著者は、有益な議論は、この固相合成技術とマシューFLパーカーの初期の開発のための博士ザカリーZ.ブラウン、ジェニファーAllevaに感謝します。この作業はセファロン社でサポートされている国防脅威削減局（DOD-DTRA）（HDTRA1-09-1-0009）とホルストWitzelフェローシップ賞でサポートされています

1。セットアップ<ol><li>固相合成用の反応セットアップは、 図1に示すように、真空下で囲まれたフィルタリングフラスコにポリプロピレンチューブを介して接続されているポリプロピレンフィルターカートリッジやガラス反応器である。反応は、マグネチックスターラーバーまたは反応器を通して窒素をバブリングすることにより混合することができます。 </li><li>それは反応容器を不活性雰囲気下で含まれるようになり、密閉容器から試薬の除去を可能にするように乾燥管とオイルバブラーを装備し、アルゴンシリンダーに接続されたガスマニホールドも推奨されます。 </li><li>すべての操作はドラフト内で実行され、適切な個人用保護具（安全メガネ、白衣とニトリル手袋）が必要です。 </li></ol> 2。樹脂上にビス-ペプチド最初のロード<ol><li> 8 mLの反応容器にHMBA-AM樹脂（0.88ミリモル/ gローディング、100μmol）を114 mgを秤量し、マグネチックスターラーバーを追加します。目の上にキャップをeは、ラバーセプタムで容器と、少なくとも5分間アルゴンでチューブをパージします。 </li><li>その間に、 図3（586.63グラム/モル、2EQ）と1の59.2 mgの化合物1の117.3 mgを量る- （メシチレン-2 -スルホニル）-3 -ニトロ-1,2,4 -トリアゾール（MSNT、296.0 g /モル、2EQ）を15mL使い捨て遠心チューブに2 mLの無水ジクロロメタン（DCM）に溶解する。完全に溶解するまで溶液と混合する1 - メチルイミダゾール（NMI、80.81 mLの/モル、3eq）24μLを追加します。 </li><li>シリンジを介して反応容器に活性化されたソリューションを転送し、アルゴンで一晩（〜10時間）の下で撹拌することができます。 </li><li>セプタムを取り外し、反応混合物を排出する。 DCM（5x）を、ジメチルホルムアミド（DMF）（5x）を有する樹脂を洗浄します。樹脂の負荷の程度を評価するために、セクション10.1に記載されている &quot;メチルレッドテスト&quot;を実行します。樹脂は、メチルレッドテスト中に赤色のままならば、2.2および2.3が繰り返されるべきで繰り返します。負のメチルレッド試験を示す黄色の色が、好まれます。しかし、残りの水酸基は、次のステップ、わずかに陽性の結果（光オレンジ色の樹脂の色）でキャップされるので、許容できるかもしれません。 </li></ol> 3。上限まず、ビス-ペプチドとの同時樹脂の脱保護<ol><li>反応容器に、DCMの1 mLを追加し、30秒（バブリングが発生した）上で酢酸を滴下し、1 mLの33％臭化水素を追加し、15分間撹拌することができます。 DCM（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄し、もう一度手順を繰り返します。 </li><li>その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。再度DCM（5倍）およびDMF（5x）をDMFで洗浄におけるN、N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の5％（v / v）の溶液で2回洗浄することにより樹脂を中和する。 &quot;メチルレッドテスト&quot;およびセクション10.1と10.2で説明した &quot;クロラニルテスト&quot;を実行します。結果は、クロラニルテストのためのメチルレッドテストと正のために負でなければなりません。 </li></ol> 4。カップリングのBoc / tBuので保護された官能ビスアミない酸ません<ol><li>無水DCMで3回洗浄することにより樹脂を含有する反応容器に不活性雰囲気を再導入は、中隔およびアルゴン線を接続します。パージおよび無水DCM 1-2 mLを加え、アルゴンラインバブラーが上昇し始めるまで、容器を排出し、30秒間撹拌させることで容器を洗浄する。少なくとももう一度この操作を行う。 </li><li>炎のDMF乾燥テスト：0.15 Mの官能ビス-アミノ酸（3eq）と2:1 DCM 2ml中の1 - ヒドロキシ-7 - azabenzotriazole（HOAT、136.11グラム/モル、18eq）の245 mgの溶液を調製アルゴン雰囲気下でチューブ。ジイソプロピル47μL（DIC、156.6 mLの/モル、3eq）を追加し、90分間かき混ぜる。 </li><li>樹脂に666μLの無水DMFで35μLDIPEA（174.19 / mLのモル、2EQ）を追加し、5分間攪拌することができます。 </li><li>シリンジを介して反応容器に予め活性化されたビスアミノ酸溶液を移し、一晩撹拌することができます。 </li><li>反応混合物を排出し、下にある間、無水DCMで2回洗浄する<html>アルゴン。 </li><li>ジケトピペラジンの閉鎖を促進するため、1:1 DCM 4mLのHOAT（136.11グラム/モル、10eq）とDIC（156.6 / mLのモル、10eq）の0.25 M溶液を追加します。DMFを、アルゴン下で撹拌することができます1時間インキュベートした。 </li><li>セプタムを取り外し、反応混合物を排出する。 DCM（5×）およびDMF（5x）を有する樹脂を洗浄します。必要な場合は、セクション10.2で説明した &quot;クロラニルテスト&quot;を実行します。 </li></ol> 5。のBoc / tBuの保護官能ビス-アミノ酸の脱保護<ol><li>反応容器にトリイソプロピルシラン（TIPS）、それが1時間撹拌することができます：95:5 trifluororacetic酢酸（TFA）の溶液2mLを追加します。ドレインしてから、もう一度処理を繰り返すDCM（5倍）で約30秒間樹脂を洗浄する。 </li><li>その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。その後DCM（5x）を、再びDMFを（5x）を洗い、DMF中のDIPEAの5％（v / v）の溶液で2回洗浄することにより樹脂を中和する。必要な場合は、セクション10.2で説明した &quot;クロラニルテスト&quot;を実行します。 </li></ol>必要に応じて、LE &quot;&gt; 6。ビスペプチド標的を合成するには、手順4と5を繰り返します。 7。ビスペプチドProlidineエンドを官能<ol><li>成長ビス-ペプチドのprolidine終わりはジケトピペラジンを介して独立にまたは一緒にアシル化することができます。また、この終わりは遊離アミノ酸がもたらさ、後者を切断される、保護されたままにすることができます。必要に応じて、カップリング効率を評価するためにセクション10.2で説明した &quot;クロラニルテスト&quot;を実行します。 </li></ol> 8。ビス-ペプチドの第四紀の終わりのFmocおよびアシル基の脱保護<ol><li> DMF中20％ピペリジン2mLの溶液を添加し、反応を20分間混合される。 DMF（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄してもう一度プロセスを繰り返します。 </li><li>その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。 </li><li> MG 2 114とN-メチルピロリドンの2 mLの（NMP）中のアミノ酸（3eq）の0.15 M溶液を調製し - （7 - アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1 - イル）-1,1,3,3 - テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート<html> （HATU、380.2グラム/モル、3eq）と104.5μLDIPEA（174.19 / mLのモル、6eq）とよく混ぜる。反応容器に追加し、6時間撹拌することができます。 </li><li>その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。 </li></ol> 9。樹脂からアミノ酸を樹脂に結合し、切断からBoc基を除去する<ol><li>反応容器にDCM溶液と30分間撹拌することができます：1:1 TFAの2 mLを追加します。 DCM（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄し、もう一度手順を繰り返します。 </li><li>その後DCM（5x）をDMF（5x）を30秒間樹脂を洗浄し、水気を切る。 </li><li>無水DMF中10％DIPEAの溶液2mLを追加し、24〜48時間を攪拌することができます。 </li><li>事前に計量丸底フラスコに反応混合物を収集します。 LC-MSバイアル​​にTHF 450μLに、この液30μLを転送し、分析のために提出してください。 DMFの追加のアリコートで樹脂を洗浄し、丸底フラスコに集めるには、その後、減圧下で溶媒を除去。 </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10。ビス-ペプチドの精製<ol><li>ジメチルスルホキシドの最小量（100から250μL）にビスペプチド原油溶解し、HPLCバイアルインサートに転送します。エクステラ準備MS C185μmの7.8x150 mmカラムと100μL注入ループを搭載したセミprepitive HPLCシステム（ヒューレット·パッカード1100シリーズ）のオートサンプラに挿入配置します。 </li><li> 274 nmでモニターしながら30分かけて0.1％ギ酸を水で5〜95％アセトニトリルのグラジエントプログラムを使用してサンプルの複数の50μLの注入を実行します。事前に計量使い捨て遠心管製品のピークを収集し、凍結乾燥機を使用して乾燥した凍結。 注意は、一般に観察され、分析LCMSに比べてピークの保持時間のわずかなシフトとして、最初の実行で撮影する必要があります。 </li></ol> 11。評価手法<ol><li>メチルレッドテスト7：使い捨てピペットを介して乾燥した樹脂の約1 mgを削除して、4 mLの反応容器にすすいでください。 500μL無水DCM中の20 mgのメチルレッド、50μLN、N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、及び5 mgの4 - ジメチルアミノピリジン（DMAP）の溶液を追加し、5〜10分間攪拌することができます。ドレインと濾液が無色になるまで、DCMで樹脂を洗浄します。積極的な指示は、オレンジや赤の残りの樹脂ビーズです。 </li><li>クロラニル試験12：乾燥樹脂の約1 mg使い捨てピペットを介して小さなバイアルに転送。 0.8mmのDMF溶液中でのクロラニルとDMF溶液中で2％のアセトアルデヒドの両方の3滴を加え、5〜10分間室温で放置します。肯定的な表示が紫色/青オフ樹脂ビーズです。 </li><li> ACTIVATIONトラップTEST：合成中に活性化合物は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ピロリジンの50μLを含むバイアルに活性化液の少量（5〜10μL）を転送することによって評価することができる。数秒間、手で混ぜる（solutiのテトラヒドロフラン（THF）450μLで希釈し、LC-MS分析のために提出して）黄色になるはずです。 </li><li>分析LC-MS：最終的な製品および活性中間体は、ウォーターズエクステラMS C183.5μmで4.6ミリメートル×150 mmのカラムと水で5〜95％アセトニトリルのグラジエントシステムを搭載したHP 1200シリーズLC-MSシステムを用いて評価することができる30分以上0.1％ギ酸を含む。 </li></ol> 12。代表的な結果原油（ 図4）、精製（ 図5）LCMSトレースの両方の例が用意されています。約10％の精製収率は、上記の方法を使用して期待されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> 図1固相合成のための実験のセットアップの図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> 図2。ビス-アミノ酸/ビス - ペプチドの関連名称。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> 図3全体の合成スキームは<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> 図4a 274 nmの粗生成物のHPLCトレース。 <img alt="図4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> 図4b。粗生成物のピークのMSスペクトル。 <img alt="図5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> 図5a。274 nmでの製品の精製HPLCトレース。 <img alt="図5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> 精製された生産の図5b。MSスペクトルトンピーク。

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利害の衝突が宣言されません。

本明細書に示される合成法は、一般的な固相ペプチド合成技術を用いてビス-アミノ酸ビルディングブロックからの官能ビス - ペプチドの合成方法を提供する。トランス-4 -ヒドロキシプロリン3からこれらの&quot;PRO4&quot;ビルディング·ブロックのモノマー合成は非常にスケーラブルであり、成功した600ミリモル（234グラム）スケール（未発表）でヒダントインステージに完了しました。一度モノマーが手にあり、固相技術の使用は、反応ワークアップおよび中間精製の ​​必要性を排除することによって我々の現在の液相の手法4より、ビス-ペプチド合成のより迅速な方法を提供します。 固相合成における主要な課題は中間体が単離されていませんので、解決合成の進歩と問題を診断しています。これは、遊離アミン（カイザーテスト10）またはフリーhydroxどうかを確認するには、それらを含む多くの発色テストの開発をリードしているyls（メチルレッド試験7）樹脂に公開されています。残念ながら、一般的に使用されるカイザーテスト10級炭素に結合した第二級アミンまたはアミンのほぼ排他的使用のために私たちの固相合成で一般的に適用されません。 HMBA樹脂上の評価のための他のオプションはヒドラジン11、UV / VIS 1,11によって監視される定量的なFmocを切断し、着信活性化合物を捕捉し、分析などの求核試薬を使用してテスト切断が含まれています。 固相合成におけるもう一つ見落とさ問題は、オペレータが必要とする合成ステップの反復的な性質である。これは心であると手動で固相ペプチド合成を行う際に、著者らは強く、スプレッドシートやチェックリストの使用をお勧めします。 一般的なα-アミノ酸に比べて固相合成用ビスペプチドの使用に難しく、立体ホアヒンのために多くの困難なカップリングの可能性が含まれていますdrance、樹脂上のジケトピペラジンの閉鎖の必要性、および同時脱保護カルボニル（Boc / tBuの、カルボ/ TBU）。別難しく、より従来の手段に比べ、この &quot;セーフティキャッチ&quot;の方法を用いて樹脂から定量的な放出を達成することにある。念頭に置いて、これらの要因と、それはこの方法のさらなる最適化が達成され、現在の努力がここで紹介する方法を改善するために我々のグループで進行中であることができる非常に可能性があります。

<table border="1"><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> HMBAチャアム樹脂</td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 336092 </td><td>毒性、腐食性</td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td>発癌性</td></tr><tr><td>無水DCM </td><td>アクロス</td><td> 34846 </td><td>発癌性</td></tr><tr><td>酢酸の33％臭化水素</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 248630 </td><td>コアー、毒性osive、ヒュームオープン時</td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 387649 </td><td>腐食性、毒性、可燃性</td></tr><tr><td> DMF </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC27960 </td><td>有毒で、可燃性</td></tr><tr><td>無水DMF </td><td>アクロス</td><td> 34843 </td><td>有毒で、可燃性</td></tr><tr><td> HOAT </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td>アクロス</td><td> BP590 </td><td>腐食性、毒性、可燃性</td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T6508 </td><td>毒性、腐食性</td></tr><tr><td> TIPS </td><td>アクロス</td><td> 21492 </td><td>有毒で、可燃性</td></tr><tr><td>ピペリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 104094 </td><td>腐食性、毒性、可燃性</td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt;有毒</td></tr><tr><td> NMP </td><td>アクロス</td><td> 36438 </td><td>毒性</td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td>毒性</td></tr><tr><td>メチルレッド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 401757 </td><td>成形可燃性、毒性、過</td></tr><tr><td>ピロリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P73803 </td><td>腐食性、毒性、可燃性</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャー</td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS反応容器</td><td>グレース</td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td>アジレント</td><td> 1200シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>セミプレップLC </td><td>ヒューレット·パッカード</td><td> 1100シリーズ</td><td></td></tr><tR&gt; <td>凍結乾燥機</td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td>ビュッヒ</td><td> R-210シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>アルゴン</td><td> Airgasの</td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

1962年に、RBメリフィールドは、効率的にペプチドを合成するための新しいルートとして固相ペプチド合成を使用して、最初の手順を公開しました。このテクニックは、すぐに時間と労力の両方で、その液相の前任者よりも有利を証明した。固体支持体の性質に関する改善、保護グループが採用し、過去50年間にわたって採用カップリング法は、メリフィールドの元のシステムの有用性を増加している。今日は、Bocベースの保護およびベース/求核開裂可能な樹脂戦略またはFmocベースの保護と酸性の開裂可能な樹脂の戦略の使用は、最も一般的なペプチド1の合成に使用され、RCシェパードによって開拓された。 メリフィールドの固体サポート戦略に触発され、我々は、本明細書中に記載されている官能基、ビス-ペプチド2のアセンブリののBoc / tert-ブチル固相合成の戦略を開発しました。トンと比較して固相合成の使用O液相方法論は、メリフィールド1で説明したように時間と労力の両方にのみ有利で ​​はなく、また、ビス-ペプチドライブラリーの合成でより容易にすることができます。ここで示している合成は、2段階のジケトピペラジン形成による樹脂からビス - ペプチドの官能を解放するためのメカニズムを &quot;安全キャッチ&quot;を使用して、最終的な開裂段を内蔵しています。 ビスペプチドは、タイプと立体モノマー単位の、各モノマーの間の接続によって制御され、予測可能で設計可能な方法で機能を配置することができます - ビス - アミノ酸の剛性、スピロラダーオリゴマーである。各ビス-アミノ酸は2つのアミノ酸（α-アミンとカルボン酸）3,4が含まれている立体化学的に純粋な、環状の足場です。当研究室では、現在、触媒、タンパク質 - タンパク質相互作用とnを含む幅広い分野にわたる機能のビスペプチドの可能性を調査しているanomaterials。

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

HMBA樹脂から切断手順を &quot;安全キャッチ&quot;を利用し、官能ビスペプチド三量​​体の効率的な固相ペプチド合成が記載されている。

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を &quot;安全キャッチ&quot;を使用して

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K ビュー.  Temple University. HMBA樹脂から切断手順を "安全キャッチ"を利用し、官能ビスペプチド三量​​体の効率的な固相ペプチド合成が記載されている。

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

パラレル合成と自動液体ハンドリングを使用してUgi反応の最適化

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

生物学

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2&#039;-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...