Siamo grati al Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, e il Dr. Xu Xiangsheng per la loro assistenza di un esperto. Riconosciamo il sostegno del Dr. Ann Kennedy. BCB è stata sostenuta per la formazione di Grant Radiation Biology C5T32CA009677. JFD è stato sostenuto il Premio alla Carriera Burroughs Wellcome per gli scienziati medici (1.006.792). JLB è stato sostenuto in merito alla concessione melari (5 R25 CA140116-03). Si desidera ringraziare il Dott. Steve Hahn cui incoraggiamento e il sostegno ha contribuito a rendere la nostra ricerca possibile. Vorremmo anche ringraziare l&#39;Università della Pennsylvania Nano-Bio Interface Center (NBIC) e il Dr. Dennis Discher per incoraggiamento e utili commenti. Riconosciamo Small Animal Imaging Facility (SAIF) presso l&#39;Università della Pennsylvania per l&#39;utilizzo delle loro strutture di base MRI e ottico / bioluminescenza. Queste tecniche sono state sviluppate nell&#39;ambito di progetti che sono stati finanziati dal National Institutes of Health (RC1 CA145075 e K08 NS076548-01).

A. pre-operatoria del tumore Preparazione cellulare <ol><li> Trasdurre cellule di glioblastoma multiforme U251 con un vettore di espressione lentivirali (pGreenFire, Sistema Biosciences) per esprimere stabilmente il gene della luciferasi lucciola. </li><li> Queste cellule sono state coltivate in 10 ml di completa modifica Dulbecco di mezzo di Eagle (DMEM), che consiste in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% di amminoacidi non essenziali in una beuta T75 coltura tissutale incubando 5% di C0 2 e 37 ° C. </li><li> Effettuare coltura cellulare standard, iniziando con lavaggio delle cellule con tampone fosfato salino (PBS) seguita da trypsinizing. </li><li> Estinguere la tripsina con DMEM completo, trasferire la soluzione in un matraccio da 50 ml e determinare la concentrazione cellulare usando il contatore Coulter. </li><li> Centrifugare le cellule raccolte in DMEM completo per 3 min a circa 3000 giri al minuto. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare dif media lasciando solo un pellet di cellule sul fondo del pallone da 50 ml. </li><li> Lavorando rapidamente per evitare che le cellule si secchi, risospendere le cellule in un volume di DMEM completo fresco per ottenere la concentrazione desiderata di 50.000 cellule / microlitro e trasferimento in una fiala da 2 ml sterile posti su ghiaccio. </li><li> Celle sul ghiaccio vanno brevemente in agitazione su un livello basso ogni ~ 20 minuti per evitare l&#39;adesione cellulare. Le celle possono essere tranquillamente utilizzato per implantologia intracranici fino a due ore dopo il posizionamento sul ghiaccio. </li></ol> B. Impianto Xenograft ortotopico <ol><li> Pesare nude atimico nCr mouse (nu / nu) per stabilire una, linea di base pre-impianto peso. Noi di solito selezionare topi 6-10 settimane di età con pesi tra 17 e 24 grammi. </li><li> 1 ora prima dell&#39;impianto, pre-medicare il mouse con 5 mg / kg della non-steroidei farmaci anti-infiammatori meloxicam per via sottocutanea come trattamento post-operatorio dolore e l&#39;infiammazione. </li><li> Anesthetize l&#39;animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina miscela ad una dose di 140 mg / kg e 10 mg / kg rispettivamente. </li><li> Verificare che il mouse sia sufficientemente anestetizzato valutando risposta spontanea dell&#39;animale ad un pizzico punta. Se l&#39;animale risponde al pizzico punta, ritardare la procedura fino a quando l&#39;anestesia può avere effetto o prendere in considerazione l&#39;iniezione di anestesia supplementare (&lt;25% del valore originale). </li><li> Preparare il mouse anestetizzato per il posizionamento in digitale Stoelting Solo per piattaforma mouse stereotassica (Stoelting Inc.) agganciando incisivi del mouse nella barra morso della restrainer muso e stringendo il morsetto naso sul muso, garantendo nel contempo che la testa del mouse si trova su un piano di livello. </li><li> Trasferire il mouse trattenuto alla piattaforma stereotassica Stoelting, regolando il posizionamento dell&#39;animale in modo che le punte delle barre orecchio sono all&#39;estremità caudale del canale uditivo. Una volta che l&#39;animale cranio-caudale per-posizionamento è adjusted, fissare la barra morso al telaio stereotassico. Il mouse deve essere appoggiato su una piastra riscaldante ditta plastica (Harvard Apparatus) fissato con nastro alla piattaforma Stoelting per fornire un feedback controllato regolazione della temperatura durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Regolare l&#39;altezza delle barre orecchio come necessario e poi avanzare le barre orecchio nella porzione caudale del canale uditivo, garantendo loro in modo tale che la testa del mouse è in un piano di livello e immobilizzato su tocco di un dito. Monitorare attentamente per eventuali segni di distress respiratorio dopo il posizionamento delle barre orecchio. Allentare e riposizionare se l&#39;animale è in difficoltà. </li><li> Inserire la punta lubrificata di una sonda di temperatura rettale collegato al TCAT-2DF termoregolatore (Apparato Harvard) per monitorare la temperatura dell&#39;animale e per fornire controllo in retroazione alla piastra riscaldante posizionata sotto il mouse per mantenere la temperatura corporea dell&#39;animale a 36 ° C durante la procedura. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per gli occhi di Prevent essiccazione. </li><li> Applicare la soluzione betadine alla parte superiore della testa del mouse per disinfettare il sito di incisione, avendo cura di evitare gli occhi. </li><li> Eseguire un pizzico punta a confermare il mouse è inconscio, fornendo una piccola quantità di ketamina supplementari / xilazina (&lt;25% della dose iniziale), se necessario. </li><li> Pulire la punta mm 0,45 bava (Stoelting) attaccato al trapano (Foredom Microdrill) con un tampone imbevuto di alcool e poi sterilizzare la punta da trapano in una bolla di vetro sterilizzatore (germinator 500, CellPoint scientifico) per 15 secondi, immergendo solo la punta nel Lo sterilizzatore perline. </li><li> Usando un bisturi sterile, fare una incisione 0,75 centimetri longitudinalmente a metà del cuoio capelluto si estende dal livello degli occhi caudalmente. Confermare la visualizzazione del bregma. </li><li> Fissare il supporto punta alla piattaforma Stoelting e inserire un trapano (Foredom Microdrill) con un trapano punta 0,45 mm Fresa (Stoelting) nel supporto trapano, fissandolo in posizione. </li><li> Posizionare la punta esattamente sul tegli bregma e poi zero il x, y, z coordinate del display stereotassico digitale. Spostare la punta del trapano ad un millimetro posizione 2 e 1,5 mm posteriore al bregma laterale nell&#39;emisfero cerebrale destro e trapano nel cranio dell&#39;animale con il trapano Foredom, perforando solo l&#39;osso. Un tampone di cotone sterile può essere utilizzato per ritrarre delicatamente i bordi dell&#39;incisione per facilitare la visualizzazione del cranio. </li><li> Rimuovere il trapano e la punta titolare dalla piattaforma stereotassica. </li><li> Fissare la Nanomite iniettore pompa a siringa (Apparato Harvard) alla piattaforma stereotassica. </li><li> Rimuovere le cellule dal ghiaccio e sia vortice delicatamente il flaconcino contenente le cellule tumorali con brevi impulsi o picchietti leggermente la fiala per risospendere le cellule. Disegna il 7 microlitri della sospensione cellulare attraverso un calibro 30 1 &quot;lungo ago smusso piatto collegato a una siringa da 10 microlitri (Hamilton siringa). Evitare grosse bolle d&#39;aria nella siringa. Assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria nel iniziale 6 ml di liquido which sarà il volume totale iniettato nel topo. Piccole bolle d&#39;aria nel restante 1 ml sono di alcuna preoccupazione. Evitare la ripetizione di draw-up della sospensione, se possibile, per ridurre al minimo i danni alle cellule. </li><li> Posizionare la siringa caricata nell&#39;iniettore siringa. Utilizzando un tampone di alcool, rimuovere il fluido sospensione cellulare che appare sulla punta dell&#39;ago per evitare la contaminazione del sito di incisione con cellule tumorali che possono causare tumore in crescita nello spazio extracranica. </li><li> Impostare la pompa iniettore per fornire 6,0 microlitri a una velocità di 0,5 microlitri / min. Il 1 ml di sospensione cellulare rimanente nella siringa dopo l&#39;impianto assicura che le bolle d&#39;aria che spesso raccolgono nella siringa non sono iniettato nell&#39;animale. L&#39;iniezione di bolle d&#39;aria potrebbe risultare in un embolia gassosa mortale. </li><li> Far avanzare l&#39;ago della siringa nel foro cranico mantenere la perpendicolare ago (90 gradi) al cranio. Una volta che l&#39;ago ha attraversato il cranio, a zero il coordinAtes sul display stereotassico digitale e poi lentamente avanzare la punta dell&#39;ago per un periodo di 4 min fino a raggiungere una profondità di 2,5 mm. L&#39;ago passa attraverso la corteccia e porzioni dell&#39;ippocampo posteriore. L&#39;x, y, z coordinate per impianto stereotassico stati scelti per generare un tumore posizionato lateralmente all&#39;interno dell&#39;emisfero cerebrale evitando lesioni alle strutture cerebrali critiche come il talamo e la vicinanza ai ventricoli riducendo così la probabilità di semina del liquido cerebrospinale con cellule tumorali che possono dar luogo a indesiderabili tumori spinali. Una posizione posteriore rispetto al bregma è stato selezionato per ridurre la probabilità di un grande, tumore localmente avanzato ulcerante nell&#39;orbita. Pausa con l&#39;ago in profondità per 2 minuti e quindi avviare l&#39;impianto di cellule. </li><li> Durante l&#39;impianto, asciugare il cranio ripetutamente con una lancia microchirurgica spugna per rimuovere qualsiasi tumore fluido contenente eventualmente ricadere su foro cranico duranteimpianto. Evitare di interrompere l&#39;ago con la spugna microchirurgico. La rimozione di questo fluido dovrebbe ridurre il rischio di tumore cresce nello spazio extracranica. </li><li> Dopo l&#39;iniezione è terminata, lasciare l&#39;ago nel cervello per circa 2 min e quindi estrarre lentamente l&#39;ago in un periodo di 3-4 min. </li><li> Allentare le barre per le orecchie e muso dispositivo di immobilizzazione e rimuovere il mouse dall&#39;apparecchio stereotassica. </li><li> Chiudere il foro cranico nel cranio con la cera ossea sterile depositato da sfregamento cera avanti e indietro attraverso il buco bava dalla fine di legno di una sterile con punta di cotone applicatore. Continuare ad applicare cera ossea finché il foro è completamente sigillato e la cera ossea sigillare il foro cranico è a filo con il cranio adiacente. </li><li> Re-approssimativi i bordi della incisione con tamponi di cotone sterili e applicare la colla veterinaria tessuto per sigillare la ferita, avendo cura di evitare l&#39;esposizione colla occhi dell&#39;animale. </li><li> Infine, posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento impostato a 37 °C finché l&#39;animale recupera coscienza. Trasferire l&#39;animale alla sua gabbia originale una volta che il mouse è vigile e reattivo. </li></ol> C. Bioluminescent Imaging (BLI) per monitorare la crescita del tumore e la risposta alla terapia Brevi istruzioni seguire per l&#39;imaging bioluminescente. <ol><li> Anestetizzare topi precedentemente impiantati con tumore in una camera con 2% di isoflurano e ossigeno. </li><li> Mentre i topi vengono anestetizzati, li iniettare per via sottocutanea o intraperitoneale con 60 pl di D-luciferina sale di potassio diluito in PBS ad una concentrazione di 50 mg / ml. </li><li> Accendere il flusso di anestesia per i coni d&#39;ogiva nello scanner di imaging bioluminescente e trasferire rapidamente i topi allo scanner mettere il muso nei coni naso. </li><li> Posizionare divisori neri tra i topi di limitare l&#39;emorragia del segnale bioluminescente da un tumore con elevata intensità di segnale di un tumore adiacente con segnale molto più basso. </li><li> Utilizzoil software di immagine vivente, fare frequenti esposizioni di serie per una durata totale di fino a 30 minuti dopo l&#39;iniezione di D-luciferina. Siamo favorevoli impostare il tempo di esposizione su &quot;Auto&quot; per limitare il rischio di una immagine sotto o sovraesposizione. Nessuna singola esposizione deve essere&gt; 5 min. </li><li> Eseguire l&#39;imaging bioluminescente ripetere ad intervalli appropriati. Serial immagini settimanale è una scelta ragionevole per molti esperimenti longitudinali testare la risposta al trattamento. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, utilizzare il programma software Image Living analizzare tumori disegnando una regione di interesse (ROI) intorno a ogni tumore in ogni immagine acquisita durante la sessione di imaging bioluminescente. Applicare una seconda, più piccola regione di interesse per il fianco inferiore di ciascun topo in ogni immagine come sfondo regione di interesse per correggere il segnale bioluminescente del tumore in base al grado di intensità del segnale bioluminescente sfondo. Noi preferiamo utilizzare l&#39;impostazione &quot;Radiance&quot;, piuttosto che &quot;Conti&quot; come l&#39;uscitavalori per il segnale bioluminescente. </li><li> Esporta i risultati del ROI in Excel e di determinare il massimo valore di background-adjusted segnale bioluminescente per ogni mouse. </li><li> Ripetere l&#39;imaging bioluminescente come indicato per il monitoraggio seriale di crescita tumorale. Nei nostri esperimenti, abbiamo eseguire settimanale BLI. Noi preferiamo la determinazione del segnale massimo BLI per una sessione di imaging ottenuto prendendo esposizioni frequenti più di 5 - 30 min dopo l&#39;iniezione di D-luciferina. </li></ol> D. Rappresentante Risultati Questa tecnica di impianto stereotassico è associato un successo tumore-take tasso di 90-100% e con bassa mortalità perioperatoria che è di solito inferiore al 5%. Il rischio di effetti collaterali indesiderati è bassa anche con questa tecnica, compresi complicanze come semina del midollo spinale da cellule tumorali impiantate nei ventricoli, o extracranica crescita tumorale sia da semina di incisione con cellule tumorali o chiusura inadeguata del foro cranico unllowing tumore intracranico per espandere attraverso l&#39;apertura nel cranio. Analisi ex vivo di xenotrapianti di tumori attesi dimostrato aree di ipossia, aumento di espressione di VEGF, e necrosi. Microscopia a fluorescenza per la proteina fluorescente verde (GFP) stabilmente espressa dalla nostra linea cellulare GBM rivelato la natura infiltrativa di queste xenotrapianti. La Figura 1 mostra i risultati di un tipico impianto stereotassico successo di cellule GBM nel cervello di un topo. Si tratta di una pesata in T2 scansione MRI del cervello di un topo cervello eseguita con un magnete 9.4 Tesla 21 giorni dopo l&#39;impianto con la tecnica qui descritta. Figura 1 mostra un singolo fuoco di tumore nell&#39;emisfero destro (sagomato in rosa) di misura 19 mm 3 che localizza alle coordinate precise del sito di impianto. La Figura 2 mostra i risultati di imaging bioluminescente usando il tecn<html> iques descritto qui per un gruppo di 10 topi con tumori stereotassica impiantati che sono stati stratificati in modo uniforme sulla base di massima intensità del segnale bioluminescente a ricevere irradiazione cranica (4 Gy x 4 frazioni giornaliere) o nessun trattamento. In questo esperimento, l&#39;imaging bioluminescente mostra che la radioterapia inibisce la proliferazione dei tumori impiantati, causando alcun aumento del segnale rilevato bioluminescente, mentre il segnale aumenta sostanzialmente in mock-irradiati tumori di controllo, dovuti alla proliferazione incontrollata delle cellule tumorali. Figura 1 (Video). Sezioni coronali risonanza magnetica di un cervello di topo contenente un U251 tumore glioblastoma multiforme con sagoma del volume del tumore (in rosa). La scansione è stata effettuata utilizzando un protocollo di spin echo T2 pesata su uno scanner 9.4 Tesla. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Clicca qui per visualizzare filmati</a> . re 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. 10 topi con tumori glioblastoma multiforme stereotassica impiantati sono stati trattati con radioterapia esterna a 16 Gy in 4 frazioni o nessun trattamento. I topi sono stati ripresi con imaging bioluminescente prima del trattamento e settimanale dopo l&#39;inizio del trattamento. Il grafico presenta bioluminescenza relativa calcolata come mediana fold change in cui è definito fold change come il rapporto tra valore massimo corrente BLI al valore pre-trattamento massimo BLI.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft:+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy.">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di impianto stereotassico di cellule tumorali nei topi descritti nel presente documento genera riproducibile tumori che ragionevolmente ricapitolano il modello infiltrativa e rapida crescita del glioblastoma multiforme clinica 2, 6-8. Questa tecnica è particolarmente adatto per esperimenti stratificando topi uniformemente a diversi gruppi di trattamento dove i tumori riproducibili di dimensioni comparabili e proprietà biologiche e in specifiche sedi anatomiche sono desiderabili. L&#39;impianto ste...

<table border="1"><tbody><tr><td> Descrizione </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Digitale Solo per mouse strumento stereotassico </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> Piattaforma stereotassica per l&#39;impianto del mouse </td></tr><tr><td> Ketamina / xilazina </td><td></td><td></td><td> Anestesia iniettabile </td></tr><tr><td> Puralube Pomata Vet (oftalmica) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> Per prevenire l&#39;essiccazione degli occhi del topo </td></tr><tr><td> forare supporto per la piattaforma stereotassica </td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td> Micromotore Trapano elettrico </td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td> Per la foratura attraverso il cranio </td></tr><tr><td> 0,45 millimetri carburo di punta </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi di cotone sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> Perle di vetro a secco sterilizzatore (germinator 500) </td><td> Braintree scientifico </td><td> GER-5287 </td><td> Per sterilizzare gli strumenti chirurgici di metallo </td></tr><tr><td> Mouse sonda rettale </td><td> Braintree scientifico </td><td> RET-3-ISO </td><td> Compatibile con il regolatore di temperatura </td></tr><tr><td> Centralina di temperatura (TCAT-2DF) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727561 </td><td> Regolatore di temperatura per mantenere la temperatura dell&#39;animale durante l&#39;intervento chirurgico </td></tr><tr><td> Piastra riscaldante Piccolo </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727617 </td><td> Per l&#39;uso con il regolatore di temperatura di riscaldamento del mouse durante l&#39;intervento chirurgico. La piastra di riscaldamento si inserisce sotto il mouse sulla piattaforma stereotassica. </td></tr><tr><td> Bisturi monouso </td><td> BD Bard-Parker </td><td> 2015-11 </td><td> # 10 bisturi </td></tr><tr><td> 10 microlitri siringa </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td> Per l&#39;iniezione delle cellule tumorali </td></tr><tr><td> 30 aghi calibro, 1 &quot;di lunghezza, con punta piana </td><td> Hamilton </td><td> Vario </td><td> Deve essere compatibile con la siringa 10 pl </td></tr><tr><td> Nanomite programmabile pompa siringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 704507 </td><td> Digital siringa motorizzata iniettore per il dispositivo stereotassico </td></tr><tr><td> Cellulosa spugne sterili lancia chirurgiche </td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td> Per asciugare il campo operatorio </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> Per sigillare il foro cranico </td></tr><tr><td> Tissumend II tessuto adesivo sintetico assorbibile </td><td> Veterinary Laboratories Prodotti </td><td> 3002931 </td><td> Per sigillare l&#39;incisione </td></tr><tr><td> Pompa acqua calda con il rilievo di riscaldamento </td><td> Gaymar </td><td> TP-650 </td><td> Topi scalda in periodo post-operatorio </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> Caliper Life Science </td><td></td><td> Bioluminescent imager </td></tr><tr><td> D-Luciferin sale di potassio </td><td> Oro Biotecnologie </td><td> FORTUNA-1 </td><td> Luciferina per l&#39;imaging bioluminescente </td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

Il glioblastoma multiforme (GBM) è un alto grado cancro al cervello primario con una sopravvivenza mediana di soli 14,6 mesi negli esseri umani nonostante norma tri-modalità di trattamento costituito da resezione chirurgica, post-operatorio radioterapia e temozolomide chemioterapia 1. Nuovi approcci terapeutici sono chiaramente necessari per migliorare la sopravvivenza dei pazienti e la qualità della vita. Lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci sarebbe aiutato da modelli animali di GBM che ricapitolare malattia umana consente ancora di imaging di serie per monitorare la crescita del tumore e la risposta al trattamento. In questo articolo, descriviamo la nostra tecnica per l&#39;impianto stereotassico precisa di cellule bio-GBM stampabili cancro nel cervello di topi nudi con conseguente xenotrapianti tumorali che ricapitolano principali caratteristiche cliniche della GBM 2. Questo metodo produce tumori che sono riproducibili e sono situati in sedi anatomiche precise, consentendo imaging in vivo bioluminescente di monitorare in serie intraxenotrapianto crescita cranica e la risposta ai trattamenti 3-5. Questo metodo è anche ben tollerato dagli animali con bassa morbilità e la mortalità perioperatoria.

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l&#39;impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali successiva<em&gt; In vivo</em&gt; Immagini per monitorare la crescita e la risposta al trattamento degli xenotrapianti risultanti.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.5K Views.  University of Pennsylvania. Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l'impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali successiva In vivo Immagini per monitorare la crescita e la risposta al trattamento degli xenotrapianti risultanti.

Video: Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...