ブルース·バグウェル（Verityのソフトウェアハウス）、NadègeBercovici（IDM）、Lizanneブレスリン（ZynaxisセルサイエンスおよびPTI研究）：著者は、特に年間を通じてこれらの方法の開発への技術的·知的貢献のために以下の個人に感謝したいと思います、ブライアン·グレイ（PTIリサーチ）、ヤン·フィッシャー（ダートマス医科大学）、アリスGivan（ダートマス医科大学）、ベッツィオールソン·ヴィルヘルム（SciGro、Inc。）、およびメアリー·ウォー（ダートマス医科大学）。彼らはまた、 図2に示すようにデータを生成した年次調査方法のコースおよびフローサイトメトリーの応用、2006年からのボードンクラスに感謝したいと思います。 フローサイトメトリーは、NIHの共有インストゥルメント·プログラムから機器の助成金によって部分的に設立されたロズウェルパークがん研究所のフローサイトメトリー研究室で行われ、全国からコアグラント（5 P30-CA016056-29）からの支援を受けたがんロズウェルパークがん研究所へ、そしてアブラムソンがんセンターのフローサイトメトリーおよびNIH共有音源プログラムから機器の助成金によって部分的に設立されたペンシルベニア大学の細胞選別資源研究所の研究所、およびNIH＃2P30から支援を受けて米国国立がん研究所からCA016520。 図3及び図5に示す作業もPTIリサーチ社に授与生体イメージングとバイオの国立研究所（NIBIB）からSBIRの助成EB00228によって部分的にサポートされていました

1。 PKH26細胞トラッキング色素で、一般的なメンブレンラベリング（ 文献25;図1） <ol><li> 1.9 - 手順1.1の滅菌技術を使用してください。血小板汚染を最小限に抑えるための最終的な300×gでスピンを加えた実験室の標準法を用いて〜10 7ヒト末梢血単核細胞またはリンパ球（hPBMC、hPBL）を準備します。ステップ2で使用するための500μlのアリコートを（5×10 6細胞）を確保し、10氷上のHBSS +1％BSAおよび場所で7 / mlになるように細胞を再懸濁する。 </li><li> 12 x 75 mmの円錐形のポリプロピレン製チューブに入れ、5×10 6個の細胞（500μL）。 3.5mlのHBSSで1回洗浄します。慎重に残留流体のこれ以上より15から25μlを残しているが、細胞を除去しないように注意しながら、上清を吸引除去する。ステップ1.4で2倍の細胞懸濁液を調製するために、このチューブをご使用ください。 </li><li>ステップ1.2における細胞洗浄の間に、12 x 75 mmの円錐ポリプロピレンチューブに希釈Cラベリング車両0.5mlを（PKH26GLキットから）を追加します。予備校にこのチューブを使用ステップ1.5倍PKH26ソリューションです。 </li><li>ステップ1.2から洗浄細胞ペレットに希釈Cラベリング車両の0.5 mlを加え、単一の細胞懸濁液（2倍の細胞）を得るために3〜4回の吸引と分注する。細胞の生存と回復を減らすかもしれない、バブルの形成と過度の混合は避けてください。 </li><li>直ちにステップ1.4で2倍の細胞懸濁液を調製した後、ステップ1.3で調製した希釈液、C管にエタノール中1.0mMのPKH26色素株式（PKH26GLキットから）2.0μlを添加して2倍（4μM）色素溶液を調製し、ボルテックスへ均一に分散させる。 </li><li>直ちにステップ1.5で2倍の色素溶液を調製した後、急速に2倍の染料溶液にステップ1.4から2倍の細胞懸濁液をピペットと同時に完全に色素で細胞を分散させるために3-4回を吸引および分注しないでください 。に直接1.0mMの染料を追加細胞;倍色素に2倍の細胞を注ぐ、あるいはボルテックスしながら染料を2倍に2倍のセルを追加します。染色はほぼ瞬時に行われますので、そのような方法はあまり得推奨される方法より均一な強度（ 図2）。 </li><li> 1分後、熱不活性化血清または細胞膜に色素の取り込みを停止するHBSS +5％BSAを1.0ミリリットルを追加します。十分なタンパク質を使用しなかった場合は、洗浄工程の中の細胞を持つことができペレット色素凝集体の形成をリスクと実験中に存在する他の細胞の意図しないラベリングを引き起こす。 10％熱不活化血清（CM）またはHBSSで培地+1％BSAが停止試薬として使用する場合は、すべての吸着を確実にするために15 mlコニカルポリプロピレンチューブに染色行うと停止試薬の少なくとも5.0ミリリットルを追加非法人の染料。 </li><li> 5分間標識した細胞を遠心@〜400 x gで。注意深く細胞を除去することなく、上清を吸引除去する。よく再遠心分離前にペレットを分散させると、CMまたはHBSS +1％BSAの4ミリリットルでペレットを2回洗浄。チューブ壁に吸着した色素のキャリーオーバーを最小限に抑え、洗浄効率を最大限に高めるためには、fiの後に新鮮なポリプロピレンチューブに細胞を移すRST再懸濁。注：十分に染色された細胞は、ペレット内の異なるピンクの色合いを示すであろう。 </li><li> 1.0ミリリットルHBSS +1％BSAで洗浄した細胞ペレットを再懸濁します。 、細胞をカウントする細胞の回復を決定し、10 7 / mlの最終濃度になるようにボリュームを調整します。慎重に吸引すると、細胞の回復が≥85％であるべきである。細胞の回復は&lt;70％であれば、先へ進む前に、原因を特定します。ステップ2で使用するために氷の上で150μlのアリコート（1.5×10 6個の細胞）と場所を撤回します。 </li></ol> 2。インストゥルメントおよびアッセイセットアップコントロールの調製（ 表1） <ol><li> 5 1.8ミリリットルエッペンドルフチューブの各々にステップ1.1で保存した細胞懸濁液からの未染色細胞のアリコートを50μl（5×5）：1、3、4、5、7。 3各チューブへのステップ1.9からPKH26 posの細胞のアリコートを50μl（5×5）：2、6および8。 </li><li>チューブ1月8日に、10μlのIgGのブロック（試薬の表を参照のIgGの100μg/チューブ）を追加と周囲温度（20-25℃）で10分間インキュベートする。 </li><li>チューブ4、5、7、および8に、表1に示されており、周囲温度で30分間のすべてのサンプルを（チューブ1-8）インキュベートし、光から保護する抗体の飽和量（IES）を追加します。 </li><li>すべてのサンプルにHBSS +1％BSAを1.5ミリリットル、ペレットを遠心分離により細胞を（5分@ 400×g）で追加し、セル損失を避けるために慎重に吸引して、HBSS +1％BSAを1.5 mlで1回洗浄します。 </li><li> HBSS +1％BSAを500μlの各サンプルを再懸濁します。あなたのメーター上で分析されるサンプルで必要な場合は、12 x 75 mmの丸底チューブに移す。 表1に示すように管3、6、7、8から100μg/ mlの7-AADの日常作業用ストックを10μl（試薬の表を参照）を追加します。フローサイトメーターのセットアップおよび染色検証（ステップ3）での使用に先立って、氷上で30分間インキュベートします。 </li></ol> 3。フローサイトメーターの設定および染色検証<ol><li>ていることを確認し、フローcytomeTERは毎日の品質管理のための研究室の確立された手順を使用して、正常に動作しています。容易に使用するために、各スペクトルウィンドウに検出され、検出器の応答は、増殖のモニタリング14に使用されるウィンドウで強度を通知するために直線的に比例することができるように信号を検証する。 </li><li>線形表示スケールを使用してチューブ1にFSC対SSCデータを取得します。リンパ球集団がドットプロットの左下の象限内に収まるように各検出器の増幅はそのような調整、どちらのパラメータでオフスケールのものではなく、しきい値が原因で中断されません。 3.7 - 3.3ステップですべてのサンプルに対してゲートなしFSC対SSCデータを収集します。 </li><li>全4蛍光検出器のための色補正と対数表示のスケールを使用していない、チューブ1のデータを取得する。最初のチャンネルに蓄積少数/無細胞と規模で染色されていないリンパ球の自家蛍光を配置するために、各検出器の高電圧（HV）を調整します。各ヒストグラムの解析境界を設定する非染色細胞の明るい2パーセントに相当する。 </li><li>ステップ3.2と3.3年に設立されない色の補償とHV設定を使用していない、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器の信号を収集し、チューブ2のデータを取得する。 PKH26蛍光をモニターするために使用される検出器の場合は、すべてのPKH26 posの細胞は最後のチャンネルに/少数の細胞で、第3回-4 回目の十年のシングル対称ピークとしてスケールで表示されていることを確認します。複数のピークまたはピーク形状があるが偏っている場合には、最小化と混合技法（ 図2）塩には細心の注意でステップ1を繰り返します。必要に応じて、色素濃度を調整します。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器で信号を収集、チューブ3のデータを取得する。 7-AAD蛍光をモニターするために使用される検出器については、7-AADのposの細胞（非生存細胞が十分に解決され、 すなわち 、ステップ3.3に設立され、2％の境界線上に入ることを確認してください実行可能な7-AAD neg細胞から）。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器で信号を収集、チューブ4のデータを取得する。 CD8 posの細胞が十分に染色されていない細胞（ すなわち 、FITC標識検出器のためのステップ3.3に設立され、2％の境界上秋）から解決されていることを確認します。チューブ5を繰り返して、POSおよびCD8細胞はよく染色されていない細胞（ すなわち 、APCの検出器のためのステップ3.3に設立され、2％の境界上秋）から解決されていることを確認します。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、すべての4蛍光検出器にFSC、SSC、および信号を収集、管6、7、8のデータを取得する。 </li><li>チューブ1-5と他の3つの蛍光色素を監視するために使用されている検出器の各蛍光色素のために行列を重複色を確立するためにあなたの色補正ソフトのために収集リストモードファイルを使用します。サンプル6用のリストモードファイルにこの行列を適用していることを確認しPKH26ラボの存在elingは7-AAD posの細胞を検出する能力を変更するものではありません。 </li><li> 3）うまく解決亜集団（CD3 NEG CD4 NEG、CD3 POS CD4 NEGおよびCD3 posの CD4 posが ）、FITC対に識別することができます：ステップ3.8からサ ​​ンプル7のためのリストモードファイルに行列をオーバーラップしていることを確認して色を適用APCのドットプロットと、b）抗CD3-FITCおよび抗CD4-APCの存在は7-AADのposの細胞を検出する能力を変更するものではありません。抗CD3-FITCの存在がPKH26検出器で収集されたデータの上位2％の境界を変更した場合、必要​​に応じて境界を再調整します。 </li><li>ステップ3.8からサンプル8のリストモードファイルに行列を重複色を適用します。 PKH26標識の存在は、ステップ3.3における自家蛍光コントロールを使用して、それらの集合から、FITC、7-AADまたはAPC検出器のための2％の境界を変更した場合、 表1のチューブ7を使用して、必要に応じて境界（IE）を再調整していることを確認し、それまだdistingすることが可能ですuish、CD3、CD4、POS posには、CD3、CD4 POS NEG、およびCD3 NEGの CD4 neg細胞は、調整された境界（IE）を使用します。 </li></ol> 4。色素希釈により細胞分裂監視のための増殖モデルの選択<ol><li>あなたのメーターでチャンネルや対数十年の数に依存している世代間の間隔を決定する。デジタル機器の場合、この値は一般的に4〜5十年は、デジタル信号プロセッサのビンの数によって決定されます。アナログ楽器で、数十年はめったに整数ではない場合は、正確なモデリングは、実験的に決定される数十年の正確な数を必要とします。これを行うには、メーカーが割り当てた相対強度較正した蛍光ビーズの混合物からのデータは、実験で使用したのと同じ検出器電圧を高く設定で取得されています。ビーズのピークの位置は、intの面で、対数スケールのキャリブレーションが可能にログディケード当たりensity範囲。具体的には、これは、メーカーが割り当てた値の対数に対して各ビーズ型のチャネル番号をプロットすることにより行われます。ビーズデータ値の最適な直線の傾きは、チャネルあたりの相対強度単位の数を与えます。チャネル数を乗じ、この値はその後の強度の2倍の減少（ すなわち 、娘世代間隔）に対応するチャンネルの数が14を計算することができ、そこからフルスケールのログ数十年、となります。 </li><li>世代間の固定間隔を使用するか、または間隔をフローティングにして使用するかを決定します。 標準 （固定）設定では、各世代の場所を割り当てるには、手順4.5で決定し、世代間隔値を使用し、ヒストグラムが明瞭なピークを欠いているときに一般的に使用されます。 フロート設定は、各世代のピーク位置がヒストグラム形状によって決定することができ、いつdistinguishabl一般的に使用されている電子世代のピークは明らかである。 </li><li>すべての世代またはフローティング幅に固定されたピーク幅を使用するかを決定します。固定幅は、すべての世代をモデル化するためにSDが刺激されていない対照サンプルに対して計算使用し、サンプルを区別世代のピークを欠いているときに一般的に選択されます。フローティング幅はプログラムが独立してそれぞれの世代のためにSDを変化させることができ、最高の区別世代ピークで使用されます。 </li><li>増殖解析モジュール（ここではModFit LTバージョン3.3）を含むプログラムを実行します。分析するデータセット（ 例えば 、 表1にチューブ8の場合と対比PKH26 POS細胞の刺激96時間培養）から刺激PKH26 posのファイルをロードします。 </li><li>この場合、現実的にゲートPKH26（585/42）（7-AAD NEG）CD3 posのリンパ球と小さな破片と大きな凝集体（ 図3）を除外するために、FSC対SSC中で、分析するためのパラメータを選択します。定義でこれらの領域は、爆発は、通常見られる高い前方散乱領域を含めるとCD3発現が刺激された培養物でダウン変調されてもよいことに注意するように注意してください。 </li><li>増殖ウィザードを使用して、新しい増殖モデルを作成します。 [データファイルを開く （[スタート]タブ）を使用して、非刺激PKH26 posの制御ファイルをロードし、分割されていないセルに対応する親の分布のピークチャンネルの位置を定義します。 </li><li>親ピークの位置と幅（標準偏差）の値に注意して、刺激されていないPKH26 POS制御用ファイルを分析します。一定のピーク幅（SD）が望まれる場合には、 ロックのSDをチェックします 。 </li><li> PKH26 ネガティブコントロール（ 例えば 、PKH26 neg細胞の96時間培養表1のチューブ7の場合と対比）をロードします。 PKH26 ネガティブコントロール上最も暗い世代のピークチャンネルを設定することにより、世代の数を調整します。これは、NUを決定モデルが正確に合うことができるの娘世代のmberとは、通常、6月9日の世代である。 </li><li>刺激を受けたサンプルのデータファイル（ 例えば 、 表1のチューブ8の場合と対比PKH26 posの細胞の刺激96時間培養）を開き、手順4.7で定義されている親のピーク位置とSDの領域が変わらないことを確認します。一定の世代間隔が望まれる場合には、 標準モデルオプションを選択し、それ以外のフローティングオプションを選択します。 </li><li>ステップ4.9で定義された同じモデルを使用して、データセット内の各実験ファイルを分析します。視覚的にも減少カイ二乗（RCS）の値で定義されるような親のピーク位置の微調整は非常に最高のフィット感のために必要であるかもしれません。 </li><li>データセット内の各実験ファイルに対するベストフィットに起因する目的の増殖メトリックを記録。可能なメトリックの包括的な説明については参考文献を参照してください。 22。 </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K·ハンフリー、JD Tario、ジュニアとPKウォレスはライフテクノロジーズ社とBD Biosciencesから評価用にあらかじめ市販の細胞追跡試薬を受けています。 ADはBantlyとJSムーア各種CellVue細胞追跡色素の準商用特性評価のためのPTIリサーチ社からライフテクノロジーズ社と資金からの評価のために事前に市販の細胞追跡試薬を受けています。 K·ミュアヘッドは（Phanosテクノロジーズ社にコンサルティングサービスを提供しています（PKHとCellVue染料の所有者）とシグマアルドリッチと分子標的·テクノロジーズ株式会社のバックアップテクニカルサポートを提供してSciGro社によって採用されているこれらの代理店染料）。 この記事への生産とフリーアクセスは、Sigma-Aldrich社が主催しています。

ここで説明する方法は、それらの最も確実膜色素13,16,18と膜タンパク質または染料2,11,13,16のいずれかを使用して、リンパ球サブセットの表現型と増殖の追跡のために、使用してhPBMCラベリングのための最適な結果を与えるために、私たちの組み合わせの研究室で発見された18。 図1および図2に示すように、明るく均一な標識は最も容易に生理的塩の存在を制限し、混合技術を使用することによって達成される色素の同じ濃度にすべての細胞の急速な、均質な被ばくをもたらすこと。膜染料による染色は脂質二重層に分割することにより発生するため、無料の色素濃度を変更する他の変数は、標識効率に影響を与えることができます。たとえば、特に、管壁への吸着を染めるため減少し遊離染料濃度は前希釈液Cで再懸濁すると、塩の少ない効率的なウォッシュアウトで丸底ポリスチレンチューブ結果にラベリング低い染料濃度で。どちらの要素も円錐底ポリプロピレンチューブ（ 図3、図4、使用するラベルが実行されるときよりも広い染色分布を与える傾向がある 未発表データ）。最適化された染色手順が使用されている場合でも、サンプルの年齢やタイプもピーク幅に影響を与えることができる。たとえば、24時間古い血液サンプルまたはTRIMAフェレーシスフィルタ範囲から単離したリンパ球のCVに対し14から20パーセントから新たに採取した血液の範囲（ 図3、文献13および未発表の結果）から単離されたPKH26 posのリンパ球のCV 25から30から％（ 図4およびRef 18）。 染色の均一性と非生存細胞を解析から除外し、両方の区別娘のピークが順番に観測されたデータ（ 図5と図6に合わせて増殖モデルの選択に影響を与える色素希釈プロファイルで明白であるかどうかに影響を与えることができる程度</strong&gt;）。 ModFit（Verityのソフトウェアハウス、料理Topsham、MEは）そのような増殖指数と前駆周波数（ 図3、図5と図6、表3）のようなメトリックを生成するために使用されるソフトウェアの一例として、ここで使用されていますが、他のソフトウェアパッケージを使用すると、モジュールが分析する含まれてい増殖データ。これらを含めるFCSExpress（de novoのソフトウェア、ロサンゼルス、CA）およびFlowJo（ツリースター社は、オレゴン州アッシュランド）。これらのプログラムのすべては、反復的にシーケンシャル娘の世代を表すガウスピークの位置、高さ、およびSD（または幅）を変更することにより、生データへの最適解を非線形最小二乗分析を使用しています。増殖指数（PI）と前駆周波数（PF）は、増殖の程度の最も一般的に使用される指標です。 PIは、ModFitによって定義されるように、チミジン取り込みアッセイの &#39;刺激指数&#39;に類似アッセイの過程で細胞数の増加の尺度である。 PFは初期populat中の細胞の割合を返します増殖によって刺激に応答したイオン。用語は、ソフトウェアパッケージ（ 例えば 、FlowJoとModFitが&quot;増殖指数&quot;が何を意味しているかで異なる定義や計算を使用）22の間で多少異なりますので、文献を読む場合は注意が、しかし、お勧めします。 蛋白質の染料を使用した場合の膜色素で標識及び増殖分析のためにここで説明する重要な問題も発生しています。例えば、混合技法に細心の注意を払うも、CFSE（ 図6）2-4,13,18,24 を使用するときに均一な分布と区別娘のピークを得るために、死んだ/死細胞の排除とともに、遵守しなければなりません。表現型と生存率評価のための蛍光色素を適切に選択することは、特に、CFSE 2-4,11,13,16,18として可視発光タンパク質色素で、抗体陽性細胞を認識するために過度のスペクトルの重なりと不能を回避することも重要である</sup&gt;。トラッキング色素の濃度を減少させると隣接スペクトルチャネルに補償の問題を減少させるだけでなく、娘細胞強度が自家蛍光と重なるように開始する前に監視することができる細胞分裂の数を制限します。あるいは、このような遠赤色発光CellVueクラレットなどの新しいセルトラッキング色素（Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO）の使用または紫色発光CellTraceバイオレット（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）は（ 図6）補償の問題を減らすことができます。膜染料は一般的にあまり毒性11,26を示す傾向があるものの、最終的に、それは染料のいずれかのクラスを持つオーバーラベル細胞への可能性があります。それが使用されるトラッキング色素の濃度が追跡する細胞の機能（ 図6）3,13,16,18 を変更していないことを確認するために常に必要がある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 市販品を購入する </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14175-079 </td><td>フェノールレッドを含まないカルシウムとマグネシウムを含まない、 </td></tr><tr><td>ヒトIgGコーン画分IIおよびIIIグロブリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD3-FITC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 349201 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD4-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 340672 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences社</td><td> 348799 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8-FITC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 347313 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8-APC </td><td> Caltag（Life Technologies）を</td><td> MHCD0805 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD19-APC </td><td> Caltag（Life Technologies）を</td><td> MHCD1905 </td><t実験室での滴定により決定されるようにD&gt;飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD25-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 340938 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD127-PE </td><td> BD Biosciences社</td><td> 557938 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 mg / mlで、アジ無料</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 mg / mlで、アジ無料</td></tr><tr><td> PBS </td><td>ギブコ</td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH中10-3M PKH26および希釈剤Cを含有PKH26赤色蛍光細胞リンカーキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> PKH26GL-1KT または MINI26-1KT </td><td>ステップ1の手順も適用されますPKH67または他のCellVue染料を含有するキットへ</td></tr><tr><td> EtOHおよび希釈液Cで10-3M CellVueクラレットを含むCellVueクラレット遠赤色蛍光細胞リンカーキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MINCLARET-1KTまたはMIDCLA​​RET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - （及び-6） - カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA-SE） </td><td> Invitrogen社（Life Technologies）を</td><td> C34554 </td><td>非蛍光性、形成する膜エステラーゼによって開裂蛍光アミノ反応性カルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE） </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD修正可能なバイオレット</td><td> Invitrogen社（Life Technologies）を</td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td>円錐形の滅菌12×75ミリメートル ポリプロピレンチューブ＆キャップ</td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td>良い膜染料染色効率を（;上清吸引中に小さいセル損失低減色素吸着）を与える</td></tr><tr><td> 12×75ミリメートルroundの底 ポリスチレンチューブ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Bioscience社</td><td> FACSキャリバー LSRFortessa </td><td>とAPC EX、FITC、PKH26、および7-AAD（全角それぞれ520 nmの567 nm、および655 nmであり、例：488 nm）を検出することができ、任意のメーター。 633から640 nmで、EM。 660 nm）を</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> LSRIIシアン</td><td>とAPC EX、FITC、PKH26、および7-AAD（全角それぞれ520 nmの567 nm、および655 nmであり、例：488 nm）を検出することができ、任意のメーター。 633から640 nmで、EM。 660 nm）を</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ラボラトリー準備 </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D、 濃縮された株式</td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS中1 mg / mlである。 -20℃でアリコートとストアでフリーズ</td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D、 WOR王株式</td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS中での100μg/ mlの、1 mg / mlの凍結ストックから毎日用意しております。 </td></tr><tr><td> IgGをブロック</td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / mlのヒトIgGコーン画分IIおよびIIIグロブリン+ 10 mg / mlのBSA。 </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

蛍光細胞追跡色素は、流れやイメージサイトメトリーとの組み合わせで、in vitroおよび in vivo で異なる種類の細胞の相互作用と運命を研究するためにどのと、強力なツールです。1月5日このような染料を使用してパブリケーションの数千のいくつかは、文字通りありますが最も一般的に遭遇する細胞追跡アプリケーションはの監視が含まれます： <ol><li>幹細胞および前駆細胞休止、増殖および/ ​​または分化6月8日 </li><li>抗原ドリブン膜伝9および/ ​​または前駆細胞の増殖と3,4,10-18 </li><li>免疫調節およびエフェクター細胞機能1,18-21。 </li></ol>市販の細胞追跡色素は、それらの化学的性質と蛍光特性が大きく異なりますが、大多数の落下細胞標識のそれらのメカニズムに基づいて2クラスのいずれかに。 PKH26に代表される &quot;膜色素&quot;は、高親油性染料トンアール細胞膜1,2,11に安定しますが、非共有結合帽子パーティション。 CFSEに代表される&quot;タンパク質色素&quot;は、細胞のタンパク質4,16,18で安定な共有結合を形成するアミノ反応性染料である。各クラスには独自の利点と制限があります。彼らの成功を使用するための鍵は、特に複数の色素が異なる種類の細胞を追跡するために使用される多色の研究では、各クラス2-4,16,18,24の最適な利用を可能にする重要な問題を理解することである。 プロトコルは、細胞追跡色素を使用しているとき貧しいまたは変数の結果の3つの一般的な原因を強調ここに含まれています。これらは次のとおりである： <ol><li> 明るく、均一で再現性の標識を達成するために失敗しました 。これは、任意の細胞追跡研究のために必要な出発点であるが、タンパク質染料または抗体のような平衡結合試薬を用いた場合よりも膜の染料を使用して別の変数に注意を払う必要があります。 </li><li> 次善の蛍光色素の組み合わせND /または重要な報酬のコントロールが含まれて使用した場合。色素の蛍光を追跡することは、典型的には10 2 -抗体蛍光より10 3倍明るい。したがって、追跡用色素の存在が使用されている他のプローブを検出する能力が損なわれていないことを確認することが不可欠である。 </li><li> ピークモデリングソフトウェアとの良好なフィット感を得ることに失敗しました 。このようなソフトウェアは、前駆体の頻度や他のメトリックに基づいて、異なる集団または刺激を越え増殖応答の定量的な比較が可能になります。良いフィット感を得ること、しかし、色素希釈プロファイルを歪めると観測された色素希釈プロファイルの特性を持つモデルの基礎となる仮定のマッチングができる死んだ/死細胞の排除を必要とします。 </li></ol>ここに挙げた例は、細胞増殖をモニターするために、膜および/またはタンパク質の染料を使用している場合、これらの変数は結果に影響を与えることができる方法を示しています。

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

免疫細胞機能や増殖を監視するための細胞追跡用染料の使用の成功は、いくつかの重要な手順が含まれます。我々は、するための方法を説明します：1）膜染料と明るく、均一で、再現可能なラベルり得るステップと、2）蛍光色素とデータ収集条件を選択すると、3）色素希釈に基づいて、細胞増殖を定量化するためのモデルを選択する。

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K ビュー.  Roswell Park Cancer Institute. 免疫細胞機能や増殖を監視するための細胞追跡用染料の使用の成功は、いくつかの重要な手順が含まれます。我々は、するための方法を説明します：1）膜染料と明るく、均一で、再現可能なラベルり得るステップと、2）蛍光色素とデータ収集条件を選択すると、3）色素希釈に基づいて、細胞増殖を定量化するためのモデルを選択する。

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Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

生物学

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...