This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins&#8217; laboratory for the help on the OCT imaging.

注：動物実験プロトコルを見直し、大学で施設内動物管理使用委員会によって承認された。 P20へP10歳の時にいずれかの性別のCD1マウスをこの研究で使用されている。 手術と実験録音1.ソリューション<ol><li>のNaCl 124、KClの3.75、KH 2 PO 4 1.25、MgSO 4を2、NaHCO 3で26、ブドウ糖10、およびCaCl 2 2：（mm）を含む通常の人工脳脊髄液（aCSFの）バッファを準備します。実験の開始時に切開した後、同様に洗浄システムのための組織の回復のために、この正常なaCSFのに使用します。 </li><li>スクロース220、塩化カリウム2.95、のNaH 2 PO 4 1.3、MgSO 4を2、 炭酸水素ナトリウム26、ブドウ糖10、およびCaCl 2 2：海馬の解剖中に使用して含んでいるショ糖のaCSF（mm）を準備します。無傷の海馬組織標本におけるてんかん様活動を誘導するために、正常なaCSFの少なくとも4アミノピリジン（4-AP）を追加100μMの濃度。 </li></ol>無傷の海馬の準備のために2の外科的処置<ol><li>デシケーターガラスジャー（具体的な材料および装置における第1号）の底でチャンバ内にイソフルラン（1ミリリットル）をドロップし、動物が接触取得していませんので、下段の表面を覆うように、通常の紙タオルを使用液体。その後、瓶にCD1マウスを置き、蓋を閉じます。約1分〜2分間、閉鎖瓶で動物を保​​管してください。息周波数は約1秒あたりのとき、ジャーからマウスを取り外します。 </li><li>手術台の上でマウスを置き、適切なはさみで首を切る。すぐに断頭した後、約30秒間氷冷（3-4℃）に頭部、酸素スクロースaCSFのを置く。 </li><li>頭蓋骨の上に皮膚を除去するために、テンポに近い2つの端部にだけでなく、頭の真ん中の線に沿って頭蓋骨をカットする細かいハサミ（特定の材料および機器で5番）を使用してくださいRAL葉。脳を露出させるために、ヘッドの各側にカット頭蓋骨を剥離する鉗子（具体的な材料および装置で第6）を使用します。 </li><li>慎重に頭蓋骨の底から脳を剥離し、脳と頭蓋骨の頭頂葉の間の隙間にマイクロラボへら（具体的な材料および装置における第8号）を挿入した後、準備された氷のように冷たい上にドロップします（3湿ったろ紙（具体的な材料および装置における第2号）に覆われて-4℃）外科段階。氷冷刃で小脳を外し、脳の正中線を切断して2半球を分離する。その後、氷冷スクロースaCSFのを満たしたビーカー中に分離した2つの半球を配置し、95％O 2/5％CO 2でバブリング。 </li><li>半球の半分を取り、氷冷したろ紙ステージ上に置く。余分なソリューションを吸うために脳を中心に定期的なペーパータオルまたはろ紙を置きます。材料における2ファイアーポリッシュガラスピペットツール（第10号を使用して、脳の中心部の残りの部分から大脳皮質を分離する装置）。 </li><li>海馬は皮質の内側から露出し、氷冷ステージに置かれた後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴を配置し、海馬の周りに余分な溶液を除去する。海馬の両端に皮質との接続を切断します。その後、火災研磨されたガラスのツールで脳から海馬を解剖し、脳の残りの部分を削除します。 </li><li>その白板側を上に向けおよび海馬溝を下に向けて全体の海馬を分離します。すぐに再び組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴をドロップし、ペーパータオルの一片を用いて組織の周りに余分な溶液を除去する。溝（ 図1B、C）を公開する全体海馬を裏返しする火災研磨されたガラスツールを使用します。 </li><li>通常の光学顕微鏡下では、具体的なMateriに特注のガラス針（11号を挿入溝の方向（ 図1C）に沿ってALSと機器）溝の一端にと鉤状回する歯状回（DG）から、ファイバ接続を切断したりCA1フィールド、。必要に応じて、海馬の中隔と時間的な端をトリミングするために氷のように冷たい刃を適用します。カット溝に（具体的な材料および装置における第12号）カスタムメイドの金属ワイヤループを挿入し、火災研磨されたガラスツールによって海馬の海馬台/ CA1の端部を保持しながら、組織から離れてDGの上に引き出します（ 図1D） 。 </li><li>上記の展開手順の後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの別の2〜3滴を追加し、組織の周りに余分な溶液を除去する。その後、約（エッジ（ 図1E）で氷のように冷たい刃で折り畳まれていない海馬をトリミングし、通常aCSFので満たされた回復室にスパチュラで準備を置き、室温で95％O 2/5％CO 2でバブリング25°C）。去る折り畳ま海馬組織は、記録チャンバーにそれを配置する前に約1時間を回復する。 </li><li>他の脳半球を取り、2.5から2.9のステップを経るためにそれを使用。通常、単一の海馬を展開し、組織酸素化および水和を維持するために継続的に氷のように冷たい蔗糖aCSFのをドロップするように全体の手順を完了するのに約1から2分を取る。 </li></ol> 3.実験システムのセットアップ<ol><li>カスタムは、ピングリッドアレイ（PGA）パッケージPMEAを作製し、パッケージ（ 図3B）上のピンのパッドに単一微小電極の各パッドに接続するために、マイクロワイヤボンディングを使用し接着。その後、カスタムメイドの回路基板13上のソケットに、パッケージを挿入します。 </li><li>個別にカスタムメイドの回路基板13上の100のゲインで4 kHzとアンプに1ヘルツからバンドパスカットオフ周波数とのフィルタに各微小電極を接続してください。 A / D convは回路基板からのアナログ出力をデジタル化システムertingし、コンピュータのデータを取得し、格納する。 </li><li>溶液流（ 図4A）のための入口及び出口管を有するアレイの周りにカスタムメイドのプラスチック記録チャンバーを接着。システム内のさまざまなソリューションを維持し、トライ弁によりボトルの出力管に参加し、制御するために、少なくとも2つのボトルを使用してください。記録室にソリューションをガイドされている点滴室で配管システムにトライバルブの出力を接続します。 </li><li>三バルブと記録チャンバーの入口との間、溶液を記録チャンバーに導かれる前に、制御された温度（35℃）に溶液を加熱する電気ヒータを追加する。フラスコに接続された真空管に液を収集するために真空管に記録チャンバーの出口に取り付ける。この研究では、任意の実験ではすべてのソリューションをリサイクルしないでください。 </li></ol> 4. PMEA上に非折り畳み海馬を配置すると、神経活動を記録するために</p&gt; <ol><li>実験装置を製造するために、通常のaCSFのと4-AP aCSFの持つ別のボトルで1ボトルを埋める。両方のボトル、バブル95％O各実験の当初2/5％CO 2。実験中に選択される解決策を制御するためにトライバルブコネクタを使用してください。集塵容器内に溶液をポンプするチャンバーの出口に真空管を接続します。記録チャンバーにそれを配信する前に、パイプラインを加熱して制御​​された温度レベル（35℃）で溶液を維持する。 </li><li>チャンバ記録の入口と出口が閉じられたときに、記録チャンバー内に折り畳ま海馬を転送し、配置するカスタムメイドガラスピペットスポイトを使用する。顕微鏡下で、組織は溶液中に浮遊している中に、通常の小さなペイントブラシを使用して折り畳まれていない海馬を配置。研究者の方を向いて、下に向けてその白板側に折り畳まれていない海馬を置きCA3エリアまでを指し、およびCA1フィールド。 </lI&gt; <li>注意深くチャンバーを乾燥させ、組織アレイ上に下降するまで溶液のレベルを下げて記録チャンバーの端から真空ピペットを用いてチャンバ内の溶液を離れて吸う。その後、慎重にアレイ上に折り畳まれていない海馬を保持するために組織の上にカスタムメイドの組織アンカー（ 図4）（具体的な材料および装置で第14）を配置します。それを補充する記録チャンバーへの溶液の数滴を入れて、徐々に点滴チャンバ内で毎秒約2滴に流量を調整するための入口および出口を開く。 </li><li> 4-APに溶解するaCSFへの液供給を切り替えて、適切に流量を調整し、その後、回復するために約1分間の通常のaCSFた記録室で組織をインキュベートする。約5から10分間aCSFの溶解した4-APで組織をインキュベートした後、研究者は、自発的な活動が表示されたときに信号を記録するためにソフトウェアを起動できます。 </li></ol> 5.削除実験後にPMEAからの組織<ol><li>マイクロマニピュレータによる組織アンカーを制御し、徐々に記録チャンバーから組織を持ち上げる。記録チャンバー内の流れを停止し、入口と出口の両方をシャットダウンします。記録チャンバーは、ソリューションとの完全であることや、記録室が満杯でない場合室を埋めるために、溶液の数滴を追加する必要があります。 </li><li>組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを使用してください。組織は、溶液中に浮遊していない場合、組織は、まだアレイの上に座って注意深くチャンバーを乾燥させるために真空管を使用する。その後、慎重に徐々に室を再充填し、記録室がいっぱいになったときに流れを止めるために注入口をシャットダウンする入口を開きます。再び組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを適用します。 </li><li>手順を繰り返し5.2組織がアレイから切り離され、溶液中に浮遊しているまで。組織は、溶液中に浮遊している場合、離れた組織を吸引する真空管を使用する。オープントン彼は、入口に流れと出口に真空を開く。蒸留水でシステムを洗って、それを完全に乾く。 </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro.">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li><li>Schechter, L. 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J., Swann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+immature+hippocampus.">Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus.</a> Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).</li><li>Nam, Y., Wheeler, B. 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The authors have nothing to disclose.

海馬の縦方向および横軸が貫通する微小電極アレイと組み合わせて保存されて折り畳まれていない海馬調製物の開発が海馬7の解剖接続または神経伝播を研究する強力なツールを提供する。この展開手順は、成体マウスにおける海馬の研究にも適用可能である。この調製物を用いた最近の研究では、4-AP誘発性てんかん様活動は、折り畳まれていない海馬（ 図6）7,8...

神経信号の神経伝導または伝播を理解することは、脳1-3の正常な機能および病理学的状態の両方における神経コミュニケーションのメカニズムを決定するために重要である。海馬は、メモリ、および空間追跡などのいくつかの脳機能において基本的な役割を果たしており、劇的に挙動ならびに1,6に影響を与えるいくつかの病理学的変化に関与しているため、脳の中で最も広く研究構造の一つである。海馬は複雑な組織を示すが、その構造の異なる要素は、容易に識別され、スライス標本4-6にアクセスすることができる。海馬の横方向に、神経活動は、歯状回（DG）、CA3、CA1 andsubiculum 4,5を備えてトライシナプス経路を介して伝播することが知られている。これは、シナプス伝達および軸索伝導communicatiために主要な役割を果たすと考えられているこの横方向の回路4,6のオン。しかし、神経信号の伝播が横方向と縦方向4,6の両方で行われます。これは海馬が完全に伝播4の特定の方向に観測を制限スライス標本を使って調べることができないことを意味します。長手方向のスライスは、長手方向軸5に沿って軸索経路を調査するために開発された。研究者は、主に横方向と縦軸にそれぞれ6に沿って行動固有のガンマ及びシータ振動を観測した。これらの動作は別々に研究されてきた、まだ両方向への同時アクセスは、これらの動作を理解することが重要です。でも無傷の海馬製剤の開発は、海馬4の折り畳まれた構造に起因する組織全体を通して伝播を監視することは困難である。折り畳まれていない海馬はパックニューロンへのアクセスを提供します平らな二次元の細胞層7,8の形態である。 歯状回（DG）（ 図1）を展開することによって、海馬は、横方向及び縦方向の両方の接続がCA3およびCA1の両方を含む二次元のシートに配置された錐体細胞層に無傷のままでいる長方形の形状と平坦な形状を採用している神経伝播を研究するために使用することができる神経組織のフラット部分を残して（ 図2）8。神経活動は、個々のガラスピペット、マイクロ電極アレイ、刺激電極、ならびに電圧感受性色素（VSD）、3,7,8でモニターすることができる。また、トランスジェニックマウスの遺伝的にコードされた電圧インジケータは、伝播パターン9を追跡するために使用することができる。 折り畳まれていない海馬ネットワークの平坦な構成は、光学的な方法の記録のためにだけでなく、微小電極アレイに適しています。 M市販の配列のOSTは、平らなまたはロープロファイル電極が製造され、両方の組織スライスと培養神経細胞10-12に神経活動を記録することができます。しかしながら、信号対雑音比（SNR）は、ニューロンの細胞体は、組織内に深く配置されているので、信号が無傷の組織から得られた場合に減少する。高アスペクト比を有する微小電極アレイは、SNRを改善するために必要とされる。 この効果により、貫通微小電極アレイ（PMEA）が我々の研究室で開発され、折り畳まれていない海馬7,13に直径20μmと200μmの高さのスパイク64を挿入することにより、組織に直接プローブする能力を提供する。この微小電極アレイは、電位感受性色素イメージングに比べてより高いSNRを有しており、SNRが、実験7,13の間に安定している。折り畳まれていない海馬準備とPMEAの組み合わせが投資する新しい方法を提供します2次元平面上での神経伝達をIGATE。この技術を用いた実験では、すでに神経活動は、独立して、シナプスや電気シナプス7の伝播することが可能となる海馬における神経信号伝搬のメカニズムについての重要な結果が得られている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>desiccator jar</td>
			<td>LABRECYCLERS Inc.</td>
			<td>5410</td>
			<td>Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue recovery chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Operating&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17336B&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Medco Instruments No.:81995&#160;</td>
			<td>This scissors is used to&#160;&#160; decapitate the mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Miltex Goldman-Fox&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-517&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MILTEX INC&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; No.:5-SC-320</td>
			<td>This scissors is used to cut the skull of the mice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex 
			Hysterectomy Forceps</td>
			<td>Claflin Medical equipment</td>
			<td>CESS-722033-00001</td>
			<td>This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>tem #:&#160;105657&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Model #:&#160;90219</td>
			<td>The one with the smallest size in a normal paint brush package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fire polished glass help tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass tool with a metal wire loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass solution dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was&#160; made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue anchor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated microelectrode array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made filter and amplifiers circuits for the array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition processor 3400a</td>
			<td>Microstar Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a complete data acquisition system with A/D converter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural activity propagation in an unfolded hippocampal preparation with a penetrating micro-electrode array

このプロトコルは、海馬における神経活動をマッピングするための微細加工のアレイと組み合わせる新しいインビトロフラット海馬の準備を調製するための方法を説明します。横断海馬スライス標本は、海馬の電気生理学を研究するための最も一般的な組織調製である。縦海馬スライスはまた、海馬における縦の接続を調べるために開発されました。その厚さは、十分な酸素の拡散を可能にするので、無傷のマウスの海馬はまた、インビトロで維持することができる。組織の一部が欠落している9893のどちらかであるので、これらの3つの調製は、神経伝播への直接アクセスを提供しません。折り畳まれていない無傷の海馬横断し、インビトロで海馬における信号伝搬の全範囲を分析する組織に直接アクセスするための平坦な構成の縦接続の両方を提供する。効果的にtから神経活動を監視するために彼細胞層、カスタムを作製した微小電極アレイ（PMEA）を貫通製折り畳ま海馬に適用する。高さが200μmの64の電極を有するPMEAは、深いマウス海馬の中に神経活動を記録することができます。折り畳ま海馬調製およびPMEAのユニークな組み合わせは、高い信号対雑音比と海馬の二次元CA1-CA3領域における神経活動の伝播速度と方向を研究するための新規のin vitroツールを提供する。

ここで、図面に示されたデータは、4-AP（100μM）を室温で記録チャンバー内の組織のインキュベーションの間に添加するaCSF（25°C）で折り畳ま海馬製剤で記録した。通常、アクティビティが5分以内に開始しますが、高齢の動物からいくつかの海馬組織中でそれは時間がかかることがあります。以前に14,15を報告したようにPMEAで観察4-APによって誘発される神経細胞の発火は同じです。?...

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Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K ビュー.  Case Western Reserve University. 私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。 

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Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

神経科学

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

神経応答を記録し、トレーサーを注入するための覚醒マウスの作製

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...