私たちは、批判的に原稿を読み取るための博士ランディChitwoodに感謝します。この作品は、ホワイトホール財団とHJKにアルフレッド·P·スローン財団の補助金によって支えられている。

1。光学装置（図1） <ol><li>二光子励起フェムト秒パルスを用いて赤外パルスレーザーシステムが使用されます。高いレーザ出力パワー（890 nmの波長でいくつかのケースでは&gt; 2W）は、システムの光学部品によって導入された大規模な損失を相殺するために必要です。 </li><li>つのプリズムから成るprechirperシステムはAODs 1で導入された時間的分散を補償するために、事前の音響光学偏向（AODs）へのレーザーパルスに負の群速度分散（GVD）を付与する。 </li><li>大きな開口部を持つ2つのAODs（NA 0.8で40倍の水浸対物レンズは10mm）が2次元でレーザビームを偏向させる。 </li><li> 100木立/ mmの反射型回折格子は、短いレーザーパルスを用いAODsによって導入された空間的な分散を補償するAODs 13センチメートルの背後に配置されている。 </li><li>レーザービームは直立microscoのカメラポートに2リレー望遠鏡で指示されるPE。 </li><li>アイリスは、光学部品の位置合わせのために一定の間隔で配置されます。 </li><li>対物レンズの前でイックビームスプリッタは、試料に赤外励起光を透過し、検出器上に標本からの蛍光光を反射する。 </li><li>該当する場合 - - コンデンサーを通してエピとtransfluorescence検出器（光電子増倍管、光電子増倍管）が対物レンズを通して、蛍光シグナルを収集します。 </li><li>色ガラスフィルター（BG-39、3-5 mm）を検出器に到達する励起光を防ぐために、検出器の前面に配置されます。 </li><li> AODの偏向角は順番に電圧制御発振器を駆動するデジタルアナログコンバータボード（156.25 kHzのクロ​​ックレート）を装備したコンピュータによって制御されます。 </li><li>光電子増倍管からの信号は、次の場所に格納される前にローパスバタワースフィルタ（100 kHzのカットオフ周波数）を介して中継され、アナログ - デジタル·コンバータ（156.25 kHzのクロ​​ックレート）によってデジタル化さ解析のためのコンピュータ。 </li><li>アライメントや電気的ノイズは、レーザー光の有無にかかわらず、光電子増倍管の低域と高ゲインで、同様に、インジケータなしで蛍光シグナルの分布を記録することによってテストされています。スキャナが正しくセットアップされ、高利得で、インジケーターの蛍光シグナルの分布の幅は蛍光信号（図2）の他のディストリビューションの幅よりもはるかに大きい場合にはシールドされています。 </li></ol> 2。実験手順<ol><li>ディザリングされたランダムアクセススキャンは、カルシウムの細胞内増加の検出に依存しています。ニューロンは多数の神経組織5にカルシウム指示薬のエステル体のボーラス注射（例えば、AMオレゴングリーン488 BAPTA-1）を用いて染色することができる。 </li><li>各ニューロン細胞体からのいくつかの場所は、（ &quot;ディザリング&quot;、4箇所、それぞれの場所で6.4μsのeの= 25.6μsの記録時間は、短時間ずつ記録します各サイクルにおけるACHニューロンは、図。 3C）。興味のあるニューロンを選択するには256x256ピクセルで構成されるフルフレーム（図3A）が取得される。記録しようとする各ニューロンソーマの中心はこの画像内で手動で選択されています。制御ソフトウェアは、自動的にこのセンターの周りには2μm間隔で3つの点を追加します。 </li><li>各サイクルにおいて、蛍光シグナルは40ニューロン（図3B）の各々から記録されている。このプロセスは、1つの記録の全期間（5秒の録音が= 3255サイクル、1サイクル= 1.536ミリ秒）ごとに繰り返されます。 </li></ol> 3。スパイク検出効率を最大化するためにオンラインソフトウェアツール<ol><li>蛍光体細胞のカルシウムシグナルからスパイク検出は、体蛍光カルシウムシグナルの高い信号対雑音（S / N）比に依存しています。 S / Nが高く、励起強度を増加させることによって達成することができます。励起強度は、しかし、唯一の光損傷のため、一定の限度まで増やすことができます。スパイクの検出は非常に小さいWINDO内に高いです蛍光信号はS / Nが高いを持っていますが、ごくわずかしか光損傷が3を観測した場合にのみ、励起強度のワット記録された信号は、録音時に高スパイク検出のウィンドウ内にあることを確実にするために、我々は光子率（式3.2参照）、オンライン分析を使用してベースラインの蛍光の減少を監視します。 </li><li>ニューロンあたりのおおよその光子率がベースラインノイズの短い時間窓（100から200ミリ秒）から計算されます。光子の数（Nλ）と光子率（λ= Nλ/Δtが）は、次式とした相対蛍光変化の分布（σ）をフィッティングすることにより蛍光値から計算されます： </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> この方程式は、相対的な蛍光変化への変数の変化に伴うフォトンショットノイズのポアソン分布を表しています。ΔF/ F =（G * Nλ（t）は、-G * N＆ラムBDA、Gは光電子増倍管と他のすべての電子部品の累積利得を表し、0）/ G * Nλ、0。フォトンショットノイズに加えて、ノイズ発生源が（動きのアーチファクト）があるので、この式は正しくvivoでの録音のために検出された光子の数を決定しないことに注意してください。それにもかかわらず、この方程式は、ノイズを推定するために生体内で録音するのに便利です。 <ol start="3"><li>ベースライン蛍光は同じ時間枠から計算され、時間や試験の関数としてプロットしている。ベースラインの平均減少はこの制限を超えたときにスパイクの検出が急激に低下するので、レーザーパワーを調整することによって、0.0002 /秒以下に保たれます。 </li><li>ニューロン細胞体の位置毎に10〜20分間は再度フルフレーム画像を取得することで検証されます。必要に応じて、記録位置が調整されます。場所は、一度にすべてのニューロンのための、または個々のニューロンのために調整することができます。 </li></ol> 4。 Reconstructio蛍光シグナルからスパイクタイミングのn（デコンボリューション） <ol><li>カルシウムトランジェントの減衰が長いので頻繁に合計する時の神経活動から得られた蛍光シグナル（数百ミリ秒）。デコンボリューション法では、蛍光シグナルからスパイクとスパイクタイミングを再構築します。 </li><li>記録された蛍光信号の基礎となる可能性が最も高いスパイク列を判別するには、異なるモデルが比較されます。最尤法で - したがって、スパイク列とスパイクタイミング - ここでは、モデルを決定するために遺伝的アルゴリズムを使用していました。 </li><li>ニューロンの不均一な集団では、スパイク誘発カルシウムシグナルはニューロン間で異なることができます。データの教師なし分析設定のために私達は考慮ニューロンからニューロンへのスパイク誘発カルシウムシグナルの変動を取るアルゴリズムを設計しました。 </li><li>誤検出が多数を避けるためには、mの許容振幅と減衰時間が一定で収縮するのに便利ですスパイク誘発カルシウムシグナルのodel。シングルスパイク誘発カルシウムトランジェントの一定の振幅と減衰時間の同時分布は、同時電気生理学的および光学録音を使用して同じ実験条件下でのニューロンと同じ種類の実験からの別個のセットに記録されます。 </li><li>遅いベースラインの変化を考慮し、デコンボリューションの計算コストを削減するため、長い録音は1-5秒から数短いトレースに分かれています。 </li><li>各ニューロンと各記録については、デコンボリューションアルゴリズムは、モデルの数が多い（最大1,000,000の異なるモデル以上）をテストすることができる。デコンボリューションをスピードアップするために、一つの実験を並行して10の異なるコンピュータに上にデコンボリューションされています。 </li><li>デコンボリューション後、スパイクのデータが分析され、検査されます。周囲の刺激時間のヒストグラム、スパイク確率、発射速度は（ニューロンあたりの平均スパイク）自動化された方法で計算されます。 </li></ol> 5。代表的な結果記録された蛍光体細胞のカルシウムシグナルの高い信号対雑音比で成功スパイク検出のヒンジ。単に高励起率（高いレーザパワー）を使用すると、生物学的物質（光損傷）にphotoeffectsの悪影響をもたらすことができます。ディザリングされたランダムアクセスでは光損傷をスキャンすると、ベースラインの蛍光とスパイク誘発カルシウム蛍光シグナルの減少の減少として現れる。スパイク誘発シグナルの減少はすぐにスパイクを検出するために失敗することがあります。蛍光シグナルからスパイク検出が高い励起強度の非常に小さな窓しかありません。ハイエンドでは、このウィンドウが下端に蛍光シグナルが低い信号対雑音比を有し、光損傷によ​​って制限されます。スライス面下約100μmで録音するときに急性スライスにおける皮質ニューロンのために私達は約400,000-1,500,000フォトン/ sの光子率をもたらすレーザーパワーを使用します。高を使用している場合親和性の指標 - ここオレゴングリーン488 BAPTA - 1 - この信号は個々のスパイクを検出するために十分である。図。 3Eは非常に低い励起率、検出ウィンドウ内の記録の一例であり、非常に高い励起レートで1で記録した蛍光シグナルの例を示しています。 単一セルと単スパイク分解能で神経活動を記録するために他の技術に比べて、ランダム·アクセス·スキャンが同じ、地元住民からのニューロンの多くから録音することができ、ディザリングとテトロード/多電極録音に比べて例えば低侵襲で。したがってディザリングされたランダム·アクセス·スキャンが閾値上活動6（図4A）、神経細胞（皮質可塑性）の人口における神経活動の変化によって合図相互情報量を測定するために多くのニューロンからの神経活動を記録し、閾値上の活動の伝播に使用することができニューロンは14の個体（図4B）を介して<img<html> ALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot; /&gt; 図1ディザリングされたランダム·アクセススキャンセットアップの光学設計。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> 図2アライメントとテスト：異なる条件下で記録された蛍光シグナルの分布。 A）は、より高い光電子増倍管のゲインが、ないレーザ光が全くレーザー光電子増倍管と低ゲイン、B）は、分布があるため、暗電流を光電子増倍管の幅が広い。 C）にレーザーで光電子増倍管と高ゲインで記録。 Bとは、このディストリビューションに示すにおけるディストリビューションの違いは、励起光がPMT検出器に到達したことを示すことになる。 D）の蛍光シグナルの分布は、ニューロン細胞体から高利得で記録。他のノイズ源が寄与していない場合、この分布はショット雑音光子から生じる。 jpgの &quot;/&gt; 図は、3つのディザリング原理の1サイクルのニューロン細胞体の位置を検出して選択する）フルフレーム蛍光画像A、B）スキャン·パス、C）がイラスト;各ソーマ（円）いくつかの場所では、次回にビームを移動する前に記録されている2つのD / Aチャネルの出力のソーマ、D）のイラスト。各ニューロンソーマは、蛍光信号は、各ソーマで4つの異なるスポット（S1〜S4）から記録されている。各スポットの位置は、そのx座標とy座標で与えられる。すべてのスポットやすべてのニューロンのxとyの位置が連続的にデジタル·アナログ変換器に送信されます。ビームは2ニューロンの細胞体との間を移動している間、信号は（空白）を取得されていません。 E）の蛍光シグナルの例は。それぞれの例は（電気生理学的細胞接着型の記録で測定）1スパイクへの応答を示していることに注意してください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> 図4コルティを学ぶcalはディザリングされたランダム·アクセス·スキャンを使用して機能する。 A）は、多数のニューロン集団によって合図相互情報量を測定します。上の画像は、急性脳スライスとレイヤ4（L4）の同じ皮質カラムに配置された2つの刺激ピペットの顕微鏡写真を示す。中央のグラフは、刺激の各繰返しの神経反応を示しています。下のグラフは、ニューロンの記録された人口によって合図シャノンの相互情報量を示しています。皮質ニューロンの集団間の閾値上スパイク活動のB）測定伝播（信号伝播）。上のグラフは、実験設計を示し、中央の画像は、蛍光画像を示し、破線はバレルの境界を示し、下のグラフは、視床皮質線維（三角形）の電気刺激に応答して、検出されたスパイクを示しています。

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision.">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex.">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+[Ca2+]i+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb.">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li><li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. 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特別な利害関係は宣言されません。

ディザリングされたランダム·アクセス·スキャンが間接的に神経細胞体の各スパイクに関連付けられている細胞内の体細胞内カルシウムの増加から閾値上スパイク活動を検出します。細胞内カルシウムの増加は、蛍光カルシウム色素で検出されます。ディザリングされたランダムアクセススキャンの制限は、カルシウム蛍光信号の限られた信号対雑音比のから大きく生じる。信号対雑音比は...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>光学部品はレーザーから順にリストされています</td></tr><tr><td>タイタン：サファイアレーザー</td><td>コヒレント社</td><td>カメレオンウルトラ2 </td><td>ハイパワー出力を推奨（900 nmでの&gt; 2W） </td></tr><tr><td>色消しレンズf = 30mmの</td><td>トールラボ</td><td> AC254-030-B </td><td> 650-1050 nmの反射防止（AR）コーティング</td></tr><tr><td>色消しレンズf = 100mmの</td><td>トールラボ</td><td> AC254-100-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>レンズf = 75ミリメートル</td><td>トールラボ</td><td> LA1608-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>レンズf = 175ミリメートル</td><td>トールラボ</td><td> LA1229-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>色消しレンズf = 300ミリメートル</td><td>トールラボ</td><td> AC254-300-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>色消しレンズf = 100mmの</td><td>トールラボ</td><td> AC254-100-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>色消しレンズf = 100mmの</td><td>トールラボ</td><td> AC254-100-B </td><td>アーカンソー650-1050 nmの</td></tr><tr><td>音響光学偏向</td><td> Intraactionコープ</td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td>反射型回折格子</td><td>ニューポート</td><td> 53-011R </td><td> 65 MHzの帯域幅を持つAODsに100本/ mm、45 mradの角度をスキャン</td></tr><tr><td> 21.6ミリメートルブリュースタープリズム</td><td>ラムダリサーチ光学株式会社</td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td>色ガラス</td><td>ショット</td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>クロマ·テクノロジー株式会社</td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管モジュール</td><td>浜松市</td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADCボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン488 BAPTA-1 AM </td><td>インビトロジェン</td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

脊椎動物の中枢神経系における情報のシグナリングは、多くの場合、神経細胞ではなく、個々のニューロンの集団によって運ばれる。また、閾値上スパイク活動の伝播は、ニューロンの集団が含まれます。皮質機能に対処する実証研究では、直接こうして高解像度の神経細胞の集団からの録音を必要とします。ここでは、光学的手法および単一セルと単スパイクの分解能で、最大100からニューロンへの神経活動を記録するためのデコンボリューションアルゴリズムを記述する。この方法では、皮質ニューロンにおける閾値上電気スパイク（活動電位）に関連付けられている細胞内の体細胞内カルシウム濃度の一過性増加の検出に依存しています。光学録音の高時間分解能は音響光学偏向（AODs 1）を用いて高速なランダムアクセスのスキャン技術によって達成される。不透明な脳TISにおける高空間分解能でのカルシウム感受性色素結果の二光子励起2を訴える。蛍光カルシウム録音からスパイクの再建は最尤法によって達成される。同時電気生理学的および光学録音は我々の方法が確実に、（&gt; 97％スパイク検出効率）のスパイクを検出する偽陽性スパイク検出（&lt;0.003スパイク/ s）、および高い時間精度（約3ミリ）3率の低さがありますことを示しているスパイク検出のこの光学的な方法は 、in vitro および in vivo における 3,4麻酔動物の神経活動を記録するために使用することができます。

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

皮質機能は、多数のニューロン集団のレベルで発生するので、脊椎動物の中枢神経系の機能を理解することは、多くのニューロンからの記録が必要になります。ここでは、単一セルと単スパイク解像度、ディザリングされたランダムアクセスのスキャンと閾値上の神経活動を記録する光学的方法を説明します。この方法は、高時間分解能で、最大100からニューロンに蛍光体のカルシウムシグナルを記録します。最尤アルゴリズムは、体蛍光カルシウムシグナルから基礎閾値上神経活動をdeconvolves。この方法は、確実に高い検出効率と誤検知率の低さとスパイクを検出し、神経集団を研究するために使用することができます<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em生体内で&gt;</em&gt;。

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K ビュー.  The University of Texas at Austin. 皮質機能は、多数のニューロン集団のレベルで発生するので、脊椎動物の中枢神経系の機能を理解することは、多くのニューロンからの記録が必要になります。ここでは、単一セルと単スパイク解像度、ディザリングされたランダムアクセスのスキャンと閾値上の神経活動を記録する光学的方法を説明します。この方法は、高時間分解能で、最大100から?...

ビデオ: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

単一ユニット活動とElectrocorticographic信号を記録するための慢性神経電極の外科的移植

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

神経科学

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

記録と刺激アプリケーションの高接触密度、フラットインターフェイスの神経電極の作製

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

神経活動と Spm と頭蓋内脳波データを使用した接続の分析

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...