この作品は、NIH（R01NS064288）とクレイグ·H.ニールセン財団からFZへの補助金によって支えられている。

1。カバーガラス、培養培地、消化酵素の調製<ol><li>の12 mmラウンド第1カバーガラスは、神経細胞の培養に使用されています。カバーガラスは一晩に3回（20分/時間）の蒸留脱イオン水と超音波洗浄、続いて10％塩酸で洗浄されています。きれいにカバースリップは、将来の使用のために70％エタノールに格納されています。各実験前に、カバーガラスは、空気乾燥させ、培養プレートに配置されます。 </li><li>コー​​トに乾燥させたカバーガラスを、100μg/ mlのポリ-D-リジンと10μg/ mlのラミニン実用的なソリューションを含む塗布液の100μlを各カバースリップの上に追加され、培養プレートを37℃のインキュベーターに転送されます。 1〜2時間後、コーティング溶液を除去し、カバースリップは、滅菌1X PBSで3回洗浄されています。 </li><li>培地、最小必須培地（MEM）を調製するが5％ウシ胎児血清（FBS）、1Xペニシリン - ストレプトマイシン溶液（房毛の500台で補足されるLINおよびストレプトマイシン500μg）を、1Xグルタミン-Iサプリメント、および20μM5 - フルオロ-2 - デオキシウリジンおよび20μMウリジン（FDU / R）を含む抗有糸分裂試薬。無血清培地では、FBSが補足B27に置き換えられます。 </li><li>コラゲナーゼは、溶液を1 mg / mlのワーキング濃度を作るためにコラゲナーゼのMEMと粉末を溶解して調製されています。トリプシンでは、1X TrypLE Expressが使用されています。 </li></ol> 2。成体マウスDRGニューロンの解剖と収穫<ol><li> 6安楽死した後 - 10週齢の成体マウスに、背部皮膚を除去し、全脊柱を切った。 1 X PBSに2-3回で削除脊柱を洗浄します。 </li><li>腹側アップ、と解剖プレートに削除脊柱を固定し、慎重に解剖顕微鏡下で感覚神経を露出させる筋肉を削除します。木材レベルでDRGSに接続されている神経が太いと見つけやすいです。したがって、ほとんどの実験のために腰椎のみDRGSは、収穫されます。 </li><li>小さなハサミで中心線に沿って各椎骨を切って、慎重に椎間板を除去します。脊髄を露出するために、各椎骨を分割するために鉗子を使用します。 </li><li>木材DRGSを解剖するには、鉗子でそれぞれの木材の神経を持ち上げると、関連腰椎DRGSを（L1からL6まで）を見つけるために脊髄に向かってトレースします。 </li><li>接続された末梢神経、春のはさみで背腹根から各DRGを切断し、氷上に置いたMEM培地で遠心管に入れて保管してください。必要なときに別の脊髄レベル（ 例えば胸部DRGS）でより多くのDRGSは、同様の方法で切り出しすることができます。 </li></ol> 3。成体マウスDRGニューロンの消化と解離<ol><li>すべての解剖DRGSを収集した後、1 mlのコラゲナーゼ溶液をMEM培地を交換し、90分間37℃で遠心チューブをインキュベートします。 </li><li>ので、500μlの1X TrypLE Expressを使用してコラゲナーゼ溶液を交換する37 lutionとインキュベート°C 15〜20分間。 </li><li> TrypLE Expressソリューションを削除し、3回のために1ミリリットル準備培地（5％FBSを含む）でDRGSを洗う。 </li><li> 600μlの培養液を加え、穏やかに1ミリリットル青を使用して20〜30倍のために組織をひいて粉にするために上下にピペッティングし、ピペットチップは卒業しました。 </li><li>粉砕した後、非解離組織は微量の底に落ち着くと10 mlの滅菌チューブに細胞懸濁液を転送することができます。別の600μlの培養液を追加し、ほとんどの組織が解離されるまで摩手順を繰り返します。得られた細胞懸濁液は神経細胞と非神経細胞の両方が含まれています。ほとんどの場合、6 DRGS（〜5×10 4）からの細胞を1エレクトロポレーション反応に使用されています。 </li></ol> 4。エレクトロポレーションを介した神経細胞の遺伝子操作<ol><li> DNAプラスミド（〜10μgのマウスニューロンAmaxaのヌクレオソリューションを混合することにより、トランスフェクション溶液を調製場合）またはsiRNAオリゴは（〜0.2 nmol）をそれぞれトランスフェクションのために100μlの最終容量を作る。 </li><li>室温で7分間680 rpmで解離した細胞を遠心し、可能な限り上清を捨てる。準備されたトランスフェクション溶液を加え、穏やかに再懸濁細胞に200μlのピペットチップで3〜4回ピペッティングします。 </li><li>エレクトロポレーションキュベットにトランスフェクション溶液と混合した細胞懸濁液を転送しAmaxaのNucleofectorシステムプログラムG-013を用いて細胞をエレクトロポ。 </li><li>エレクトロポレーションした後、直ちにあらかじめ温めておいた（37℃）培養液をキュベットにFBSを含有し、所望の細胞密度でコーティングした培養プレートにすべての溶液（〜600μl）を移すの500μlを添加します。再懸濁および再メッキを必要とする実験では、ニューロンは、高密度（10000から20000細胞/ウェル）でプラスチック製の培養皿上で直接培養する。直接軸索の成長を調べた実験では、ニューロンがメッキONTです。低密度（3000-5000細胞/ウェル）でコーティングしたカバーガラスをO。インキュベーター（37℃、5％CO 2）に培養プレートを配置します。 </li><li>ニューロンは、基板に接続しためっき後四時間、静かに500μlの新鮮予め温めておいた培地で培養培地（Amaxaのヌクレオソリューションを含む）を交換して、追加の文化インキュベーターにプレートを戻す（37°C 、5％CO 2）。 FBSまたは無血清培地を含む培養培地の両方がこのステップで使用することができます。 </li></ol> 5。軸索成長解析のための培養成人DRGニューロン<ol><li> DNAプラスミドでトランスフェクションのニューロンについては、目的遺伝子（ 例えば、EGFP）の発現は、エレクトロポレーション後、数時間、早ければ観察することができます。 siRNAでトランスフェニューロンでは、我々は通常内因性タンパク質の十分な枯渇を可能にするために3-4日を待ちます。培養神経細胞は、直接バリオにおける軸索成長解析のために固定することができます我々の時点（エレクトロポレーション後1-4日）または再懸濁させ、軸索の再成長を分析するために再播種します（下記参照）。 </li><li> RNAiによる機能喪失研究のために、培養神経細胞を再懸濁することができると軸索が標的タンパク質がすでに枯渇されたニューロンから、再成長できるようにするために再播種した。これを行うには、培養皿から接続された神経細胞を再懸濁するために6-10回のために1ミリリットル予め温めておいた新鮮な培地とピペット優しく上下の高密度培養ニューロンの古い培地を交換してください。非神経細胞（ 例えばシュワン細胞）の神経細胞より培養皿にはるかに厳しい添付するので、再懸濁した細胞は、主に神経細胞があります。 </li><li>マイクロチューブに再懸濁した神経細胞を移し、静かに、単一細胞懸濁液中に細胞塊を再解離する10〜15倍をひいて粉にする。 </li><li>低密度（3000-5000細胞/ウェル）および培養で一晩、新しく調製したカバースリップ上に再プレートの再解離ニューロン（16-24時間）。 </li></ol> 6。固定、免疫染色し、蛍光イメージング<ol><li>培地を吸引除去し、室温で15〜20分間細胞を固定し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）（200μl/ウェル）を追加します。固定した細胞は、その後3回の1X PBSで洗浄されています。 </li><li> PBSを吸引除去し、室温で60分間固定ニューロンにブロッキング液（1X PBS中1％ウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100、2.0％正常ヤギ血清）を追加します。 </li><li>ラベルの軸索に、ニューロンは抗ニューロフィラメントまたは抗βIIIチューブリン抗体で免疫染色されている。これを行うには、各カバースリップのためにパラフィルム上で一次抗体溶液（-βIIIチューブリン抗体の1:1200希釈）の30μlドロップを配置します。カバースリップを反転し、室温で60分間一次抗体溶液の上に置きます。 </li><li>元の培養プレートにカバースリップを返し、3回1X PBSで洗い流してください。 </li><li>二次のために同じ手順を繰り返します。tibody。 </li><li> 3回蒸留水でカバーガラスを洗浄し、次にマウントソリューション（ 例えば Gold退色防止を延ばす）でスライドガラス上にカバースリップをマウントします。 </li><li>染色されたニューロンは、デジタルカメラを搭載するすべての蛍光顕微鏡システムで撮像することができます。軸索の長さを測定し、画像解析ソフトウェアで解析されています。 </li></ol> 7。代表的な結果追加されたすべての細胞増殖因子の不在下で、成体のDRGニューロンは通常、最初にメッキした後に軸索を48時間の成長を開始します。軸索は、しばしば分枝状の形態（ 図1）を示しています。対照的に、再メッキのニューロンは、めっき後のわずか数時間の軸索を拡張し、軸索は大幅に削減分岐（ 図2）と伸長を開始します。これらの結果は、再メッキニューロンはエアコン病変の神経細胞と同様の特性を共有することをお勧めします。このアプローチを使用することによって、我々は最近、損失を実行したの機能は、研究in vitroでの大人のDRGニューロンから軸索成長の軸索の再生に関連する転写因子c-Junの役割に調べることができます。結果は（-TARGETplus ON）c-Junの異なる領域を標的と4 ​​つの異なるsiRNAの群のエレクトロポレーションを示した顕著な3日間トランスフェクション（ 図3）9後の成人DRGニューロンにc-Junのタンパク質レベルを低下させた。 9：; c-Junのノックダウンニューロンからニューロンが再メッキと一晩培養し、軸索成長が著しく（262.32±15.69μmの、 図3 SI-c-Junの348.37±16.21ミリメートル制御）減少した。これらの結果は、培養された大人のDRGニューロンは成体ニューロンからの軸索成長を研究するための有用なモデルシステムを提供することを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> 図1成体マウスのDRGニューロンは3日間低密度で培養した。ニューロンは抗で染色した - ＆Bη、IIIチューブリン抗体。ほとんどの軸索は分枝状の形態を示すことに注意してください。スケールバー：125μmである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> 図2。文化の中で3日後にDRGニューロンの再メッキ成体マウス。 （A）大人のDRGニューロンは3日間高い密度で培養した。 （B）再メッキ成人DRGニューロンは一晩のために低密度で培養した。そのほとんどの軸索はほとんど軸索分岐の細長い形態を示して注意してください。スケールバー：B.と125μmのでは250μm <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> 図3。 試験管内で成人DRGニューロンから軸索成長におけるc-Junの役割。 （A）成体マウスにおけるc-Junのウェスタンブロット分析は、c-JunのsiRNAのエレクトロポレーション後のDRGニューロン。その結果、c-Junの著しく低下レベルを示します。 （B）EGFPをトランスフェクションコントロールニューロンは、再メッキ、一晩培養した後、長い軸索を成長した。 （C）のCo-トランスc-JunのsiRNAは、再メッキ、一晩培養後の成人DRGニューロンからEGFP障害軸索の成長クション。赤：TUJ-1染色、緑：EGFP。スケールバー：125μmである。これらの結果はSaijilafuらに公開されている9。

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	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

大人のDRGニューロンはこうして大人の動物では軸索の再生を研究するために有用なシステムを提供し、確実にin vivo及び in vitro における末梢神経損傷後に軸索を再生成します。大人のDRGニューロンのin vitro培養の分子メカニズムを調べるために広く使われている方式になってきているから軸索再生が規制されています。培養成体マウスDRGニューロンの in vitro の</em...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P6407 </td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>インビトロジェン</td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5 - フルオロ-2 - デオキシウリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> F0503 </td></tr><tr><td>ウリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> U3003 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ロシュ社</td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLEエクスプレス</td><td>インビトロジェン</td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122</td></tr><tr><td>グルタミン-I（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ（＃1） </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 72196から12 </td></tr><tr><td> 24ウェル細胞培養プレート</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 35から3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td>メディアテック</td><td> 21から040-CV </td></tr><tr><td>無菌の蒸留脱イオン水</td><td>メディアテック</td><td> 25から055-CV </td></tr><tr><td>マウスのニューロンのNucleofectorとエレクトロポレーションキット</td><td>ロンザ</td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> c-Junのに対してON-TARGETplus siRNAを</td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td>抗 - βIIIチューブリン抗体（TUJ-1） </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Gold退色防止マウントソリューションを長引かせる</td><td>インビトロジェン</td><td> P36930 </td></tr></TBODY&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

それはよく、中枢神経系（CNS）の成熟したニューロンが成熟した中枢神経系の1,2軸索の成長と敵対的な環境をサポートするために減少した固有の能力に起因する負傷した後に軸索を再生成することができないことが知られている。対照的に、末梢神経系（PNS）の成熟したニューロンが傷害3の後に容易に再生成します。成人後根神経節（DRG）ニューロンはよく末梢神経損傷後、確実に再生することが知られています。周辺ターゲットと脊髄に延びる中央の分岐を支配末梢枝：各DRGニューロンは細胞体から、どの枝2軸索の枝に1軸索を成長します。実質的な軸索再生におけるDRGの末梢軸索結果の損傷は、脊髄の中心的な軸索のに対し、損傷後の不十分な再生成します。末梢軸索損傷は、脊髄損傷（プロセスがコンディショニング病変と呼ばれる）、中央の軸索の再生の前に発生した場合は、greatlです。yは4を改善しました 。また、DRGニューロンの中央の軸索は、脊髄での皮質脊髄軸索を降順同じ敵対的な環境を共有しています。一緒に、それは大人のDRGニューロンの軸索再生を制御する分子メカニズムは中枢神経系の軸索再生を向上させるために利用することができると仮定されています。その結果、成人DRGニューロンは、現在広く再生軸索成長5-7研究するモデル系として使用されています。 ここでは、in vitroでの軸索再生の遺伝学的研究に使用することができる大人のDRGニューロンの培養方法について説明します。このモデルでは、成人DRGニューロンは遺伝的にエレクトロポレーションによる遺伝子トランスフェクション6,8を介して操作されます。 DNAプラスミドまたはSI / shRNAを、このアプローチは大人のDRGニューロンからの軸索成長の任意の目的遺伝子の役割を調べるために、両方のゲインおよび機能喪失実験を可能にすると神経細胞をトランスフェクトすることにより。ニューロンは、SI / shRNAをトランスフェクトされると、対象となる内因性のタンパク質である通常あまり効果的で機能喪失の検討を進め、強固な軸索の成長が既に発生しているその間に、培養中の3-4日後の枯渇。この問題を解決するために、ここで説明する方法では、軸索が標的タンパク質の存在下でニューロンから再成長することができますトランスフェクション後の再懸濁および再メッキステップが含まれています。最後に、我々は成人DRGニューロンの9時から軸索成長を媒介する軸索再生関連遺伝子、c-Junの、の役割を研究するためにin vitroモデルでこれを使用する例を提供しています。

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

不定冠詞<em&gt; in vitroで</em培養された成体マウス後根神経節ニューロンを用いた軸索再生の遺伝学的研究のために&gt;モデルが記載されています。方法は、遺伝子操作を受けているニューロンから軸索の再成長を可能にするre-suspension/re-platingステップを含む。このアプローチは、RNAiベースのタンパク質のノックダウンを使用して、軸索再生の機能喪失研究のために特に便利です。

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K ビュー.  Johns Hopkins University School of Medicine. 不定冠詞 in vitroでモデルが記載されています。方法は、遺伝子操作を受けているニューロンから軸索の再成長を可能にするre-suspension/re-platingステップを含む。このアプローチは、RNAiベースのタンパク質のノックダウンを使用して、軸索再生の機能喪失研究?...

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

神経科学

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

腰部後根神経節のアクセスと豚注入の椎

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...