Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (R01-HL095828 di Kay MW).

1. Impostazione per lo Studio <ol><li> Preparare quattro litri di modifica Krebs-Henseleit soluzione di 16 (in mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, CaCl 2 2,00, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, glucosio 10,0, 2,00 NaPyruvate, e 20,0 mg / L albumina ). La soluzione deve essere preparata come prossimità dell&#39;inizio dell&#39;esperimento possibile. Il pH deve essere regolato a 7,4 dopo la filtrazione sterile (dimensione dei pori: 22 micron, Corning). Osmolalità soluzione deve essere tra 275 e 295 mOsm / kg. </li><li> Sciacquare tutti i tubi e le camere di cuore del sistema di lavoro con acqua purificata. Eseguire pompe finché tutta l&#39;acqua è stata rimossa dal sistema. </li><li> Aggiungi filtri a membrana di cellulosa (dimensione dei pori: 5 micron, ADVANTEC) in linea con ciascuna delle pompe di perfusione (pompa di perfusione Langendorff, a sinistra della pompa perfusione cardiaca, e proprio la pompa perfusione cardiaca). </li><li> Eseguire una calibrazione a due punti (0 e 60 mmHg) per ogni sensore di pressione. </li><li>Accendere i bagni. Un bagno riscaldato acqua circolante (Cole Palmer) viene utilizzato per riscaldare l&#39;acqua con camicia tubi e scambiatori di calore. Perfusato viene pre-riscaldato in un bagno di acqua separata (Oakton Instruments). Entrambi i bagni sono impostati per mantenere una temperatura soluzione di 37 ° C. </li><li> Accendere le pompe per far circolare il perfusato in un anello chiuso. Perfusato passa attraverso ossigenatori in microfibra (hemofilters) gasati con il 95% O 2 e 5% CO 2 a 80 kPa. Perfusato ossigenata scorre poi attraverso scambiatori di calore per mantenere ad una temperatura di 37 ° C prima di entrare nella cannule cuore. </li></ol> 2. Cuore Escissione <ol><li> Iniziare impostando il sistema di cuore al lavoro per operare in modo costante Langendorff pressione. Impostare la pressione del blocco aortica entro l&#39;intervallo da 50 a 60 mmHg. </li><li> Anestetizzare la coniglio con una iniezione intramuscolare di ketamina (44 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg). Dopo il coniglio è sedato, pentobarbital (50 mg / Kg) ed eparina (2000 U) viene iniettata per via endovenosa attraverso la vena marginale dell&#39;orecchio o la vena safena laterale all&#39;interno dell&#39;arto posteriore. </li><li> Quando il coniglio è completamente non-reattivo, come determinato da una mancanza di dolore riflesso, la cavità toracica viene aperto rapidamente, il pericardio è tagliato, l&#39;aorta viene bloccato, e il cuore e polmoni sono rimossi. A questo punto i polmoni dovrebbe essere lasciata attaccata al cuore per aiutare a isolare le vene polmonari. </li><li> Isolare e incannulare l&#39;aorta con una cannula diametro di 5 mm che è attaccato ad una siringa riempita con 60 ml perfusato e 200 unità di eparina. Fissare l&#39;aorta alla cannula con sutura di seta zero dimensioni e lentamente premere il siringa per lavare il cuore di sangue. </li></ol> 3. Cannulazione biventricolare <ol><li> Collegare il cuore al blocco aortica del sistema cardiaco di lavoro. Impedire all&#39;aria di entrare nella aorta, che può causare emboli coronarica. Si consiglia di allegare la cannula al bl aorticaOCK avvicinando il connettore aortica ad un angolo obliquo e consentendo perfusato a gocciolare dolcemente dal connettore nella cannula mentre è installata. </li><li> Mentre il cuore è perfuso in modo costante Langendorff pressione, togliere il grasso e tessuto connettivo e individuare i vasi seguenti: inferiore e vena cava superiore, vena azygos, arteria polmonare, vene polmonari. </li><li> Legare la vena cava superiore. Tagliare l&#39;arteria polmonare appena al di sotto dove si dirama verso le arterie polmonari destra e sinistra. </li><li> Raggruppare tutti i vasi rimanenti (delle vene polmonari) tra il cuore ei polmoni e legare il tutto con una sutura. Rimuovere i polmoni. </li><li> Praticare un piccolo foro in un angolo dell&#39;appendice atriale sinistra. Assicurarsi che il LA è pieno di perfusato. Incannulare la LA assicurando nel contempo che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserito. Suturare la cannula per l&#39;appendice LA. </li><li> Accendere la pompa del lato sinistro (pompa # 2) per fornire un flusso di tha lasciato atrio. Impostare la pressione precarico tra 2-6 mmHg e regolare ± 2 mmHg, come determinato dalla dilatazione atriale. </li><li> Accendere il cuore a cuore la modalità di lavoro disattivando la pompa Langendorff (pompa # 1). </li><li> Momentaneamente diminuire la pressione aortica a 10 mmHg e poi lentamente per aumentare nell&#39;intervallo da 80 a 100 mmHg. Questo permetterà la valvola aortica per aprire e funzionare come sarebbe in condizioni fisiologiche normali. La pressione finale postcarico dipenderà la contrattilità del LV. Esso dovrebbe essere impostato ad un valore che è circa 20 mmHg inferiore alla pressione di picco LV. </li><li> LV portata cardiaca può essere determinata misurando la portata del perfusato all&#39;uscita dal blocco aortica (ml / min). Gittata cardiaca normale è tra 14,77 e 16,43 mL / min per 100 g di peso corporeo 17 e medie 340 mL / min per un coniglio 2,2 kg. Pressione aortica dovrebbe assomigliare il segnale di pressione illustrato in Figura 1. </li><li> Cannulare il RA attraverso l&#39;inferior vena cava. Verificare che il RA e la cannula vengano riempiti con perfusato e inserire la cannula evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per la vena. </li><li> Accendere la pompa del lato destro (pompa # 3) per fornire un flusso all&#39;atrio destro. Impostare la pressione di circa 3 mmHg. </li><li> Assicurarsi che il RV è pieno di perfusato e incannulare l&#39;arteria polmonare. Assicurarsi che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserita per evitare bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per l&#39;arteria polmonare. </li></ol> 4. Acquisizione del segnale: Pressioni, potenziali d&#39;azione monofasici e fNADH <ol><li> Una volta cannulazione biventricolare è completa, cura di inserire il catetere trasduttore di pressione (Millar) nell&#39;aorta attraverso la cannula aorta. Delicatamente navigare oltre la valvola aortica e nella LV. Monitorare il segnale di pressione LV per garantire il corretto posizionamento della punta del catetere. Un esempio di pressione LV è mostratoin figura 1. </li><li> Premere delicatamente il potenziale d&#39;azione monofasico elettrodo contro epicardio ventricolare. Monitorare il segnale per ottenere adeguate misure di potenziale d&#39;azione. Artefatto lieve movimento del segnale è normale. </li><li> Posizionare un elettrodo bipolare stimolo sulla atrio destro a passeggiare per il cuore. Nel nostro protocollo, cuori erano in ritmo la durata del ciclo tra i 300 e 150 msec, corrispondenti a 200 e 400 bpm, rispettivamente. </li><li> Misurare la temperatura della superficie epicardica LV. Se lo studio richiede che la temperatura è mantenuta a 37 ° C poi posizionare il cuore all&#39;interno di una camicia d&#39;acqua della camera cardiaca o immergere il cuore in un bagno superfusate riscaldata per mantenere una temperatura costante in tutto il cuore. </li><li> Posizionare la fotocamera CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixel) e la messa a fuoco in modo tale che un campo appropriato di vista si osserva. La fotocamera è collegata a una workstation e le immagini vengono acquisite a 2 fps utilizzando Andor SOLIS softwari. </li><li> Accendere la luce lampada a mercurio prima dell&#39;inizio di imaging. La luce è diretta attraverso un filtro di eccitazione (350 ± 25 nm, la tecnologia Chroma) e in un breve fibre ottiche (Horiba Jobin Yvon modello 1950-1M) per illuminare la superficie del cuore. L&#39;attenuazione della luce UV attraverso la guida di luce è piccola. Illuminazione UV potrebbero essere forniti anche con un sistema ad alta potenza LED costituito da faretti LED (Mightex PLS-0365-030-S) e un&#39;unità di controllo (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Spegnere la luce della stanza e ridurre al minimo l&#39;illuminazione ambiente. Puntare le boccole della guida di luce (o faretti LED) al centro per rendere uniforme l&#39;illuminazione epicardico. Emissione NADH fluorescenza (fNADH) passa attraverso un filtro per le emissioni (460 ± 20 nm tecnologia Chroma) e viene ripreso dalla telecamera CCD. </li><li> FNADH monitorare i cambiamenti nel tempo, selezionando una regione di interesse utilizzando il software di imaging. Selezionare live-modalità di aggiornamento per monitorare l&#39;intensità media dei pixel all&#39;interno della regione of interesse. </li><li> Il cuore dovrebbe funzionare in modalità biventricolare lavorando per generare pressioni adeguate. livelli fNADH deve essere bassa e stabile sulla superficie epicardica per confermare adeguata perfusione coronarica. A questo punto in studio uno specifico protocollo sperimentale dovrebbe essere attuata per verificare una ipotesi. </li><li> Quando lo studio è completato, togliere il cuore dal sistema e far defluire tutto perfusato. Sciacquare il tubo del sistema e le camere con acqua purificata. Per la manutenzione ordinaria, il sistema deve essere periodicamente risciacquato con una soluzione diluita Mucasol o una soluzione di acqua ossigenata, come necessario. </li></ol> 5. Off-line Elaborazione delle immagini fNADH <ol><li> Un modo per confrontare dataset NADH (fNADH (i, j, t)) tra esperimenti è normalizzare ogni immagine di fluorescenza usando un&#39;immagine di riferimento (fNADH (i, j, t 0)) dal set di dati 9, come mostrato nella seguente equazione . Un altro modo per normalizzare NADH fluorescenza è plasso un piccolo pezzo di vetro uranile nel campo visivo prima dell&#39;esperimento 9, 18, ​​19. Vetro uranile volontà fluorescenza (450 - 550 nm) quando illuminate con luce UV per fornire un segnale che può essere usato come un riferimento stabile. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Risultati rappresentativi Viste anteriore e basale di una preparazione biventricolare coniglio lavoro cardiaco sono illustrati nella Figura 1. Pressione ventricolare sinistra è stata misurata mediante la navigazione di un catetere trasduttore di pressione (Millar SPR-407) oltre la valvola aortica e nel ventricolo sinistro. Pressioni ventricolari aortica, l&#39;arteria polmonare, ea sinistra (LVP) sono mostrati in figura 1C. Diastolica LVP è solitamente tra 0 e 10 mmHg. La pressione minima aortica diastolica è di circa 60 mmHg. Picco sistolico LVP dipende dalla pressione di riempimento (il precarico o la pressione LA) e della contrattilitàe, in modo ottimale, dovrebbe essere tra 80 e 100 mmHg. La pressione aortica massima e LVP dovrebbe strettamente corrispondere, come mostrato nella figura 1C. Potenziali d&#39;azione monofasici (MAP) con una fase di depolarizzazione veloce e una fase di ripolarizzazione, che sono tipici cuore di coniglio sono mostrati nella figura 1D. MAP può essere registrato con relativa facilità da un cuore appaltante ma avrà solitamente artefatto piccolo movimento durante la diastole, come mostrato nella figura 1D. MAP sono utili per verificare il successo trascinamento del cuore (cattura) durante la stimolazione e può anche essere usato per misurare variazioni locali elettrofisiologiche dovute a ischemia o altre perturbazioni acute. Un ECG può anche essere misurata immergendo il cuore in un bagno di superfusate caldo e ponendo un elettrodo in bagno sui lati sinistro e destro del cuore. Un terzo elettrodo indifferente o è posto nel bagno, lontano dal cuore, o è collegato al aorta.Un ECG fornirà informazioni riguardanti il ​​processo di eccitazione globale e ripolarizzazione, che è utile per la valutazione globale funzioni elettriche e per rivelare la presenza di ischemia. fNADH immagini rivela cambiamenti nello stato redox mitocondriale del cuore, che possono essere utilizzati per misurare la progressione spazio-temporale di regioni ischemiche o ipossia. Per questo studio, epicardico fNADH è stata misurata per monitorare i cambiamenti nello stato redox nel corso di tre frequenze di stimolazione alla durata del ciclo (CLS) di 300, 200 e 150 msec. Valori medi fNADH provenienti da una regione di interesse (scatola rossa, figura 2) mostrano che i livelli basali fNADH aumentare la durata del ciclo si accorcia. Quando frequenza di stimolazione è vicino a ritmo sinusale (CL = 300 msec) fNADH livello basale è relativamente costante. Poiché la durata del ciclo si accorcia inferiore a 300 msec, di base fNADH aumentare i livelli, con il maggiore incremento alla minima CL (150 msec). FNADH immagini ad alta risoluzione di tutta la superficie anteriorea 200 e 400 bpm è mostrato in Figura 3. livelli fNADH a 200 bpm erano costanti e spazialmente omogenei. A 400 bpm, i livelli di fNADH aumentato notevolmente in tutta l&#39;epicardio. Significativa eterogeneità spaziale è stata osservata con gli incrementi maggiori si verificano nelle regioni del setto della RV e LV. Il segnale fNADH oscilla con contrazione (artefatti movimento) e la frequenza di oscillazione corrisponde alla frequenza cardiaca (Figura 2). In incannulamento biventricolare, la base del cuore è tenuto da 4 cannule, che aiuta a prevenire il cuore di oscillazione durante la contrazione. Pertanto, ampiezza di oscillazione è sempre inferiore rispetto a qualsiasi arco temporale più lungo (5-10 sec) tendenze fNADH che sono causate da ischemia o ipossia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Pressioni tipiche e potenzialità di azione monofasici da un isolato di lavoro biventricolare rabbit cuore. A. vista basale del cuore che mostra i quattro cannule: 1, aortica, 2, arteria polmonare, 3, atriale sinistra, e 4, atriale destra vista anteriore, B. del cuore che mostra il ventricolo sinistro (LV) e il ventricolo destro. (RV). C. rappresentativi pressioni. Top: pressione ventricolare sinistra (linea continua) e la pressione aortica (linea tratteggiata). In basso: la pressione polmonare. D. potenziali d&#39;azione monofasici rappresentativi. Il segnale è allineato con le pressioni indicate nel pannello di C. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH immagini di un biventricolare lavoro cuore di coniglio isolato. Top: Una vignetta del campo di vista (a sinistra) e tre immagini fNADH vengono visualizzati. Il corrispondente lunghezza del ciclo di stimolazione (CL) è indicata su ogni immagine.La regione di interesse per il segnale fNADH nel pannello inferiore è indicato dal riquadro rosso. La punta dell&#39;elettrodo monofasica potenziale di azione si vede a destra della regione di interesse. Il epicardio era illuminata con la lampada a mercurio e guida di luce, come mostrato nella Figura 5. Solo la superficie epicardica circonda la regione di interesse è stata illuminata basso:. FNADH medio per la regione di interesse indicato dal riquadro rosso nel pannello superiore. Aumenti medi fNADH con la lunghezza di ciclo ridotti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH immagini di tutta la superficie anteriore di un isolato di lavoro biventricolare cuore di coniglio. Il cuore è stato stimolato dalla RA a 200 bpm e 400 bpm. fNADH è stato ripreso (2 fps, 128x128 pixel con una risoluzione di 0,4 mm), mentre illumina l&#39;intera epicardio anteriore con due LED ad alta potenza (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+performance+as+a+function+of+intracellular+oxygen+tension+in+buffer-perfused+hearts.">Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).</li><li>Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+by+nifedipine+in+isolated+working+hearts:+A+comparative+study+on+three+different+types+of+experimental+ischemia.">Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).</li><li>Khatib, S. Y., Boyett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glyburide+(glibenclamide)+on+myocardial+function+in+langendorff+perfused+rabbit+heart+and+on+myocardial+contractility+and+slow+calcium+current+in+guinea-pig+single+myocytes.">Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes.</a> Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).</li><li>Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+albumin+on+the+electrophysiologic+stability+of+isolated+perfused+rabbit+hearts.">Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).</li><li>Combs, C. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il cuore isolato Langendorff perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. È particolarmente utili negli studi di aritmie cardiache, in particolare quelle che utilizzano immagini di fluorescenza potenziale transmembrana 20. Un vantaggio è che l&#39;intero epicardio del cuore isolato può essere osservato 21, 22. Un altro vantaggio è che, in contrasto con sangue, perfusione con una soluzione limpida tampone cristalloide non interferisce con i segnali di fluorescenza. Una limitazione è che la tecnica Langendorff non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che spesso richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Per elevare la rilevanza dei preparativi cuore isolato per studi metabolici, Neely ha introdotto modifiche alla tecnica Langendorff per stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3.Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Il cuore del modello LV di lavoro è superiore al modello Langendorff per le valutazioni funzionali, ma non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare (LV e RV) come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8. A RV caricata correttamente inoltre migliora la funzione del setto diminuendo gradienti di pressione anomale attraverso il setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, pressione media polmonare, la frequenza cardiaca e infarto del miocardio ATP, ei livelli di creatina fosfato per un massimo di 3 ore 8. Biventricolare studi cardiaci di lavoro in genere utilizzano i cuori from piccoli animali quali ratti e conigli, perché la gittata cardiaca e il volume richiesto di perfusato sono molto inferiore a quella dei cuori degli animali più grandi. Tuttavia, biventricolare studi cardiaci di lavoro sono stati eseguiti utilizzando i cuori di suini, canini, e anche esseri umani 23, 24. Il fabbisogno metabolico dei cuori isolati in modo lavorazione biventricolare è notevolmente superiore a quello di perfusione Langendorff. E &#39;importante che la soluzione perfusato fornire abbastanza ossigeno e substrati metabolici per supportare la funzione cardiaca biventricolare. Soluzioni tampone standard cristalloidi, come Krebs-Henseleit 16, 17, 25 o Tyrodes 26, 27, hanno solubilità ossigeno alto come 5,6 mg / L. Quando queste soluzioni sono gasati con CarboGen (una miscela di gas del 95% O 2 e il 5% CO 2) e contiene gli opportuni substrato metabolico (glucosio, destrosio e / o di piruvato di sodio), che siano adatti biventricolare cuori di lavoro batte a normaAl tasso del seno (circa 180 bpm per un coniglio). Aumenta la richiesta metabolica di ritmi veloci e la quantità di ossigeno disciolto in perfusates standard potrebbe non essere sufficiente per supportare pienamente un cuore biventricolare di lavoro che si sta contraendo a tassi elevati. Soluzioni tampone cristalloidi contenenti eritrociti o miste con sangue intero sono stati usati in preparati cardiaci di lavoro per assicurare un&#39;adeguata disponibilità di ossigeno. Studi precedenti hanno dimostrato che l&#39;aggiunta di eritrociti a una soluzione di Krebs-Henseleit un miglioramento della funzione cardiaca di lavoro durante rigorosi protocolli di stimolazione e anche ridotto l&#39;incidenza di fibrillazione ventricolare 16. Una limitazione di utilizzare eritrociti o miscele di sangue intero è che l&#39;emoglobina interferisce con lunghezze d&#39;onda che vengono utilizzati per l&#39;imaging fluorescenza 13. Altri substrati, come albumina, possono anche essere aggiunti perfusato soluzioni per prolungare vitalità cuore e ridurre l&#39;edema 28. Durante l&#39;imaging di fluorescenza l&#39;intensità della luce di eccitazione deve essere elevata e la distribuzione della luce dovrebbe essere uniforme. Realizzare un&#39;illuminazione uniforme non è sempre facile a causa della curvatura della superficie epicardica. Nei nostri studi abbiamo fNADH immagine filtrando la luce (350 ± 25 nm) da una lampada al mercurio. Una biforcato guida ottica viene usato per dirigere la luce UV sulla superficie epicardica. Illuminazione uniforme può essere ottenuto il corretto posizionamento delle due ghiere di uscita. UV sorgenti LED potrebbero anche essere utilizzati, come abbiamo dimostrato nella Figura 3. Sorgenti LED sono relativamente poco costoso in modo più fonti potrebbero essere inserite in un sistema di imaging. I LED possono anche essere attivata e disattivata a tassi elevati di sincronizzare la luce di eccitazione, con acquisizione delle immagini. Photobleaching di NADH deve essere minimizzata 29 riducendo il tempo di illuminazione tessuto. Ciò può essere fatto bicicletta l&#39;illuminazione e spegnimento con un elettroneic otturatore e una lampada o con un sistema di illuminazione a LED ed un controllore. Se l&#39;illuminazione è sincronizzato con il ciclo cardiaco, quindi l&#39;acquisizione di immagini fNADH potrebbe essere limitato diastole, che ridurrebbe manufatto movimento nei segnali di fluorescenza. Trigging illuminazione e l&#39;acquisizione di immagini utilizzando un segnale di pressione, come la pressione LV, sarebbe un modo per fare questo. Nei nostri studi abbiamo osservato che le variazioni fNADH per unità di tempo può essere più di 5 volte superiore a 400 bpm rispetto a 200 bpm. Questo indica che ritmi veloci elevare lo stato redox del cuore. Sia o no questo è causato da ipossia o l&#39;incapacità dei miociti per ossidare NADH a NAD + con sufficiente rapidità per evitare l&#39;accumulo di NADH è ancora una domanda senza risposta. Le prestazioni di un preparato biventricolare cuore di lavoro è condizionato da molti fattori. Uno dei più importanti è quello di impostare adeguate pressioni di precarico e postcarico per imitare il fisiologicocondizioni che sono sotto inchiesta. In particolare, il postcarico LV (pressione aortica) deve essere regolato per rappresentare la pressione sistemica. Se è troppo elevato, il LV non sarà in grado di superare la pressione, con conseguente rigurgito. Pressione troppo bassa avrà effetti negativi sulla perfusione coronarica. La pressione di precarico LV (la pressione atriale sinistra) dovrebbe anche essere regolato per fornire un volume telediastolica che è appropriato per il protocollo sperimentale. fNADH imaging di tessuto vivente è una modalità consolidata di imaging di fluorescenza 13. La sua applicazione al tessuto cardiaco è stato illustrato da Barlow e Chance, quando hanno segnalato aumenti notevoli di fNADH all&#39;interno del tessuto regionale, dopo la legatura ischemico e 14 di un vaso coronarico. Le loro immagini fNADH sono state registrate su pellicola utilizzando una macchina fotografica oscilloscopio Fairchild e flash UV. Coremans et al. estesa, questo concetto utilizzando la fluorescenza / UV quoziente di riflettenze NADH a misurazionee lo stato metabolico del epicardio di Langendorff sangue perfusi cuori di ratto 30. A videofluorimeter è stato utilizzato per l&#39;imaging e dati è stato registrato utilizzando un registratore video. Più tardi, Scholz et al. utilizzato un array di fotodiodi spettrografo e misurare fNADH media da una vasta area del LV. Questo approccio riduce gli effetti di fluorescenza epicardici eterogeneità e le variazioni locali in circolazione mentre rivelare macroscopici legati al lavoro variazioni di fNADH 31. Questo approccio è simile a livelli medi fNADH calcolo per una regione di interesse in tutti i fotogrammi di un set di dati fNADH immagini, come illustrato in figura 2. Come abbiamo presentato in questo articolo, la tecnologia di oggi offre ad alta velocità telecamere CCD e controllo digitale ad alta potenza faretti UV. Queste tecnologie consentono le dinamiche spazio-temporali di fNADH cardiaca e il metabolismo di essere studiato da molte nuove prospettive. Il relativamente basso costo delle ottiche e delle sorgenti luminose rende fNADH immagine di un accessorio utile per sistemi convenzionali cardiaci mappatura ottici. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

Fin dalla sua nascita da Langendorff 1, il cuore isolato perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. Tuttavia, non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Neely modifiche introdotte alla tecnica Langendorff a stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3. Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Questo modello, tuttavia, non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8 </sup&gt;. A RV caricata correttamente diminuisce anche gradienti di pressione anomali attraverso il setto per migliorare la funzione del setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, frequenza cardiaca e del miocardio livelli di ATP per un massimo di 3 ore 8. Studiando gli effetti metabolici di lesione del miocardio, quali ischemia, è spesso necessario per identificare la posizione del tessuto colpito. Ciò può essere fatto di imaging la fluorescenza del NADH (forma ridotta di nicotinammide adenina dinucleotide) 9-11, un coenzima trova in grandi quantità nei mitocondri. NADH fluorescenza (fNADH) che presenta un rapporto vicino lineare inversa con 12 locali concentrazione di ossigeno e fornisce una misura dello stato redox mitocondriale di 13. Imaging fNADH durante condizioni di ipossia e ischemica è stato usato come colorante libero metodo per identificare regioni ipossiche 14, 15 e per monitorare la progressione dicondizioni di ipossia nel tempo 10. L&#39;obiettivo del metodo è di monitorare lo stato redox mitocondriale di biventricolare cuori di lavoro durante protocolli che alterano il metabolismo miociti o indurre ipossia o creare una combinazione dei due. Cuori da conigli bianchi New Zealand stati collegati ad un sistema biventricolare cuore di lavoro (Hugo Sachs Elektronik) e perfusi con modificato Krebs-Henseleit soluzione 16 a 37 ° C. Aortica, LV, arteria polmonare, e la pressione atriale destra e sinistra sono stati registrati. L&#39;attività elettrica è stata misurata usando un elettrodo monofasica potenziale d&#39;azione. Per immagine fNADH, la luce da una lampada a mercurio è stato filtrato (350 ± 25 nm) e utilizzato per illuminare il epicardio. Luce emessa è stata filtrata (460 ± 20 nm) e ripreso con una telecamera CCD. Cambiamenti nella fNADH epicardica biventricolare cuori di lavoro durante frequenze di stimolazione differenti sono presentati. La combinazione del modello cuore e fNADH immaginifornisce un nuovo strumento prezioso e sperimentale per lo studio delle patologie cardiache acute nel contesto di realistici condizioni fisiologiche.

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

L&#39;obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

nadh-fluorescence-imaging-isolated-biventricular-working-rabbit

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K Views.  The George Washington University. L'obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

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Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Ricerca

Medicina

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In vivo imaging dell&#39;angiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart model, have been invaluable tools for studying cardiovascular function and disease1-15. Although the Langendorff heart preparation can be used for any mammalian heart, most studies involving this apparatus use small animal models (e.g., mouse, rat, and rabbit) due to the increased complexity of systems for larger mammals1,3,11. One major difficulty is ensuring a constant coronary perfusion pressure over a range of different heart sizes &#8211; a key component of any experiment utilizing this device1,11. By replacing the classic hydrostatic afterload column with a centrifugal pump, the Langendorff working heart apparatus described below allows for easy adjustment and tight regulation of perfusion pressures, meaning the same set-up can be used for various species or heart sizes. Furthermore, this configuration can also seamlessly switch between constant pressure or constant flow during reperfusion, depending on the user&#8217;s preferences. The open nature of this setup, despite making temperature regulation more difficult than other designs, allows for easy collection of effluent and ventricular pressure-volume data.

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

Un Isolato sistema Cuore di lavoro per i grandi modelli animali

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Affettare e coltivare i cuori di maiale in condizioni fisiologiche

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Metodo semi-minimo invasivo per indurre l'infarto miocardico nei ratti e la valutazione della funzione cardiaca da parte di un sistema cardiaco funzionante isolato

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

Sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...