細胞CD20）をレンダリング、セルを同期できるので、これは重要なコントロールです。トランスフェクションされた細胞は、他の同様にトランスフェクトされた細胞と比較する必要があります。 （B）細胞数に対するCD20とpRBのトランスフェクション細胞のヨウ化プロピジウムのグラフ。 2Nピークのほぼ排他的な存在に注意してください。 （C）細胞周期の位相の割合のグラフィカル表示は、マルチサイクルのソフトウェアでカーブフィッティング方法を使用してAとBから決定。

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著者らは、開示することは何もない。

我々の経験では、これらの技術の成功は、いくつかの重要なコントロールや実験条件に依存しています。一つは、これらの実験で使用するために非同期的に増殖制御を確立しています。このコントロールは、次の3つの重要な役割を果たします。最初、それはすべての実験サンプルに使用される培養条件は、治療の不在で継続的な増殖をサポートするために適切であることを保証します。また、このサンプルでは、​​彼らが存在しているときのBrdUまたはCD20陽性細胞を検出することができることを保証するために染色の方法論のためのポジティブコントロールの目的を果たします。最後に、このサンプルは、フローサイトメーターを校正するために使用されます。このコントロールのサンプルは、それぞれ200および400℃で2Nと4Nの細胞を検出するために、ヨウ化プロピジウム染色強度を調整するために使用することができます。また、BrdUをまたはCD20の検出感度は、負と正の信号がとして、図1Aおよび2Aに示すように中央に配置されるように調整することができます。すべてのサンプルでは、​​PI - Rの細胞の同じような濃度を持っているときに次のサンプルが実行されるようにNaseのソリューションは、その後サイトメーターにいくつかの調整が必要とされています。これは図に示す理由から重要である。強力なG1の蓄積は、本質的にG2 / Mと間違って解釈される可能性単G1ピークを作成4Bおよび5B 代表的な実験はまた、他の重要なポイントを作る。まず第一に、彼らはBrdUの取り込みとラベリングが細胞型間で異なることを示しています。このため、経験的に十分にS期に細胞を検出するために必要なパルスや染色条件の長さを決定することが重要です。一般的には、細胞型未満24時間以上の培養でその二重は、時間でのBrdUで標識することができます。遅い成長している細胞の種類は、抗体染色の条件と期間に長いパルスと変化が必要な場合があります。彼らは4回限りのための抗体の倍標準濃度で4時間で染色するためのBrdUで標識されたとしてMCF10A細胞は、この点で素晴​​らしい例です。調べではこれは、誤ってS期の人口のG2 / M細胞を含むことにつながることができるようにも非常にゆっくり増殖する細胞を用いて標識BrdUの6時間を超えないように注意する必要があります。第二に、TGF -β1のものとp27KIP1発現の効果を比較することで、それはTGF -β1シグナル伝達がG1停止を誘導しながらP27はG1またはG2 / M期のいずれかで蓄積を誘導できることは明らかである。例えば、3 H -チミジン取り込みとシンチレーション計数として増殖を検出する従来の手段は、これらの可能性を区別することはできません。 私たちの別のプロトコルでは、大規模なトランスフェクトされていない集団における細胞の亜集団の検出を示しています。経験的にトランスフェクトした細胞を検出するための最も適切なレポーターを決定することが重要です。我々の経験ではいくつかの細胞型のいずれかの明示細胞表面マーカーが不十分、または形質膜へのトラフィック、それらを、トランスフェクションされた細胞を検出不能になり正しくできません。 Likewise、すべての細胞がGFPの膜結合形態を容認しない。最も適切なレポーターの選択は、トランスフェクションレポーターの効率だけでなく、トランスフェクトされていないコントロールと比較して発現の相対強度を評価することによってなされるべきである。理想的には、これらの分子の異種発現の忍容性は良好とこれは、マーカーが細胞周期の分布に影響を与えずに少しを持っていることを示唆するものであることになります。 フローサイトメトリーのアプローチこ​​れらの種類の制限の一つとして、彼らは1つだけ別のに比べて細胞周期相の相対的存在量を確立することができることです。図3のp27の発現は、真のG1およびG2 / Mで停止を誘導する場合、またはそれだけでS期への相対これらの段階を経て進行を遅くする場合は、このような理由からそれがあいまいです。これらの可能性は、有糸分裂などノコダゾールなどの阻害剤、またはアフィジコリンのようなG1 / S阻害剤と細胞のパラレルサンプルを処理することにより、さらに検討することができる。これらの薬剤は、ドミナを作成するのでNTのM期で停止またはそれぞれS期初期では、徐々に増殖する細胞は、薬物誘導逮捕の時点で蓄積される。コントロール細胞は、M -相13に蓄積される一方例えばので、pRBの発現のG1で停止した細胞は、ノコダゾールの治療にもかかわらずG1のままになります。 一緒に、これらの実験的アプローチは、哺乳類細胞周期の研究の問題の広い範囲に適用できる柔軟な方法論を提供します。彼らは容易に細胞周期の進行に変化を検出し、コントロールと比較して相違点を定量することができる。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>細胞増殖の標識試薬</td><td> GEアマシャム</td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td>抗BrdU抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスFITC標識抗体</td><td>ベクトル研究所</td><td> FI - 2000 </td><td></td></tr><tr><td>細胞株のフィルタ</td><td> BDファルコン</td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td>抗CD20抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td>マルチサイクルソフトウェア</td><td>フェニックスフローシステム</td><td> N / </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

細胞増殖の調節には、多細胞生物の開発中に組織の形態形成の中心です。さらに、細胞増殖の制御の喪失は、癌のような疾患の病態の根底にある。このように細胞増殖を調査し、細胞周期の各期の細胞の割合を定量することができるように偉大な必要性がある。それは何時の間にか大きな集団の中で自分のDNAを複製している細胞を同定するために極めて重要なもです。増殖する細胞の決定はDNA合成を開始し、細胞周期の残りの部分を進行する前にすぐにG1期に作られているので、この段階でDNA合成の検出は、細胞培養における増殖制御の状態をはっきりと判定することができます実験。 細胞内のDNA含量は、容易にヨウ化プロピジウムで染色した細胞のフローサイトメトリー、蛍光DNAインターカレート色素によって定量することができる。同様に、アクティブなDNA合成は、細胞を採取し、酸不溶画分に放射能の取り込みを測定、放射性チミジンの存在下で細胞を培養することによって定量することができる。我々は、細胞周期の解析でかなりの専門知識を持ち、異なるアプローチをお勧めします。我々は最近合成されたDNAの中にこれらのチミン類似体の取り込みを検出するブロモデオキシウリジン/ fluorodeoxyuridine（BrdUのように単に略す）染色を用いて細胞増殖を調査。ラベル付けと染色細胞をBrdUで、フローサイトメトリー1で、ヨウ化プロピジウムおよび分析によって全DNAの染色と組み合わせると、細胞周期の様々な段階での細胞の最も正確な尺度を提供しています。それはアクティブなDNA合成の検出を組み合わせたので、ヨウ化プロピジウムから総DNA含量と、BrdUの抗体ベースの染色を通して、私たちの推奨される方法です。これは初期のS期からG1の細胞の明確な分離、またはG2 / Mから後期S相を可能にさらに、このアプローチは、これらの異なる細胞周期の段階を経て進行の調節に多くの異なる細胞の刺激と薬理学的薬剤の効果を調べるために利用することができます。 本報告書では、フローサイトメトリーによって培養細胞、並びにそれらの分析をラベリングし、染色するための方法を説明します。我々はまた、このメソッドはそのようなそのようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのTGF -β1、および増殖阻害剤などのサイトカイン、p27KIP1からの成長を阻害する信号の影響を測定するためにどのように使用できるかの実験例が含まれています。我々はまた、より大きな文化5内の細胞の亜集団の細胞周期の位置の分析ができるように代替プロトコルが含まれています。このケースでは、我々は非常に同じ文化の中でトランスフェクトされていない細胞で劣勢であっても網膜芽腫遺伝子をトランスフェクションした細胞で細胞周期の停止を検出する方法を示します。これらの例は、そのDNAの染色多くの方法を説明し、フローサイトメトリーを利用し、哺乳類の細胞周期制御の基本的な問題を調査するために適応させることができます。

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

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59.8K ビュー.  University of Western Ontario. 細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。

ビデオ: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生物学

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...