我々はリヨン仁のENS IGEMチーム（ヴィヴィアンChansavang、マチルドデュモン、アレクサンドルデュプレイ、メラニージェフロア、クレメンスGonthier、マルゴージョラン、Aurélieハーグ、ゴキのLy、トーマスポアンソ、ベリルロイヤー·ベルトラン、ジュリーSoulaの、マイケルVonzyの他のメンバーに感謝、ピエール·イヴ·ズンデル、Soufiane Bouhmadi、オリビエBrette、ガエルChambonnier、ラウライザド、Aurianne Kroiss、フィリップジューヌ、アニエスRodrigue、アルノーロンドレ、シルヴィーReverchonとヴァレリーDesjardin）、彼らの財政支援（ビオメリュー、Assystem、EDFは、財団のために我々のスポンサークリティカルこの原稿の読み取りとひずみのギフトのための博士のCCセー用INSA、ENS-Lyonとバイオサイエンス仁リヨン学科）、F. Wisniewskiは染料。ドローグBには博士号を受け取る地方ローヌ=アルプからフェローシップ。

1。 CurliオペロンのBiobrickのデザインと合成<ol><li>遺伝子構成を決定し、curli遺伝子の内因性の転写および翻訳シグナルをローカライズします。これらの情報は、RegulonDB aまたはbとEcoGene専門データベースに収集され、適切な出版物を注意深く読むことによって完了します。データ管理とインシリコ preanalysis ではクローンマネージャーソフトウェアCで行われた。 </li><li>適切なコーディング配列を選択します。 curli合成（csgBとcsgAエンコード繊維モノマー）とエクスポート（csgE csgFとcsgG、curlin分泌複合体をコードする）のための5つの絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 FASTAフォーマットでデータ·ベースから選ばれた配列を抽出。 csgGFEクラスタは、 大腸菌におけるアンチセンスであるとして大腸菌のゲノムは、その逆相補のcounterpにこのシーケンスを変換するクローンManagerツール操作を使用してアート&gt;プロセスの分子&gt;分子を反転します。関数&quot;ライゲート&quot;（クローン&gt;結紮）を使用してcsgBA背後csgEFGシーケンスを貼り付けます。 </li><li>適当なプロモーターを追加します。プロモーターP RCN、curliの制御下にある5つの選択curli遺伝子を配置することにより、コバルトとニッケルの存在下で過剰生産されると予測されています。 RCN軌跡は、NiおよびCo解毒（rcnA）及びその同族メタロレギュレータ（rcnR）を担当する排出ポンプをコードしている。 RcnRは、NiおよびCo 19に対応してrcnA、独自の遺伝子の発現を制御します。 rcnR CDS を含むRCNシーケンスは 、全体RCN遺伝子間領域プラスrcnAの41第一ヌクレオチドはcsgBAEFGキメラシーケンスのplacedinフロント（ 図1、構造全体の配列は、補足データとして提供される）であった。 </li><li>転写を最適化信号。完璧なリボソーム結合部位（または完璧RBS = AAGGAGGTATATA）がcsgBA DNA配列の最初のATGの前に追加されました。第二完璧RBSはcsgEFG配列の前に追加されました。 csgBとcsgFとcsgG遺伝子に対する内因RBSは保存されていた。 </li><li> IGEM基準に適合するように、デバイスを EcoRIの制限部位、PstIで （接頭辞） および Spe I および Xba I（接尾辞）を含む、標準BioBrick接頭辞と接尾辞により隣接されなければならない。装置Dのそれぞれの端に対応する配列を貼り付けます。 </li><li>任意のEcoRI、PstIで、SPE Iおよびデバイス内のXBA I認識部位を排除する。さらに組立工程を容易にするために、BioBrickパーツ自体はこれらの制限部位のいずれかを含めることはできません。デバイスのin silico制限分析でcsgA配列において、1 PstIでサイト、rcnR配列において、1 PstI部位を明らかにしたcsgE遺伝子と1 EcoRI部位。これらのサイトは、それぞれの位置80（MUT1）、1340（Mut2）とデバイス·シーケンスの1830（Mut3）（補足データ）に置かれ、サイレント突然変異によって次のように変更されました。 CGTCTGで変更CTGCAG MUT1 PstI部位 CAGCAGで変更Mut2 PstI部位CTGCAG GAATTで変更Mut3 EcoRI部位のGAATTC </li><li>クローンManagerソフトウェア（動作&gt;プロセスの分子&gt;翻訳分子）を使用して翻訳シミュレーションを通して実行されます。野生型curliタンパク質や合成オペロンにコードされるタンパク質の間の完全な相同性を確認するために配列アラインメントプログラムBLASTを使用しています。 </li><li>合成オペロンを命ずることができる。商用遺伝子合成サービスは世界中で数多くのメーカーから提供されています、私たちのパートナーはGenecust（ルクセンブルク）であった。人工オペロン（3165 bp）の4μgの数週間後に受信したpUC57（pIG2）に挿入した。 </li></ol>2。ポリスチレンに付着細菌を可視化し、定量化<ol><li> M63最少培地（グルコース0.2％）2mlを24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルを記入し、一晩培養した培養液の106細胞を用いて各ウェルに接種。振とうせずに18から48時間30℃でバクテリアを育てています。各列（4ウェル）はモダリティを表す。必要なときに適切なコバルトの量（25〜100 mM）および抗生物質（アンピシリン100μg.L-1）を追加します 。 24ウェルプレートの3最初の行は3回の繰り返しを平均化することにより、付着細菌を定量化するために使用され、残された最後の行は、バイオフィルムを可視化するために使用されています。 </li><li> 24ウェルプレートの3最初の行の場合 ：各ウェルについて、浮遊細胞を含む上清を回収する。 </li><li>慎重に1 M63 mlのプール2.2で得られた初期上清で1mlの洗浄）で各ウェルを洗浄してください。このプールは、水泳細胞（= S）と呼ばれています。 </li><li> 1ミリリットルoのバイオフィルムを回復こすると上下にピペッティングによるF M63（A = B）。ボルテックス15秒。各モダリティに対応順守率を与えるために600nm以下（OD 600）での光学密度から表面接続およ​​び水泳の細菌の数を見積もります。 </li><li>アドヒアランスの割合は、以下の式を用いて算出しています：BX100 /（3xS A + B）。 </li><li> 唯一 、24ウェルプレートの最後の行の ：浮遊細胞を破棄します。 </li><li> M63プレートの底に開発したバイオフィルムの1ミリリットルで洗浄すること。 </li><li> 80℃で1時間のオープンプレートを乾燥℃に</li><li>よく表面付着細菌を可視化するために、水との広範な洗浄に続いて、それぞれの中で2分間20％クリスタルバイオレットの100μlを添加する。 三つの独立したアッセイ（プレート）は、再現性を確保するために実行する必要があります。 </li></ol> 3。顕微鏡によるガラス上の付着細菌を可視化<ol><li>蛍光シャーシを入手してください。 E. constitutivel 大腸菌 SCC1 電子株yは親株MG1655 20から観察可能な違いは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドベアリング合成curliオペロンに適したホストです。 </li><li> S23の株を取得したプラスミドpIG2（=合成curliオペロンはプラスミドpUC57 の EcoRI / PST I部位に挿入）でSCC1を変換します。対照菌株のS24 21を取得するコントロールプラスミド（pUC18に）でSCC1を変換します。 </li><li> S23のと制御の一晩前培養（S24）、30日時点での株°M63グルコースを添加した培地（0.2％）とアンピシリン（100μg.L-1）のCを栽培しています。 </li><li>前培養液100μlを持つペトリ皿内の同じ培地15mlに植菌する。コバルト（ すなわち 25μM）の適切な濃度を追加し、コバルトなしのネガティブコントロールを忘れてはいけません。各ペトリ皿の3角型のガラスカバースリップをご紹介します。振盪せずに30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>あちこちにカバースリップを削除シャーレと慎重にドレインメートル。すべての細菌の残留物を拭き取ることにより70℃のエタノールを含浸させた小さな綿のもので、下面を丁寧に清掃してください。共焦点顕微鏡観察のために、カバースリップのさらなる定着を可能にするために数ミリ上で両方の上端部を清掃してください。 </li><li>付着細菌を蛍光顕微鏡下で直接可視化したが、すぐに、しかし慎重にサンプルの乾燥を避けることができます。 </li><li>共焦点顕微鏡観察のために、表向きに配置バイオフィルムで覆われて上面にスライドガラス上にカバースリップを預ける。バイオフィルムは、その後、ワニスをガラススライドに固定されている大規模なカバーガラスで覆われている。バイオフィルムは今下面にすることができるようになるという設定を反転します。 </li><li>共焦点レーザー顕微鏡下でセットアップを置きます。右Axioplan2 LSM510（Zeiss）を共焦点レーザー顕微鏡はPlatimプラットフォームf で使用されていました。 </li><li>設定。エキサイト488nmでGFPおよび範囲内細菌の蛍光を収集する500から600 nmの<html> 。共焦点レーザー走査型モードで画像を取得するために40倍油浸対物レンズを使用しています。 1μm以下のステップを使用して、増殖培地で固体表面からインターフェイスにバイオフィルムの全体的な三次元構造をスキャンします。 </li><li> IMARISソフトウェア（ビットプレン、チューリッヒ、スイス）と3次元投影を行う。統計的縦断面に沿って平均z値の分析によりバイオフィルムの厚さを決定します。別の場所で説明されているように22バイオフィルムbiovolumesの定量化は、共焦点のzスタックから抽出することができる。 </li></ol> RegulonDBは、転写ユニット、プロモーターとそのシグマ型、遺伝子およびそれらのリボソーム結合部位、ターミネーター、特定の転写調節因子の結合部位、ならびに規制フレーズを自分たちの組織にオペロンの組織とその分解についてのメカニズムに関する情報を提供しています。ら= &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp B EcoGeneデータベースは、 大腸菌についての最新情報が含まれて大腸菌 K-12ゲノムおよび広範な遺伝子を含む書誌プロテオーム配列。主要EcoGeneフォーカスが翻訳開始部位の再評価されています。 <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> C <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> dの <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> チュンチャウセー、ナンヤン工科大学、シンガポールの電子ギフト 。 F Platim顕微鏡プラットフォームUMS3444バイオサイエンスジェルラン-リヨンシュッ。

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	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

重要なステップこの合成生物学のアプローチの中で最も重要なステップは、遺伝子の設計です。合成遺伝子の設計は、効率的なシステムの生産を確保するために細心でなければならない。核廃液のバイオ除菌：その分泌系に関与するタンパク質をコードファイバモノマー及び3つの遺伝子をコードする2つの遺伝子は、新規アプリケーションのための新しい機能的なユニット?...

非生物的サポートに細菌付着はバイオレメディエーション、生体触媒または微生物燃料電池に大きな役割を果たしている。バイオレメディエーションプロセスは、有機物を分解する微生物の能力を使用したり、金属分布（固定、揮発）、または分化を修正することができます。これらの有益な活動は、水生·陸生生態系ではなく、産業や家庭排水の汚染水を処理するために開発された人工システムで観察されています。微生物の活動の強度や品質はもちろんのこと、微生物のライフスタイル（フリーフローティングまたはバイオフィルム中に埋め込まれている）で、物理化学的要因に依存する。バイオフィルム形成は、多様なメカニズムによって殺生物剤に抵抗性を促進する代謝に関連付けられています。この現象は、したがって、ほとんどのバイオレメディエーションプロセスに奨励される。また、バイオフィルム形成を制御するためのエンジニアリング大腸菌細胞が正常に適用されているバイオチップ2-3全細胞センサーを固定。 金属の高濃度の微生物の適応は、そのような細胞外マトリックス成分への吸着、細胞内に金属を集中することができる排出ポンプまたは特定のキャリアの活性化などの多様なメカニズムを介して行われます。ラグーらによって説明されているように遺伝子工学を介してこれらの細菌の活動を後押しすることは、特に弱い量で毒性の高い金属の場合には、実験室規模での金属汚染を効率的かつ安価な治療を可能にします2008年4。細菌の修復は、このケースでは、イオン交換樹脂を用いた古典的な化学プロセスに比べて競争力のあるコスト削減方法を表しています。著者らは、Eを説明大腸菌シャーシは遺伝のマルチコピープラスミド許可過剰生産と排出ポンプをコードする遺伝子rcnAをノックアウトすることで、次に変換によってコバルト取り込みおよび保持第一のために設計コバルトの選択的取り込みとトランスポーターはこのような歪みは、放射性廃液を治療するために、イオン交換樹脂への効率的な代替として表示されますが、重要な未解決の問題は、プロセス4の終わりに汚染された菌の回復です。私たちの仕事の目的は、ガラスやプラスチックなどの非生物的支持に固執することができるカスタム設計された菌株を設計することであった。 アドヘシンおよびグラム細菌で同定付着線毛の全体のセットの中で、我々はcurli生産を可能にするシステムを設計することを選んだ。 Curliは大腸菌から突出薄い（2-5 nmの直径）と高凝集アミロイド繊維である非結晶性と不溶性マトリックス5月7日として大腸菌やサルモネラ表面。 Curliも無生物表面とバイオフィルム8の開発の植民地化に関与している。 Curliは最近水銀イオン9を結合することが示された。アミロイドは確かに高い有することが知られている例えば、Cu 2 +、Zn 2 +及びFe 3 +の10のような金属イオンに対する親和性。このプロパティには、さらに金属汚染排水の除染が向上する場合があります。 CSGクラスタはcurli繊維の製造を担当し、2発散転写オペロン（ 図1）で構成されている。 csgB、csgAとcsgC遺伝子は 2 curliサブユニット、CsgAとCsgBをコード化して、センスオペロンを構成している。 CsgCはcurli生合成システム内レドックス活性に関与しているように見えるとCsgG孔11動作に影響を与える。しかし、curli生産菌の大部分におけるcsgCの不在は、対応するタンパク質がcurli生合成を制御するための唯一のsecundaryレベルを提供することを示しています。システムを簡素化するために、私たちは、遺伝子の最小数で動作するように選択されています。 csgDEFGは規制と輸送に不可欠なタンパク質をoperonencodesCsgAとCsgBの細胞表面へ。 CsgDはcsgBACオペロンの転写活性化因子であるとcurli線毛、セルロース12など他のバイオ成分の産生を制御することによって阻害すると鞭毛生産13によるバイオフィルム形成の制御において重要な役割を果たしています。 CsgE、CsgFとCsgGは主要curliサブユニット蛋白質CsgAが可溶性タンパク質として分泌され、それを通して外膜におけるcurli固有分泌装置を構成する。 CsgAの重合が膜結合核タンパク質CsgB（14件中）のin vivoで依存しています。いくつかの2成分系を含む複雑な調節経路がcurli遺伝子発現15から16を制御することが示されている。これらの複雑な規制は、細菌が環境手がかりに応答curliの産生を介して厚いバイオフィルムを形成することができますが、産業用アプリケーション向けに、制御するのは困難です。 Metの回復を容易にするために工業プロセス中のアル·ぬいぐるみ細菌、固体支持体への細菌の固定は確かに明確に定義されたパラメータ（s）によって制御される必要がある。 curliの付着特性は、それらのアミロイド性質17にリンクされており、バイオレメディエーションプロセスを改善するために使用することができますが、単純かつ容易に制御されたデバイスを作成する必要があります。 これらの7つの遺伝子18の中でも、curli合成（csgBとcsgAは繊維モノマーをコードする）と輸出（csgE csgFとcsgG、curli分泌複合体をコードする）のための5絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるために、強力かつコバルトoverinducibleプロモーターの制御（ 図2）の下で、これらの5 CSG ​​遺伝子を含む合成オペロンを設計し、合成した。 curliコード領域のステップ·バイ·ステップの分析と機能合成するための設計手順断定的なオペロンが記載されている。ポリスチレンやガラスへの細菌付着を可視化し、定量化するための二つの方法が説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td>合成P RCNを含む3165 bpのEcoRI / PstIフラグメントを持つpUC57（pMB1 ORI、2710 bp）の- csgBAEFGオペロン;アンプR </td></tr><tr><td> pUC18を</td><td></td><td></td><td>アンプR、（pMB1 ORI、2686 bp）を多コピープラスミド</td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1（= GFPタグMG1655は、CCセーの贈り物）/ pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td>のCoCl 2 </td><td>シグマ</td><td></td><td> 0,1 Mのストック溶液は、室温で維持</td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ヌンク</td><td> 55429 </td><td>ポリスチレン24ウェルプレート</td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

ここで説明する方法は、 大腸菌を再設計することで構成されています強いと金属overinducibleプロモーターの制御下にcurli遺伝子の最小数を組み立てることにより、細菌の付着の結果として生じるゲインを可視化し、定量化における大腸菌の付着特性。この方法では、適切な工学的合成生物学の抽象化と標準化の原則、BBa_K540000 Biobrick（ベスト新Biobrick機器、エンジニアリング、IGEM 2011）の結果を適用します。 最初のステップは、金属に反応して、したがって、野生型株の付着力を高めることにcurli過剰生産に専念して合成オペロンのデザインで構成されています。オリジナルcurliオペロン転写および翻訳シグナルを最適化し、curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるためにin silicoで変更されました。このアプローチでは、成功を収めてcurli生産の私達の現在の理解度をテストすることができました。 Moreoverは、単純な金属調節プロモーターに内因性の複雑なプロモーター（10以上の転写調節因子が同定される）スイッチングによりcurli規制を簡素化すると制御への付着が非常に容易になります。 第二段階は、単純なメソッドの実装によって付着力の定性的および定量的評価が含まれています。これらの方法にかかわらず、バイオフィルム形成に関与する生物学的構造の付着細菌の広い範囲に適用されます。 24ウェルポリスチレンプレートで付着試験は、クリスタルバイオレット染色後の細菌バイオフィルムの迅速な予備可視化を提供します。この定性検査は、アドヒアランスの割合の定量化によって先鋭化することができます。このような方法は非常にシンプルでありながら優れた再現性と再現性の両方で以前に1に記載のように唯一のクリスタルバイオレット染色よりも正確です。蛍光またはレーザーのconfによりスライドガラス上のGFPタグ細菌の可視化OCAL顕微鏡は、現象を直接観察することにより、24ウェルプレート試験で得られた結果を強化することができます。

EのシーケンスをCSG野生型の in silico In アノテーション転写および翻訳シグナルの最適化に関連する大腸菌 K12は、 図3（補足データでフルシーケンス）に示すように、単一の合成curliオペロンP RCN-CSGを設計することができました。プロトコル2とプロトコル3 curli生産に伴うアドヒアランスを可視化し、定量化するために使用された。各ウェル...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可<em&gt; E大腸菌の</em&gt;シャーシ<sup&gt; 1</sup&gt;。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K ビュー.  Université de Lyon. 分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可 E大腸菌のシャーシ 1。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

肺のエンジニアリングのための手順

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

生物工学

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

合成、マルチレイヤ、自己発振声帯モデルの作製

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...