この新しい組織クリアリングプロトコルは、既存の技術を改善し、より正確なin vivoで心臓内の特定の細胞タイプと傷害条件下でのそれらの行動を見ることができるようにする。このプロトコルは、迅速かつかなり簡単です。細胞または組織染色を必要とせずに、バックグラウンド組織自動蛍光からの干渉を最小限に抑え、マルカ蛍光の維持を可能にする。
実験マウスの腹側表面を洗浄するために70%エタノール浸漬ガーゼパッドを使用して開始します。手術用ハサミを使用して、xiphoidプロセスの約3メートル下に約3メートル下の3センチメートルの横切り切開を行い、マウスを腹部からxiphoidプロセスにデグローブして、下層の腹壁組織から皮膚を分離する。皮下腹壁組織で2センチメートルの横切り切開を行い、xiphoidプロセスより3センチメートル下に、リブケージを通して正中線の上にこの切開から垂直カットを行います。
胸を後ろに固定して心臓を露出します。そして、優れた静脈と大オルタに冷たいPBSを注入するために27ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用してください。すべての血液が心臓から洗い流されたら、10ミリリットルの冷たい4%PFAを上の大静脈と大オルタに送り込み、固定プロセスを開始する。
固定剤のすべてが点滅したら、心臓を切除し、まっすぐなブレードメスを使用して心房、右心室、中隔および左心室を分離します。心臓を冷たい4%PFAの15ミリリットルの円錐形チューブに入れ、ヌテットターで摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、0.25%の写真のイニシエーター溶液を作りたてのヒドロゲル溶液に加え、心臓をハイドロゲルに移します。
物理的な乱れなしに摂氏4度で一晩インキュベーションのためにホイルで円錐管を包みます。翌朝、37度のビードバスで2.5時間チューブを温め、鉗子を使用して心臓をPBSの15ミリリットルチューブに慎重に移します。PBSで3回、1回、1回、1回、37度で1回、ヌテエーターで心臓を洗浄し、心臓をアクティブな電気泳動機のバスケットに移します。
蓋を所定の位置に固定し、アクティブな電気泳動チャンバの貯蔵所に電気泳動クリア液を充填します。チャンバーがいっぱいになったら、溶液中のバスケットを沈め、電気泳動機のキャップを所定の位置に締め付けます。その後、1.5アンペアと摂氏37度で1.5時間電気泳動機を実行します。
電気泳動後、心臓を視覚的に調べて、不透明な組織が残らないようにします。クリアした心臓を15ミリリットル2回、1回、新鮮なPBSで1回、ヌテット器で洗浄1回37度で洗浄します。ヘムオート蛍光を低減させる脱色剤に心臓を沈める前に。
48時間後、示されているようにPBSで心臓を3回洗浄し、イメージング前に48時間、作りたてのRIMSで心臓を平衡化します。クリアされた心臓の3Dイメージングの場合、まず、3Dプリントされた底部の底部に真空グリースの薄い層を配置し、画像化されるサンプルと同じ高さ。RIMS でリザーバを充填し、すべての気泡を除去するピペットチップを使用します。
慎重に左心室壁を上に向けてRIMSに心臓を置き、溶液に泡が導入されていないのに注意してください。真空グリースを使用して、3Dプリントされたトップリザーバーピースの底面にガラスカバースリップを取り付け、上部のリザーバカバースリップを底の貯水池に下ろし、気泡を避けるように注意してください。その後、グリセロールで上部の貯水池を充填します。
共焦点顕微鏡を使用して、クリアされた心臓を画像化します。3D画像と洗練された心臓組織のクリアリングを組み合わせることで、心臓線維芽細胞の高度な詳細な可視化が可能になります。このイメージング技術を用いて、線維芽細胞は密に詰め込まれ、傷つけていない心臓に紡錘状の形態を有することが観察される。
虚血再灌流傷害後、傷害後最初の3日間は虚血領域で心臓線維芽細胞の喪失が見られる。7日目と14日目までに、線維芽細胞は、負傷した組織領域を再建するために移動または増殖した。28日目までに、心臓の負傷した領域を取り巻く心臓線維芽細胞集団は最大の密度にある。
心筋梗塞損傷の1日半後、負傷した左心室内に残っている線維芽細胞はほとんど残っていません。しかし、3日目までに線維芽細胞は膨張し、左心室のほとんどに存在する。虚血性手術とは対照的に、数週間にわたってアンジオテンシン2とフェノールフリンの注入は、心臓組織の喪失および壁の薄化をもたらさない。
代わりに、線維芽細胞は、組織クリアリングプロトコルに精製されたを使用する場合に見られるように、右手のらせん収縮パターンの軸に沿って整列する。また、アンジオテンシン2とフェノールフリン治療後、虚血再プロフュージョンおよび心筋梗塞損傷のモデルで観察される紡錘形状とは対照的に、線維芽細胞は小さく丸みを帯び現れる。電気泳動クリアは、特に損傷プロトコルを受けた心臓で作業する場合は慎重に行う必要があります。
このプロトコルは、心臓線維芽細胞が生体内の傷害にどのように反応するかを評価するために使用することができる。異なる蛍光マーカーは、心臓が細胞レベルでの傷害にどのように反応するかを理解するためにも使用できます。
