我々は、その蓄積された知識は、このプロトコルを可能にしたワシントン大学で全体マウラーのグループに感謝します。この仕事のための資金は、国立精神衛生研究所（1R01MH085495）によって提供されます。

1。パターンドマスター（図1）の調製<ol><li>中央スピンコーター上にシリコンウエハと表1の2サイクルのスピンプログラムの初期段階中に、アセトンでウェハをすすぐ。アセトンは清潔で乾燥したウェハを残しスピンプログラムの第二段階の間に蒸発する。 </li><li>表1に記載の条件を使用してウェハとスピンコートして約1 mLのAZ9245フォトレジスト/で（直径）適用されます。 </li><li>ソフトベーク110でフォトレジストでコーティングされたウエハ·高均一性のホットプレートを使用して2メートルのためのC。 </li><li> Photopatternどちら直接書き込みリソグラフィシステムやマスクアライナシステムと適切なマスクを用いて基板。マスクは商業的供給源の数から購入することができます。さらに、光学フラットに録音されたUV吸収剤、インク、、と印刷されたOHPフィルムは、大きな特徴でパターンを生成するために使用することができます。 </li><li>穏やかに撹拌で1メートル45秒のために半導体グレードの脱イオン水：1:2 400K開発者のパターン付きウェーハを開発する。半導体グレードの脱イオン水と窒素の流れ（N 2）ガスを用いたドライで十分にすすいでください。パターンの開発は、UVフィルターを顕微鏡を使って確認することができます。パターンが完全に開発されていない場合は、ウェハは、追加の時間のための現像液に戻すことができます。 </li></ol>注：最適な結果を得るために、光パターニングは、クリーンルーム環境で行われるべきである。 2。 PDMSスタンプの調製（図2） <ol><li>重量の樹脂で10:1の準備：Sylgard 182（PDMS）の硬化剤の混合物と完全に使い捨てペトリ皿の混合物とマスターを（光パターン形成ウェハ）をカバー。 </li><li>脱ガスPDMS -覆われていない泡が表示されていないとスタンプが1.5時間65℃のオーブンで硬化するようになるまで真空デシケーターでマスターする硬化する前に、それは脱ガス処理工程中に表面に上昇する可能性があるため、マスターが皿の底にあることを確認が重要です。 </li><li>マスターのPDMSスタンプを切り出し、適切なサイズにトリミング。ほこりや破片から保護するために蓋をした容器（アップ機能の側）にスタンプを保管してください。 </li></ol> 3。パターン付金基板の調製（図3） <ol><li>は25mmを準備していません。 10mのための酸素プラズマを用いる処理による金属の析出のための1ラウンドガラス製カバースリップ各ステップの間にN 2ガ ​​ス流で乾燥、二回、エタノールとそれに続く18.2MΩ脱イオン水で2回リンスします。 </li><li>マルチポケット電子ビーム蒸着システムを使用して、預金50Åのチタンは、150Åの金が続く。チタン層と金層の堆積の間に蒸発器を発散しないでください。また、金でコーティングされたカバースリップは、サプライヤーの多様から購入することができます、しかし、金属層を電子ビーム蒸着ではなく、熱蒸着によって準備されていることが重要です。使用前に11：外部のソースから購入された場合、金基板はプラズマ酸化または&quot;ピラニア&quot;（30％H 2 O 2。7時03濃H 2 SO 4）で洗浄することができる。 </li></ol>注：&quot;ピラニア&quot;ソリューションは、有機化合物の存在下で爆発的です。 <ol start="3"><li>スタンピングソリューション、無水エタノール中の10mM hexadecanethiol、および埋ソリューション、無水エタノール中の1mMグリコール終端チオールを準備します。 </li><li>エタノールでスタンプをすすぎ、N 2ガ ​​スで十分に乾燥させます。完全にコーティングされるまで滴下PDMSスタンプへのソリューションをスタンピング適用されます。 N 2ガ ​​スで十分にスタンプを乾かします。 PDMSスタンプの機能に基づいて適切に5aあるいは5bに進んでください。 </li><li><ol class="lalpha"><li>ゆっくりと金基板上にスタンプを押して、単分子層が15秒のために形成することができます</li><li>基板が水没されることを保証、18.2MΩ脱イオン水を含むペトリ皿に金基板を置きます。ゆっくりと金基板上にスタンプを押して、単分子層が15秒のために形成することができます</li></ol></li><li>それぞれのすすぎとペトリ皿の中で基板を配置した後、N 2ガ ​​スで乾燥、エタノールで2回スタンプ付き基板をすすぐ。 </li><li>埋め戻しソリューションで基板を覆い、蒸発を防ぐためパラフィルムで料理を封印。 </li><li>背景の単分子層は12〜14時間にわたって暗所で形成することができます</li><li>埋め戻しソリューションからパターン化されたカバースリップを削除し、各洗浄後、N 2ガ ​​スで乾燥、エタノールで2回すすいでください。 </li></ol> 4。パターン基板へのタンパク質や細胞の適用<ol><li>小さなペトリ皿やダルベッコのリン酸の500μL〜1 mLの細胞培養容器と蓋の模様のカバースリップが（DPBS）緩衝生理食塩水に置きます。 DPBSは完全であってもタンパク質のカバレッジを確保するためにタンパク質のインキュベーションの間に基板をカバーする必要があります。 </li><li> DPBSにタンパク質の濃縮液を追加し、パイプによるソリューションを混在させるティン数回。 37℃で基質とタンパク質の混合物をインキュベート℃で1時間ラミニンおよびフィブロネクチンの最終的な濃度は、それぞれ、通常12μg/ mLとし、20μg/ mLとなります。タンパク質は、簡単なパターンの可視化を可能にするためにアミン反応性蛍光色素で標識することができます。タンパク質標識が生物学的活性を妨げることができるしかし、標識タンパク質は未標識タンパク質と1:1で混合されるべきである。 </li><li>インキュベーション後、基質を乾燥させたり、空気 - 水界面を介して持参しないように注意しながら、未結合のタンパク質を除去するためにDPBS（4〜5倍）で十分に基板をすすぐ。最初の三つ洗浄した後、湿った基板を維持するために、完全な細胞の増殖培地の約500μLを加える。 </li><li>新鮮な培地を用いて基板を洗浄するために使用される増殖培地を交換してください。 </li><li>解離し、基板上にメッキするためのセルを数える。このような海馬ニューロン、またはそのようなCHO - K1細胞のような不死化細胞株、、として解離初代細胞、どちらを利用することができる。 </li><li>基板上にプレート解離細胞。通常は30〜200細胞/ mm 2のが使用されます。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。パターニングされたマスターのフォトリソグラフィ準備のための一般的な回路図。このプロセスでは、シリコンウェハは、アセトンで洗浄され関心のパターンに露光されたフォトレジストで被覆し、パターンが開発されています。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。PDMSスタンプの準備のための一般的な回路図。 、60℃のオーブンで硬化、真空デシケーター中で脱ガス処理、およびサイズ​​にカット：このプロセスでは、パターニングされたマスターは、Sylgard（硬化剤10時01樹脂）で覆われている。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。基板のパターニングのための一般的な回路図。このプロセスでは、ガラス基板は、電子ビームグリコール終了アルカンチオールを充填PDMSスタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングhexadecanethiolによってパターン化された蒸発器、、、および蛍光標識したタンパク質でコーティングを用いてチタン（50A）とゴールド（150A）でコーティングされています。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="図4"/> 図4パターンドマスター（A）とPDMSスタンプは、（B）に記載の方法を用いて調製。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。パターン化SAMのはAlexaFluor 647 -標識されたフィブロネクチン（A）とCHO - K1細胞の閉じ込め（B）で可視化した。スケールバーは100μmです。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="図6"/> 図6 in vitroでの 4日間でE18マウス海馬神経細胞でパターンラミニンシード。 AlexaFluor 350 -標識抗ラミニン抗体は、パターンの可視化のために使用されます（）およびE18マウス海馬ニューロンは、MitoTrackerによりレッド580（B）で染色されています。スケールバーは100μmです。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="図7"/> 図7。パターニングされた基板を準備中の潜在的な落とし穴がAlexaFluor 647 -共役フィブロネクチン吸着により可視化。不均一なタンパク質吸着に（A）不十分な混合リード。部分的な木靴の転送にリード線をプレス時の圧力の（B）不均等なアプリケーション。 （C）プレス時の圧力をかけすぎると崩壊をスタンプする可能性があります。 （D）すすぎ時の空気の水界面へのパターン化表面の露出は、バックグラウンドタンパク質の吸着が発生する可能性があります。スケールバーは100μmです。 <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="図8"/> 図8。水中パターニングは、空気中の従来のマイクロコンタクトプリンティングによって印刷することが困難な小さな機能を持つパターンを生成することができます。画像（A）と（B）空気中の同じPDMSスタンプ（A）または脱イオン水（B）で印刷された同じパターンの異なる地域を、示す。パターンを囲む10μmの幅のサポートラインは、（タイムスタンプの崩壊を防ぐために追加された）（）で見られている、しかし、図に示すように小さなドットの機能は、（B）表示されません。これは、空気中の印刷が大きな特徴では有用ですが、水で印刷が小さい特徴を持つパターンのために必要となる場合があります示しています。スケールバーは20μmである。 <table border="1"><tbody><tr><td> サイクル </td><td> 加速レート（回転数/秒） </td><td> 最終的なスピード（rpm） </td><td> 時間（s） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000年</td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> 表1。シリコンウェハ上にAZ9245の4.5μmの厚さのコーティングを作成するために使用される2つのサイクルのスピンプログラム。 パターニング基板の形成のためのPDMSスタンプを準備するには、フォトレジストのマスターは、まず（図1及び図4A）製造されています。マスターは、スタンプの逆数であり、どちらかの直接書き込みリソグラフィシステムやマスクアライナを使用して作成されます。このようなAZ9245としてポジ型フォトレジストは、、マスターの生産に使用される場合、レジストコートされたウェハは、最終的な基板上に表示される同じパターンで光にさらされている。それは常に可能ではないが、それはPDMSスタンプのマスターに最適なアスペクト比（厚さに抵抗する機能のサイズ）が1:2であることが報告されている。13我々は性質に応じて、1:40のアスペクト比が可能であることを発見したパターンの。条件下でのAZ9245被覆されたシリコンウェーハは、4.5μmの公称厚さのフォトレジストを与えるここで説明する。我々はAZ9245のこの厚さは&gt; 100ミクロンから2ミクロンまでの機能を持つPDMSのマスターを生成するために使用できることを見出した。 PDMSスタンプは、フォトレジスト（図2）から作製マスターを使用してSylgard 182（またはSylgard 184）からキャストされます。フォトレジストのマスターは、同じタイムスタンプの多くのコピーを作成するために、複数回使用することができます。硬化PDMS後は、スタンプがカミソリの刃と、結果のタイムスタンプを使用してマスターから削除されているガラスカバースリップ（図4B）にスタンプ機能の側を下に置くことにより、顕微鏡下で可視化することができる蛍光標識された蛋白質（図3、図5）のアプリケーションで視覚化できる、シャープでクリアな蛋白質パターンの適切なスタンピング結果。また、免疫組織化学は細胞固定後のタンパク質のパターン（図6）を視覚化するために使用されることがあります。細胞増殖はよく不死化細胞株および初代培養細胞（図5および6）の両方のタンパク質のパターンに限られている。 このテクニックは簡単にマスターされている一方で、いくつかの一般的な問題が発生する可能性があります。 DPBSで濃縮タンパク質溶液の十分な混合することなくタンパク質のアプリケーションは、不均一なタンパク質パターン（図7A）につながることができます。不適切なスタンプは、部分的なパターン転写やスタンプの崩壊（図7B - C）につながることができます。さらに、空気に吸着したタンパク質を含むパターン化基板を露光するバックグラウンドの減少抵抗（図7D）のマニュアルページを引き起こして単分子層を破壊することができます。非常に小さい特徴（&lt;5μm）と高アスペクト比で構成されるパターンは、多くの場合、水中マイクロコンタクトプリンティングを使用する必要があります。この手順（3.5b）水で（図8）パターンの外で基板上に堆積からhexadecanethiol防ぐために障壁として使用されます。14

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	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. 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A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

問題の数は、PDMSスタンプの作成に使用されるマスターのリソグラフィ製造で発生することができる。ぼんやりと不明瞭なパターンと拡大または欠落している機能は、レジストコートされたウェハの結果の露出過度のレジストコートされたウェハの結果の露出不足。小さな機能を持つマスターが光パターニングと開発のパラメータ（フォトレジストメーカーが推奨するパラメータを超えて）の...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>シリコンウェハ</td><td>ウェハは、サービスを再利用</td><td></td><td> 2インチ</td></tr><tr><td>スピンコーター/ホットプレート</td><td>ブリュワーサイエンス</td><td>シー200CBスピン=ベイクシステム</td><td></td></tr><tr><td> AZ9245フォトレジスト</td><td>メイズケミカルカンパニー</td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td>直接書き込みリソグラフィシステム</td><td>マイクロテックSRL </td><td> LW325 LaserWriterのシステム</td><td></td></tr><tr><td>マスクアライナ</td><td> HTG </td><td> 3時間</td><td></td></tr><tr><td> AZ 400K開発者</td><td>メイズケミカルカンパニー</td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25mmのない。 1ラウンドガラス製カバースリップ</td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td>プラズマ酸化剤</td><td>ディーナー</td><td>フェムト</td><td></td></tr><tr><td>チタン片カミス</td><td>組み込ま</td><td></td><td> 99.95パーセント純粋な</td></tr><tr><td>ゴールドペレット</td><td>カミス株式会社</td><td></td><td> 99.999パーセントの純粋な</td></tr><tr><td>電子ビーム蒸着</td><td>クルトJ. Lesker </td><td> PVD 75薄膜の成膜装置</td><td>電子ビームのアクセサリー付き</td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td>アルファAesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - mercaptoundec - 11 -イル）テトラ（エチレングリコール） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Pharmco - aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200プルーフ、絶対</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td>カルシウムとマグネシウムを含まない</td></tr><tr><td>マウスラミニンI </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン</td><td>インビトロジェン</td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647カルボン酸、スクシンイミジルエステル</td><td>インビトロジェン</td><td> - 20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTrackerによりレッド580 </td><td>インビトロジェン</td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350カルボン酸、スクシンイミジルエステル</td><td>インビトロジェン</td><td> - 10168 </td><td></td></tr><tr><td>抗ラミニン抗体</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

マイクロコンタクトプリンティングは、直接タンパク質、2 DNA、3、シラン、4自己の形成を含む分子の多数を、印刷するために採用できるが、マイクロコンタクトプリンティングは。明確に定義されたパターニング基板を作成するための迅速な、再現性の高い方法を提供する1金の上に長鎖アルカンチオールの組織化単分子膜は、（SAM）が接着剤と抵抗性領域を含む特定のパターンにタンパク質および細胞を閉じ込める簡単な方法を提供します。この閉じ込めは、細胞形態を制御するために使用され、タンパク質や細胞生物学のさまざまな質問を調べるときに有用であることができる。ここで、我々は、細胞の研究のための明確に定義されたタンパク質のパターンを作成するための一般的な方法を説明します5このプロセスは3つの手順を実行します。。のフォトリソグラフィを用いたパターニングされたマスターの製造、PDMSスタンプの作成 ​​、およびマイクロコンタクトプリンティング金を、コー​​ティングされた基板。一度パターン化された、これらの細胞培養基板は閉じこめタンパク質および/またはパターンの細胞（プライマリーセルまたはセルの行）が可能です。 自己組織化単分子膜の化学の使用は、パターン化されたタンパク質/細胞接着領域と非接着領域を正確に制御することができますが、これは、直接タンパク質のスタンプを使用して達成することができます。 Hexadecanethiol、マイクロコンタクトプリンティングのステップで使用される長鎖アルカンチオールは、容易に解から蛋白質を吸着する疎水性表面を生成します。基板の非印刷領域を埋め戻しに使用されるグリコール終端チオールは、タンパク質吸着、したがって細胞増殖に耐性が単分子層を作成します。6は、これらのチオール単量体が正確にサポートすることができる基板の領域を定義する高度に構造化された単分子膜を生成するタンパク質吸着と細胞増殖。その結果、これらの基板は、マイクロエレクトロニクスの創造に細胞間の動作7の研究から様々なアプリケーションに有用です。8 単分子層の化学の他のタイプを直接ガラス基板上にパターンを作成するトリクロロシランを用いて我々のグループからの作業を含む細胞培養研究用に使用されているが、金にアルカンチオールから形成された9柄の単層は、準備にストレートフォワードです。また、単層の調製に用いられるモノマーは、安定して市販されており、不活性雰囲気下で保管または処理は必要ありません。アルカンチオールから調製したパターニングされた基質は、細胞の閉じ込めを維持し、数回のリサイクルおよび再利用することができます。10

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K ビュー.  Washington University in St. Louis. 金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や?...

ビデオ: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

生物工学

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...