我々は、技術的なサポートのために、J.とJ. Cappellani秋に感謝します。この作品は、米国国立がん研究所（U01 CA141451）、スターがんコンソーシアム、治療のためのスーザンG. Komen、乳がん、MEに乳癌に対するマンハセット女性連合と戦うためにロングアイランド2日で歩くと、からの資金によってサポートされていました議会監督乳がん研究プログラム、米国からESNESNに対する事前博士フェローシップはまた、生物科学のワトソン·スクール·オブ·レスリーC.クイック、ウィリアム·ランドルフ·ハースト財団フェローシップの受賞者です。 HAAは、ノルウェーの研究評議会（160698/V40及び151882）、および南東部地域保健機関（2007060）からの資金によって支えられている。

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. 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著者らは、開示する利害の対立がありません。全ての動物実験は、動物実験委員会の承認されたプロトコールに従って行った。

in vivoでの全身療法に対する腫瘍の応答は、微小環境は急性期反応と再発5の両方に影響を与えるように、in vitroで癌細胞のものと大幅に異なる可能性があります。 生体内での化学療法抵抗性経路における explicatingへの最大の障害の一つは、がん細胞とその微小環境との相互作用の複雑さである。具体的には、固形腫瘍は、がんや抗がん治療中に起こる細胞死の間質細胞、一つの成分の摂動、バランスを開発しているので、組織の組織に劇的な効果をもたらすことができます。 ここで提供される生体内イメージング技術は、抗がん剤による治療中に生きている、麻酔したマウスの腫瘍内の癌細胞間質の相互作用の直接可視化することができます。我々は（17を参照相対限られた侵入深さを持って回転するディスク共焦点顕微鏡を使用</）&gt;（商標）が、我々の手術や標識技術は、顕微鏡、他のタイプでも使用できます。これらの実験から取得されたムービーは、蛍光強度の変化（ 例えば、細胞死の標識された人口や誘導の浸透のために）、細胞運動、注射剤の分布（血管漏出を追跡する場合など ）、共同を含むプロセスを追跡するために使用することができます蛍光シグナル5,12,17,20の局在。 我々6時間以上にわたって日常的にイメージしたマウスと、18時間以上のイメージングを行った。これは、これらを長時間連続して麻酔下でマウスを維持する必要があります。適切な麻酔で、我々の動物の90％以上が6時間を生き残るため、そして約80％が18時間かけて生き残る。長期的な麻酔を行う方法の詳細については、以前に19が発表されている。我々の経験では、5つの要因が重要である：uは、生理的血中酸素飽和度レベルを維持し、脱水を避け、低体温症を避けるイソフルラン用加湿キャリアガスを歌い、彼らは痛みの兆しを見せないものに麻酔の最下位レベルに動物を保ちます。体温を維持するために、我々は（38℃）加熱された毛布の下にマウスを保つ。脱水症状を避けるために、我々は全体のイメージング手順を通して生理食塩水の ipの少量を注入する。生理的血中酸素飽和度レベルを維持するために、我々はキャリアガス中の酸素21％（というより一般的に使用される100％）で始まります。時間を実験に - - これは、私たちはマウスの場合、吸入酸素濃度を増加させることができる血中酸素飽和度の低下を示しています。我々の経験では、そのような時間（30-40％へなど）で吸入酸素濃度を増加させることはほぼ必ず追加のイメージングの時間を可能にする動物を安定します。麻酔の最適レベルは1から1.5パーセントイソフルランと400-450/minの60-65/minとパルスレートの呼吸率の結果で達成ほとんどのマウス用です。私たちのイメージング実験では、主にトランスジェニックマウスモデルを使用し腫瘍が単一の撮像セッション中に複数のx、yの位置に並列に腫瘍の進行の異なる段階で複数の病変のイメージングを可能にする、多発性であるでs（MMTV-PyMTとC3 [1]-タグ）。これは、ステージ依存治療応答を特定することを目的とした実験に関してマウス·ツー·マウス変動に関する懸念を減少させ、イメージングに必要な動物の数を減らすことができます。 MMTV-PyMTモデル（および他の自発的ながんモデル）に比べて生体内イメージング中に行うことができる腫瘍病変の病理学的病期分類が異なっているが、生体内イメージング中に認識され、あまり詳細なことができるプログレッシブ病理組織段階を経る組織切片5,17。がん細胞は、通常、進行した腫瘍から分離されるとは対照的に、移植モデルは、最高の後期段階の腫瘍を反映する傾向がある。このようなモデルは、このように、腫瘍間質を勉強するより適している様々な段階の間に、これらの相互作用の違いよりも後期の腫瘍の相互作用。 我々はどのように治療することにより誘導される細胞死した後に発生するイメージの核構造変化の例を示す。抗がん治療の非存在下では、この標識戦略が代わりに解明、その場で画像の細胞分裂に使用されるかもしれません、例えば、どのように細胞増殖および休眠性は微小環境に影響されます。将来的には、ミトコンドリアの成分の蛍光標識は、アポトーシス細胞死中に発生する画像ミトコンドリアの変化にそれが可能になるかもしれません。 このプロトコルでは、我々はまた、示されているどのようにイメージ療法後の癌細胞の免疫細胞の相互作用をしますが、他の微小環境の成分の例はまた、可視化して画像化することができる。ストローマコンポーネントの既存のトランスジェニックレポーターライン（ 例えば 。、FSP1-EGFP 17αSMA-RFP 21、COL1A1-EGの線維芽細胞のものが含まれFP 21）または血管系の細胞（ 例えば、Tie2シグナル-GFP 22; VEGF-GFP 23）。 生体内イメージングは生体内化学療法後の投与で発生する相互作用およびプロセスをリアルタイムに可視化することができます。現在利用可能な技術では、我々は治療反応にどのように影響するかを骨髄細胞理解する上で主要な進歩を遂げている、腫瘍微小環境は非常に複雑であるため、しかし、主要な進歩はまだ環境媒介薬剤耐性の基礎をなす過程に機構的に掘り下げて調査を開始するために必要とされる。それでも必要な最も重要な進歩の一つは、特定の細胞集団のためのより良いマーカーの同定である。良いマーカーの重要性はよく乳房腫瘍の微小環境、線維芽細胞や免疫細胞の最も顕著な間質細胞成分の2で示されている。 α-平滑筋アクチン（αSMA）が頻繁に識別するために使用され線維芽細胞が、タンパク質はまた、血管平滑筋細胞と筋上皮細胞24で表される。 αSMA-GFPレポーターマウスが存在するものの、このように、特定の細胞型を決定することは、生体内イメージング実験の間に、次であることは困難である。同様に、c-fmsのプロモーター下で発現など、EGFPのような単一の蛍光マーカーは、多くの場合、免疫細胞の複数の亜集団12,17を識別します。一つは理想的に特定の細胞型を同定するために単一のマーカーを使用したいと思いますが、このように、基礎生物学の複雑さは、このアプローチを使用する場合の主要な課題となっています。 この問題に対する一つの部分的な解決策は、さらに同じ蛍光レポーターを発現する細胞の亜集団を区別するために、注射ラベルを使用することです。例えば、蛍光デキストランは、マクロファージによって取り込まれるとc-FMS-EGFPおよびFSP1-EGFPトランスジェニックレポーターマウスでラベル付けされ、マクロファージの集団を標識することができる<sup&gt; 17。蛍光プローブに結合した抗体はまた、特定の集団を（C-FMS-EGFPレポーター17で標識した骨髄細胞のGR1陽性人口など ）を識別するために使用されている。 理由やその方法、腫瘍は、動物の大規模コホートを必要とする様々な時点で採取した組織から派生投与された治療、または組織学的シリーズへの対応について少しメカニズムに関する情報を提供するキャリパーを測定することにより生成された腫瘍の応答曲線とは異なり、私たちの技術は、直接的、定量化可能な情報を提供します細胞死のダイナミクスにと小さなコホートにおける癌細胞と間質細胞の相互作用について。したがって、ここで報告された手順を使用することの利点は、それがリアルタイムで無傷腫瘍微小環境のコンテキスト内で薬剤応答に動的な情報を提供することである。このような情報は、治療応答5を駆動基礎プロセス重要な洞察につながることができます&lt;/&gt;（商標）。

腫瘍の成長1のための適切な環境を維持するために支援する癌細胞と間質成分（細胞および非細胞の両方）：固形腫瘍は大きく二つの区画で構成されています。これらの間質成分は乳房2-5のものを含む癌の多くの種類の開発、進行、および転移に重要な役割を果たしています。間質環境はまた、治療応答2,4,5に影響を与えます 。このように、がん細胞は無傷微小環境のコンテキスト内で、従来と新しい治療法にどのように反応するかを決定することは、がんの生物学の理解を促進し、現在の治療戦略を改善するために重要である。さらに、癌細胞間質の相互作用は、治療の投与後にどのように変化するかを定義することは、腫瘍再発の生物学を理解するために重要です。 器官型共培養システムは、腫瘍間質の相互作用を研究するために有用であった<s6&gt;までが、それは現在利用可能な方法が正常に免疫細胞の血管機能及び募集に関し、特に、in vitroで無傷の腫瘍微小環境を再現できないことは明らかである。実際、in vitroで観察される治療に対する癌細胞の応答は、しばしば微小環境が損なわれていない5、 インビボにおいて観察されたものとは大きく異なっている。したがって、腫瘍間質の相互作用と治療反応に与える影響を研究するためのin vivoモデルでより良い臨床的に関連する機構7を反映しているかもしれない 。 in vivoでの抗癌治療への応答を研究するための主な手段は、腫瘍の大きさと処理された動物または患者由来組織の組織学的評価の測定をしてきた。しかし、過去20年間の顕微鏡と蛍光レポーターの進歩は、細胞間および細胞内プロセスの可視化を有効にしているライブ、麻酔動物では、高解像度（生体内イメージング）8時。これらの生体顕微鏡技術は、空間的および時間的に携帯とサブ携帯解像度8,9で腫瘍間質の相互作用の in vivo動態の解剖のために特に有益であることが証明された。 生体内イメージングによって解明されたプロセスは、抗腫瘍T細胞の細胞毒性10,11、T細胞および骨髄細胞12、治療の13以下のコラーゲン組成と組織の変化のダイナミクス、マクロファージ依存性癌細胞の脈管内への侵入および転移との間の相互作用を含む14、および血管透過性15。 生体内イメージングのための3つの主要な要件があります。これらは、適切な準備と露出イメージングのための組織の、関心の組織成分の蛍光標識し、ペアになって顕微鏡カメラsを含む16枚の画像を取得することができるystem。これらの要件に対処するために使用される最も一般的な方法は次のとおりです。1）異所性製剤（ 例 、耳や目の軌道の接種）、恒久的なイメージングウィンドウ、または体外製剤（ 例 、背部皮膚フラップ）、2）トランスジェニック蛍光レポーターとラベル組織成分に蛍光注射剤、3）多光子共焦点顕微鏡システムは、それぞれ9、光電子増倍管または電荷結合素子（CCD）カメラとペア。我々は、蛍光レポーターをコードする導入遺伝子を発現する麻酔動物でのイメージングのための鼠径部乳腺を公開するための外科的に準備された皮弁モデルを使用します。画像は4レーザースピニングディスク共焦点顕微鏡システム17とペア激化CCD（ICCD）カメラを使用して12から40時間の期間にわたって得られる。この方法でイメージングは、私たちはステージ依存CH、in vivoでの薬物分布のように、このようなプロセスを学ぶことができましたemotherapeutic応答、化学療法誘発性細胞死のタイプ、および骨髄細胞の挙動5。 我々は、抗がん治療と乳癌のマウスモデルにおける腫瘍間質の相互作用に対する癌細胞応答の生体内イメージングのためのプロトコルを提供する。このプロトコルは、単一の撮像セッションで40時間までの期間のトランスジェニックおよび移植両モデルにおけるトランスジェニックおよび注射用蛍光ラベルの多種多様な癌細胞と間質成分の両方の行動や死を追跡するために使用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> MMTV-PyMTマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3（1） - タグマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFPマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFPマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1×PBS </td><td>自社製</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MDデキストラン、フルオレセイン結合</td><td>インビトロジェン</td><td> D-7137 </td><td> 1×PBS中に希釈し1 mg / mlの;のdH 2 O（4 mg / mlで、-20℃で保存）で再構成</td></tr><tr><td> 10 kDのデキストラン、のAlexa Fluor 647共役</td><td&gt;インビトロジェン</td><td> D-22914 </td><td> 1×PBS中に希釈し1 mg / mlの;のdH 2 O（4 mg / mlで、-20℃で保存）で再構成</td></tr><tr><td>ドキソルビシン塩酸塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 44583 </td><td> 4℃のdH 2 O、ストア内の再構成℃、1×PBS中に希釈</td></tr><tr><td> Isothesia（イソフルラン） </td><td>バトラーアニマルヘルスサプライ</td><td> 029450 </td><td> 250ミリリットル</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>インビトロジェン</td><td> P3566 </td><td> 1 mg / mlで、希釈1時15分1×PBS中</td></tr><tr><td>窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> 18G×1½ &quot;レギュラーベベル針</td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td>ヴァーレ·ラボは、UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td>オープンソースソフトウェア</td></tr><tr><td>アルコール消毒綿</td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70％イソプロピルアルコールスワブ</td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>分子イメージング製品、（株） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コー​​ニング</td><td> 2940-245 </td><td>第1½、24x50ミリメートル、70％イソプロパノールで消毒ワイプ</td></tr><tr><td> Curityガーゼのスポンジ（無菌） </td><td>ケンドール</td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>コー​​ニング</td><td> 2948-75x25 </td><td>予備洗浄、予備洗浄されていない場合、70％イソプロパノールで消毒ワイプ</td></tr><tr><td>硬化細かいハサミ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14090から11 </td><td> 2ペア、ステンレス鋼、鋭い鋭い先端、ストレートチップ、26ミリメートルのカッティングエッジは、11 cmの長さ</td></tr><tr><td>熱せられた毛布</td><td> Gaymarインダストリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18000から45 </td><td>使用前に30分程度の電源をオンにして&gt; 200でツールを殺菌℃で30秒間</td></tr><tr><td> Imaris </td><td>ビットプレン</td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td>クレイジーグルー</td><td>エルマーの製品</td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td>研究所テープ（½ &quot;） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>実験室でのテープ（1 &quot;） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓋に発泡スチロール出荷クーラー</td><td></td><td></td><td>これは、外科的なプ​​ラットフォームとして使用されます</td></tr><tr><td>ミクロ解剖鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2の歯は、わずかなカーブ、0.8ミリメートルチップ幅、4 &quot;長さ</td></tr><tr><td>ミクロ解剖鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td>鋸歯、わずかなカーブ、0.8ミリメートルチップ幅、4 &quot;長</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td>スピニングディスク共焦点は、XYZピエゾステージ、epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td>顕微鏡ステージインサート</td><td>適用された科学計測</td><td></td><td>カスタムには、2つの円形のイメージングポートと、作製した</td></tr><tr><td> MouseOxオキシメータ、ソフトウェア、およびセンサー</td><td> STARRライフサイエンス</td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td>ナルゲンスーパーVersi-ドライラボsoakers </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 74218から00 </td><td>外科プラットフォームを裏打ちするために四分のにカット</td></tr><tr><td>噴霧器</td><td>ソルターラボ</td><td> 8901 </td><td>ガスを加湿するために使用される;肺組織の炎症を防ぐ</td></tr><tr><td>スリップオンチップ使い捨てツベルクリンシリンジ（1ミリリットル） </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo翼の輸液セット</td><td>テルモ</td><td> SV-23BLK </td><td> 23G X¾ &quot;超細い針、12&quot;のチューブ</td></tr><tr><td>ベタジンスプレー</td><td>パデューファーマ</td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

腫瘍微小環境は、腫瘍の開始、進行、転移、抗癌治療に対する反応において重要な役割を果たしている。三次元共培養システムは頻繁に薬剤応答における役割を含め、腫瘍間質の相互作用を解明するために使用されます。しかし、無傷の微小環境における生体内で発生する相互作用の多くは完全にin vitroでの設定で、これらの中で複製することはできません。このように、リアルタイムでこれらのプロセスの直接可視化は、治療に対する腫瘍の応答を理解し、がん細胞およびこれらの応答に影響を与えることができる間質間の相互作用を同定する際に重要なツールとなっている。ここでは、直接薬物分布、癌細胞応答および乳癌モデルにおける全身療法の投与後、腫瘍間質相互作用の変化を観察するために生きている、麻酔したマウスのスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用するための方法を提供する。我々はlabeliするための手順について説明しngの異なる腫瘍成分、治療応答を観察するための動物の治療、最大40時間までのイメージングのための腫瘍組織を露出させるための外科的処置。このプロトコルから得られた結果は、薬剤浸潤、癌細胞死と間質細胞遊走などの過程を画像解析ソフトを用いて評価することができるタイムラプス映画、です。

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Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

我々は、抗癌治療への応答のイメージングのための方法を説明<em生体内で&gt;</em&gt;と単一細胞の解像度で。

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

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24.6K ビュー.  Watson School of Biological Sciences. 我々は、抗癌治療への応答のイメージングのための方法を説明と単一細胞の解像度で。

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

医学

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

腫瘍の4DライブセルイメージングのためのMAMEモデル：微小環境の相互作用に影響を与える悪性進行

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...