This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

単一分子ピンセットのためのRNA分子の調製<ol><li>目的の配列のクローニング。ベクターへのRNAの構造に対応するDNA配列をクローニングする。 </li><li>合成および転写鋳型の精製。 PCRによる転写鋳型を合成する。 [ここで、プレース表1]次に、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、&gt; 200 ngの/μlのサンプルを濃縮する。精製されたDNAを転写するために使用されているため、RNaseを含まない水が溶出及び濃縮の工程で使用されるべきである。 </li><li> インビトロ転写 。 RNAの収量を最大にするために37℃で一晩のin vitro転写によってRNAを合成する。転写した後、[ここの場所テーブル2]、私は37℃で15分間のDNA鋳型を消化するために1μlのDNA分解酵素を加える。シリカスピンカラムを用いてRNAを精製する。 </li><li>ビオチン化され、ハンドルAの合成は、まず、プライマーのAf及びAr濃を用いたPCRにより、未修飾ハンドルAを生成する&gt; 200 ngの/μLに増幅されたDNAをentrate。次に、プライマー伸長反応を使用して、PCR産物にビオチン修飾を組み込む。 [場所ここで表3]備考：ビオチン化ハンドルA（ビオチン-HA）は精製することなく直接アニーリングで使用することができます。ビオチン-HAは、RNAとアニールされるように、両方の工程でのRNaseフリー水を使用することが重要である。 </li><li>ジゴキシゲニンで修飾されたハンドルB.論理合成の合成プライマーBfとし、ジゴキシゲニンで修飾されたオリゴ掘る-BR（ 図3）を用いたPCRによる修正されたハンドルBを（DIG-HB）をジゴキシゲニン。次に、PCR産物を精製し、&gt; 200 ngの/μlにサンプルを濃縮。 </li><li>ハンドルへのRNAをアニール。ハンドルを有するRNAをアニール。 [場所の表4とここ5] </li><li>焼きなましサンプルを精製する。アニールされたサンプルの3容量のエタノールを加え、よく混ぜる。少なくとも1時間-70℃で混合物を保管してください。 15,800×gでスピンダウンし、上清を捨てる。凍結乾燥機を使用してペレットを乾燥させる。ペレットを溶解100μlのRNaseフリー水を。注：サンプルを使用する準備ができ、-20℃で保存することができる。 </li></ol>光ピンセットの2キャリブレーションと運用<ol><li>ビデオモニターのピクセルサイズのキャリブレーション<ol><li>既知の径（サイズ標準）でビーズをトラップするために光トラップを使用してください。 </li><li>イメージングソフトウェアを使用して捕捉されたビーズの捕捉画像（ 図4）。 </li><li>重心法に基づくイメージングソフトウェアを使用して、ビーズの直径を決定します。 </li><li>異なるサイズのビーズの直径を決定するために、この手順を繰り返します。 </li><li>ピクセルの物理的サイズを得るために、線形回帰によってビーズの測定され、既知の直径を取り付けます。 </li></ol></li><li>距離校正を確認する<ol><li>トラップしたビーズを光トラップを使用してください。 </li><li>画像キャプチャソフトでその重心の画素位置を決定し、Minitweezersを使用してその位置を記録。 </li><li> diffeにビーズステア<html>ポジションをレンタルし、位置決定を繰り返す。 </li><li>ビーズのX及びY位置は、較正されたピクセルサイズを使用して、m個の単位に画素からの変換。 </li><li>ビデオによって及びMinitweezersによって測定された位置の間で、XとYを比較してください。 2組の値が一致する必要があります。画像解像度は&gt;0.1μmであるため、精度を確保するために測定値の間の1ミクロンのビーズの上を移動します。距離校正はMinitweezersに格納されている1つを比較することはできません場合は、機器を再校正。 </li></ol></li><li>トラップ剛性リブレーション<ol><li>光トラップを使用してビーズを捕捉し、まだそれを保持します。 </li><li> 3秒のための&gt; 5 kHzのレートでバイパス、高速データ収集を使用して、トラップの力を記録します。 </li><li>ソフトウェアを使用して、ビーズの動きの記録からパワースペクトルを生成する。ローレンツ（ 図5）38にパワースペクトルをフィット： 542 / 51542eq1.jpg &quot;幅=&quot; 200 &quot;/&gt;（式1） S（f）は周波数fでの電力である、f cとは、コーナー周波数であり、S 0は漸近的な力である。コーナ周波数f cは 、熱運動の力が漸近値の半分に減少している周波数である。 f cとレーザパワーとビーズのサイズに応じて変化するように、個別に捕捉されたビーズを較正する。 </li><li> F c からトラップのバネ定数、κを計算します。 <img alt="式2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> （式2） においてγは、ビーズ（式3）の抗力係数である。力変化からのRNAの伸長の変化を決定するために、バネ定数を使用する。 </li></ol></li><li>ストークスの法則をテスト<ol><li>光トラップを使用してビーズをキャプチャします。異なる速度でバック·アンド·フォースビーズを移動します。 </li><li>ビーズの動きを記録し、Minitweezersを使用して強制的に。 </li><li>ビーズの半径を計算します。 NOTE：摩擦力、流体中の球状粒子の運動によって発生F dは 、ストークスの法則によって記述することができる。 <img alt="式3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> （式3） rは球の半径である、vは速度であり、hは 、参照表に見出すことができる流体の動粘度である。 F dとして測定された力を使用して、ビードの半径は、式を用いて計算することができる。 3（ 図6）と、画像取得ソフトウェアにより決定することに同意する必要があります。ストークスの法則·テストを効果的に全体的なキャリブレーションと計測器の性能をテストします。 </li></ol></li></ol>単一のRNA分子の3ナノマニピュレーション<ol><li>流体工学を作る。 <ol><li> 2号のカバーガラス（ 図7a）上のドリル6穴（直径2mmずつ）とレーザー彫刻機を使用した両面ポリイミドテープ（ 図7b）内に3つのスリット（幅2mm）に切断。 </li><li>両面カプトンテープの二つの層を持つ2つのカバーガラスを挟んでフローチャンバーを作成します。テープ（ 図7c）との間にマイクロピペットと2つのバイパス管を挿入します。 </li><li>流体穴（ 図7d）を一致させることによって、金属フレームにフローチャンバーをマウントします。 </li><li>ポリエチレンチューブ（ 図7E）を介して、選択した緩衝液を満たした10ミリリットルの注射器チャンバの流体チャネルに接続します。 </li><li>二つの目的の間の光ピンセットに全室をマウントします。流体チャネルとチャンバーの前面右に直面していることを確認してください。右の目的を引っ込めとtの取り付け穴にフレーム（ 図7E）の真鍮製のピンを差し込む彼はピンセット。チャンバー位置を固定するネジを締めます。 </li></ol></li><li>アニールしたサンプルとビーズを混合する。抗ジゴキシゲニンコーティングビーズ（DIG-ビーズ）でアニールしたサンプルを混合し、混合物を5〜10分間、室温で滞在することができます。一般的には、アニールされたサンプルを1μlの緩衝液1mlに5μlのDIG-ビーズと混合されている。注：フローチャンバにロードされるビーズの量は、バイパス管から送達されるビーズの合理的な量を確実にするように選択されるべきである。ビーズへのアニーリングサンプルの比は、容易に定量化することができない。理想的なケースでは、ほとんどのビーズは、ビーズのごく一部がビーズごとに1つのRNA分子を有することができるように何RNAを持たない。アニールされたサンプルとビーズ懸濁液は、定量化が困難であるため、唯一の方法は、現在最善とは混合比を変化させ、ピンセットでの混合物をテストすることです。 </li><li>マイルの上に、 すなわち （フローチャンバ内の反応サイトに数μmのビーズを提供cropipetteチップ、 図7c）。 <ol><li> 1ミリリットルの注射器にストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（ストレプトビーズ）の懸濁液をロードします。 </li><li>フローチャンバー（ 図7a）の底部のチャネルに通じる流体チューブに注射器を接続します。 </li><li>チャンバー内に連鎖球菌ビーズを流す注射器を押してください。 </li><li>ボトムバイパス管の開口部（ 図7b）に近い光トラップを配置するモータ制御ソフトウェアを使用してチャンバ全体を移動します。その後、連鎖球菌ビーズを捕捉するためにトラックボールによって光トラップを運営しています。 </li><li>モータ制御ソフトウェアを使用してマイクロピペットの先端に近いビーズを移動します。 </li><li>マイクロピペットの上にビーズを吸うためにマイクロピペットに接続された注射器を引き出します。 </li><li>余分な連鎖球菌ビーズを洗い流すために中間チャネルに注射器を押して、静かに流れを適用します。 </li><li>同様に、チャンバの上部のチャンネルに（ステップ3.2参照）をサンプルとディグビーズの混合物を提供する。 </li><li> DIG-ビーズを捕捉し、光トラップを使用して、ストレプトビーズの近くにそれを持って来る。 </li><li>フローを適用することにより、中央のチャネルを清掃してください。 NOTE：strep-と掘るビーズは、それらが顕微鏡図（ 図4）の下で視覚的に区別できるように異なるサイズであるように選択される。 </li></ol></li><li> 「ビーズのペア間の単一分子テザリング釣り。 <ol><li>ストレプトビーズ（ 図4）の上に垂直に掘るビーズを配置します。 </li><li>トラップを操縦することによってダウンストレプトビーズに向かってDIG-ビーズを移動します。力の変化を可視化するために、コンピュータに力 - 距離プロットウィンドウを開きます。 </li><li> 2ビーズの接触すると、垂直方向に離れて連鎖球菌ビーズからDIG-ビーズを移動します。 </li><li>具体的な接触がなされない場合には、力はほぼゼロのままである。つのビードが分子によって接続されている場合、力の増加は著しくつのビードを分離する。一般に「フィッシング」と呼ばれるこの手順は、しばしばパーフォレーションある効果的な単一分子テザーを見つけるために、ビーズの各ペアで複数回ormed。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

<html> ピンセット試料の調製における変更とトラブルシューティング クローニングベクターの選択 。ここに記載した一般的スキーム（ 図3）は 、特別なクローニングベクターを必要としないが、ベクターは、プロモーターが所望の位置にPCRを介して導入することができるような転写を容易にするために固有のT7またはT3プロモーターを持た...

光ピンセット技術の開発は、長い生物学的研究におけるその適用を伴っている。光閉じ込め効果が最初に発見された場合には、アーサーAshkinは汚染された水の中の細菌は、レーザーの焦点1に捕捉することができたことを観察した。それ以来、トラッピング細菌は生物物理学の学生の世代のために意図的で、楽しい実験だけでなく、微生物生理学2,3を研究するための本格的な研究ツールとなっています。光トラッピング技術は、顕微鏡対象物1を固定する集束レーザービームを使用する。実際には、また、トラップ（ΔX）の中心からの変位によって挟み込まれた物体に作用する力（F）を測定する光学春、などのレーザートラップ機能。短距離、F =κのxΔX内では、κトラップのバネ定数である。光トラップは、ミクロスにピコニュートン（pNで）精度の力を発揮するために使用することができコピックオブジェクトとナノメートル（nm）の精度でその位置を測定します。過去20年間では、光ピンセットは、生物物理学の中で最も使用された単一分子技術の一つとなっている。技術は、DNA 4-6、7-9、RNAおよびタンパク質10,11の折り畳みおよび力学を研究するために採用されている。光ピンセットはまた、DNA複製12、RNA転写13、及びタンパク質合成14,15、ならびに多くの他の生体分子のイベント16-18を観察するために使用されている。 単一分子アプローチは主にRNAの頑丈なフォールディングエネルギー地形を探索するRNA構造的研究に用いられている。 RNA配列は、通常によるRNAの単純な化学組成及びベースペアリングルールに、複数の安定した、相互に排他的な構造に折り畳むことができる。これは、長いRNA構造多型、すなわちリボスイッチ19,20に生じるような、遺伝子調節において重要な役割を果たしていることが知られている。 recenトンゲノムワイドの調査では数度と小さい温度変動が大きく、携帯トランスクリプトーム21の大部分の構造とタンパク質合成に影響を与えることを明らかにした。この例では、選択的RNAフォールディングの生物学的役割は、以前に想定よりもおそらくもっと重要かつ普及していることを示唆し。構造的多型は、しかし、多くの分子の平均的性質を調べ、従来の生化学的および生物物理学的アプローチ、のための課題を提起する。たとえば、「オン」とリボスイッチの「オフ」のコンホメーションは、相互に排他的です。異質の構造に由来し、平均化構造は、生物学的に関連する配座異性体のいずれかに似ている可能性は低い。また、非翻訳RNAおよびmRNAは通常、構造を形成する。タンパク質や調節RNAとの相互作用は、一般的な相互作用の一部として、既存の構造のアンフォールディングが必要です。そのため、RNAフォールディング/リフォールディングを研究することは、該当になるRNA生物学の問題。そのような課題に対応するために、単一分子アプローチは、時間22〜27時、一分子を研究することによって、RNAの構造多型を解明するために採用されている。 人気のある単一分子蛍光法と比較して、アンフォールディング機械ベースのピンセットは、個別の分子の立体配座は、加えられた力によって操作することができ、ナノメートルの精度で測定するという利点を提供する。このナノマニピュレーション能力は、大きなRNAの階層的なフォールディングが28を解剖することができるように個別の構造ドメインのアンフォールディング/フォールディングをモニターするために利用することができる。あるいは、一本鎖は、いくつかの配座異性体の一方に折り畳むように指示することができます。または既存の構造は、機械的に異なるコンフォメー29内にフォールディングするように誘導することができる。生物学的条件下で、RNA構造は、温度変化またはリガンドの結合の際に変化させることができる。直接操作する分子の能力体制は、RNAの構造研究の新しい会場をオープンします。原則として、そのような原子間力顕微鏡、磁気ピンセットのような他の機械的技術もまた、単一のRNA分子のフォールディングを研究するために使用することができる。しかし、このようなアプリケーションは、主に、比較的低い空間分解能30に制限されている。 光ピンセットの雇用は、RNA構造は機械的な力で展開することができます。 機械的な展開の利点は数倍である。金属イオンと配位子誘起フォールディングは主三次構造に限定されるのに対し、力は、二次および三次構造の両方を展開するために使用することができる。温度と変性剤が大幅に水と溶質の活動に影響を与えることができる。対照的に、力が分子構造を乱す局所的に適用される。周辺環境への力の影響は無視できる。また、熱溶融が最高の小さなRNA構造のフォールディングの熱力学を研究するために使用され、光ピンセットは、7塩基対テトラループヘアピン28から400ヌクレオチド、リボザイム31に至るまで、さまざまなサイズのRNA構造を研究するために使用されているのに対し。さらに、RNA構造は、機械的に中温の温度で展開することができる。対照的に、熱融解実験でRNAを展開するために、温度は、典型的にはかなりよく、特にはMg 2 +イオンの存在下で、RNAの加水分解を増大させる生理学的温度、より高くなる。 これは、力の機械的効果は、それが構造に適用される方法に依存することに留意することが重要である。加えられる力は折りたたみエネルギー地形を傾斜させる。例えば、力がヘアピンに適用した場合に、塩基対を順次、時間（ 図1a）少なくとも一つを破壊される。リッピングフォークは、加えられた力に垂直な螺旋軸に沿って進行する。最小限キス錯体は張力下にあるときとは対照的に、二つのキス加えられた力に平行な塩基対は、力の負荷を共有する（ 図1b）。異なるヘアピンの形状及び二次及び三次折り畳み28,32を区別するために利用することができ、それらの異なる機械的応答して、加えられた力の結果に複素比キス。メカニカルアンフォールディングの理論的側面 ​​は、以前に8,9,30概説されている。この作品は、設定および単一分子機械的アンフォールディングアッセイを実行するための基本的な方法の概要を説明します。 実験のセットアップ 。私たちの機械的引っ張りの実験では、ピンセットのためのRNA試料は二つの二本鎖DNA / RNAハンドルが隣接し、目的のRNA（ 図2）で構成されて7。分子全体は、それぞれ、ストレプトアビジン - ビオチンおよびジゴキシゲニン - 抗ジゴキシゲニン抗体相互作用を介して2つの表面コートされたミクロンサイズのビーズ（Spherotech）に係留することができる。一つのビーズは、力測定光学TRに保持されているAPが、他方はマイクロピペットの先端に保持されている。ビーズ間の相対距離は、トラップを操縦またはマイクロピペットを移動させることのいずれかによって変更することができる。このアプローチを使用して、ビーズをテザリング単一のRNA分子が引き伸ばされ、緩和することができる。 試料の調製 。ピンセットのためのRNA試料の合成は、いくつかの手順（ 図3）を含む。まず、関心対象のRNAに対応するDNA配列は、第一のプラスミドベクターにクローニングする。次に、3つのPCR反応は、2つのハンドルおよび転写のための鋳型を生成するために実行される。転写鋳型は、ハンドル領域および挿入された配列を包含する。全長RNAをin vitro転写により合成される。最後に、RNA及び化学的に修飾されたハンドルは、ピンセットのための分子を生成するために一緒にアニールされる。 キャリブレーションとピンセットの動作 。 Minitweezers利用の基本設計この作品におけるdはデュアルビーム光ピンセット33のことに従います。第一世代の光ピンセットに比べて多くの改善により、Minitweezers臨時安定性を示す。いくつかの国の研究グループの数は、それらの単一分子研究14,15,34-37にMinitweezersを使用しています。命令ビデオを含む建設、キャリブレーション、デバイスの動作の詳細は、「ピンセットラボ」のウェブサイト（http://tweezerslab.unipr.it）でご利用いただけます。ここで、毎日の塩基で実行する必要の改良や校正手順について詳細に説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

ヒトゲノムの大部分は転写されるが翻訳されていません。このポストゲノム時代においては、RNAの調節機能は、ますます重要であることが示されている。 RNAの機能は、多くの場合、別の構造を採用する能力に依存するので、シーケンスから直接RNA三次元構造を予測することは困難である。単一分子は、一度に一つの分子の分子構造を監視することにより、RNA構造多型の問題を解決するためにショーの電位に近づく。この作品は、正確に光ピンセットを用いて単一のRNA分子のフォールディングおよび構造を操作するための手法を提案する。まず、単一分子力学的仕事に適した分子を合成する方法が記載されている。次に、光ピンセットの業務の適正を確保するために、さまざまなキャリブレーション手順が説明されています。次に、さまざまな実験が説明されている。技術の有用性を実証するために、機械的に展開するRNAヘアピンの結果や単一のRNAキーシングラム複合体は証拠として使用される。これらの例では、ナノマニピュレーション技術は、独立して、二次および三次構造を含む各ドメインのフォールディングを研究するために使用した。最後に、制限及び方法の将来のアプリケーションが説明されています。

スペースによって制限される、単一のRNA分子のナノマニピュレーションは、RNAヘアピン構造および三次構造を有するRNAの唯一の機械的な展開例を示すことにより実証される。 シングルヘアピン分子を操作する テザーは、ビーズ間で確立されると、テザー上の拡張力は、ユーザ定義のプロトコールを使用して操作することができる。 4つ?...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K ビュー.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

生物工学

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...