著者らは、実験室の消耗品の管理に彼女の援助のためにタミーEsmailiに感謝したいと思います。 AAはアルツハイマー病研究とケア、医学、エディス·コーワン大学の学校のための優秀センターから博士課程の奨学金の受賞者です。 MCは、ロータリークラブ、パースから博士の資金支援を受けています。 AM、GV、KTとRNMはマッカスカーアルツハイマー病研究財団によって資金を供給されています。

1。システムメンテナンス<ol><li>ゼブラフィッシュは、その連続してフィルタや健全な水環境のために必要な水質を維持するために、システムの水を曝気循環システムに保管されています。循環システムはまた、過剰な食品や魚の排泄物をフィルタリングするのに役立ちます。異なる会社は、ゼブラフィッシュシステムを提供するが、我々は我々の研究室で水生生息地、アメリカからシステムを使用しています。室温またはタンク温度は一般的に26から28.5の間に維持される℃、照明条件は、14時10分時（光：暗い）です。水生生息地からゼブラフィッシュシステム（ 例えば 、ベンチトップ·システム）のコストを削減〜9,000ドル。 2つの棚でこのベンチトップシステムは、各棚の上に6個の10リットル、3リットル12、または20 1.5リットルのタンクを保持することができます。魚の複数行が（ 例えば 、トランスジェニック、変異体、野生型）も同じシステムに収納することができる。 </li><li>フィルタのさまざまな種類のセットは、システムで使用されています。我々のシステムでは、すべてのタンクPAからの水タンクに戻して循環される前に120ミクロンのフィルターパッド、50ミクロンのキャニスターフィルター、生物ろ過、活性炭吸着フィルターとUV殺菌フィルターを通してsses。 De-chlorinated/aged水はゼブラフィッシュシステムで使用されています。水は、少なくとも48時間熟成させることにより脱塩素することができます。理想的な条件下では、水はそれを暖かく保つために水を循環させるポンプで貯水池内に保管され、脱塩素化を促進すべきである。 </li><li>システム水のpHは、毎日チェックして、6.8と7.5の間に維持されるべきである。必要な場合には、重炭酸ナトリウム、pHを増加させるために使用されるべきである。 </li><li>水槽は定期的に清掃する必要があります。 、水槽をきれいにこのタンクへの水の流れを閉じて、後方に傾斜させることによりタンクを余分な水分を排出し、システムから慎重にタンクを削除する。汚れや藻の成長はタンクの底と側面に明らかになるであろう。 </li><li>クリーンタンクにバッフルを配置し、脱塩素水（別名システムワシントンで埋めるTER）。慎重に魚のネットでこのタンクに魚を移す。ふたを閉め、タンクの名札を転送します。慎重にシステムにクリーンタンクを置き、給水に切り替える。 </li><li> 70％エタノールで漁網、スプレーを除染するために、水ですすぎ、再度使用する前にそれを乾燥させます。汚れたタンクからバッフルを取り外して、70％エタノールで両方の部分をスプレーします。水道水で洗い流し、タンクを許可し、再使用する前に完全に乾燥させることをさえぎっている。 </li><li>循環系フィルタは、それらの適切な機能を確保するため、定期的にチェックし、変更する必要があります。これらのフィルタは、すべての魚タンクに適切かつきれいな水の供給を確保するために定期的に変更する必要があります。 </li><li> 120ミクロンのフィルターパッドは通常、再配置または毎日交換され、新しいものと交換する前に、完全にそれを使用するように水流に向かって移動させます。 </li><li>キャニスターのフィルターは毎週変更する必要があります。キャニスターのフィルターを変更するには、antをねじることによって、フィルターユニットを取り外しレンチまたは手でiclockwise。水こぼれを防止したり、吸収するには、以下のプラスチックシートやタオルを置きます。必要に応じて新しいものとキャニスターのフィルターを交換して、システムにバックフィルターユニットに合わせて、慎重に手やレンチで締めます。 </li><li>カーボンフィルター（隔週）隔週に変更する必要があります。カーボンフィルターを変更するには、レンチで慎重にカーボンフィルターユニットを取り外します。使用される活性炭を捨てて、新しい活性炭と交換してください。カーボンホルダーを再セットして、フィルターユニットに戻してください。システムにフィルターユニットを元どおり取り付けます。システムの電源を入れ、水がフィルターに流れていることを確認してください。必要な場合は、システムにフィルターを取り付ける前に配管内の汚れをきれいにパイプを介していくつかの水をフラッシュします。 </li><li>生物学的なフィルタは、半年ごとに清掃する必要があります。生物学的なフィルタは、一般に、循環系におけるキャニスターとカーボンフィルターの間に位置している。生物ろ過、レムを変更するにはシステムからのフィルタユニットをオベ。圧力解放ボタンを押して、フィルタからの圧力を解放します。レンチで緩めてフィルタを。一般的に2人は、このステップのために必要とされる。フィルターユニットの蓋を外します。水からsiporaxを分離するためのふるいにかけた容器の中にフィルタの内容を空にします。注：Siporaxは硝化と脱硝の両方を実行する能力を持って細孔バイオフィルターメディアです。 </li><li> siporax汚れがひどい場合は新たに交換してください。システムの水（脱塩素水）とフィルターユニットを入れ、蓋を閉じ、システムおよび給水のスイッチにフィルターユニットを返す。注：順応水槽では、siporaxは、いくつかの硝化細菌のホームになります。これらの微生物は、水槽内の窒素循環を維持するために不可欠であり、生物学的フィルタ（ダーティsiporax）のプライマリハウジングを取り外すと、n個の中に亜硝酸スパイク、続いて深刻アンモニアスパイクにつながる可能性EW生物ろ過（新しいsiporax付き）を再確立しています。窒素サイクルのこれらの中間の状態の両方の生物に対して毒性がある可能性があり、かつ適切に応答しなかった場合、ゼブラフィッシュを殺すかもしれない。したがって、それは新しいsiporaxに、これらの重要な微生物の迅速な再増殖を可能にするために他の場所でゼブラフィッシュハウジングシステム（ 例えば 、水生生息地系における回収タンク内）の二次生物ろ過を行うことが重要です。 </li><li> UVフィルターは、システム生物学的汚染物質を（細菌など）を制御するために使用され、すべての九から十か月交換する必要があります。これは、UVフィルター殺菌線量率がランプの寿命の冒頭〜110 mJ / cm 2であり、線量率が故に、時間の経過とともに減少し、それがまだいるように見えても、世界中を交換する必要があることに留意すべきである機能。 </li></ol> 2。給餌<ol><li>ゼブラフィッシュは、幼虫tの100ミクロンから乾燥食品（食品·サイズで供給することができますO 300 /成魚）やライブ食品（ブラインシュリンプ）の400ミクロン。ブラインシュリンプ（ アルテミア属 ）の卵は地元のペットショップから入手可能であり、後述の簡単な手順に従うことによって実験室で孵化することができます。 <ol class="lalpha"><li>良好な溶解のためにマグネチックスターラー上で塩をビーカーを置くことによって、高齢者の水の中に赤い海の塩を溶かす。代わりに、塩は通気管とそれを通気することにより、水に溶解することができる。赤い海の塩が使用できない場合は即刻海塩は、孵化の溶液として使用することができます。ブラインシュリンプは、塩分濃度の広い範囲を容認することができますが、我々が30〜35 g / Lの赤海塩水に私たちのブラインシュリンプ（10.15 g）を孵化。注：ブラインシュリンプの卵は地元のペット店で容易に入手できない場合には、次にカプセル化されたブラインシュリンプもエビの孵化場に追加する前に、バッチ処理でそれらを &quot;脱キャップ&quot;の後に使用することができます。また、これはペットショップに頻繁に旅行を避けるかもしれない。 </li><li> SAとブラインシュリンプ·ハッチャーを埋めるltは、水と大さじ1.2 /リットルの濃度でシュリンプの卵を追加します。空気ポンプで激しくハッチャーを通気し、〜48時間孵化ブラインシュリンプの卵を残す。 注：それは非濃縮ブラインシュリンプは毎時ポスト孵化栄養価を失うことに留意すべきである。したがって、24時間かけてどちらハッチに適切であるか、ブラインシュリンプから最大限の栄養価を得るために、48時間かけて豊かにすることができる。 </li><li>孵化システムからの廃水は漂白剤で消毒し、後に処分される廃棄物の検疫に追加されます。 </li></ol></li><li>ブラインシュリンプを収集するには、空気管を​​取り外して、文化は4-5分ではなく10分以上のために解決することができます。孵化したブラインシュリンプは、ハッチャーの底に集める。 <ol class="lalpha"><li>ハッチャーの下部にタップを使用してブラインシュリンプを収集します。未孵化ブラインシュリンプの卵で構成されています初期の流れを捨ててください。 </li><li&gt;は捨てた後、未孵化ブラインシュリンプは、ゼブラフィッシュの餌として使用される孵化ブラインシュリンプを収集します。 </li><li>ブラインシュリンプの収集ネット（〜350ミクロンのナイロンメッシュ）を使用して、塩辛い水からブラインシュリンプを分離します。システムの水を使用して容器にネットからブラインシュリンプをすすぐ。 </li></ol></li><li>収集されたブラインシュリンプは、一般的にそれをむしろオレンジ色を与える容器の底に高濃度で存在している。 </li><li>ピペットまたはドロッパー/ squeezyボトルを使用してゼブラフィッシュにブラインシュリンプを養う。小出し餌の量は、個々のタンクの人口規模に応じて異なります。ゼブラフィッシュのために一般的に受け入れられている割合は、一日あたりの食品で体重の4％を受け取ることになっている。いくつかの魚は食べ過ぎが原因で死亡することもあるので、これは、おそらく彼らの繁殖、又は生存率に影響を与え、水の硝酸レベルを増加させることができるようにゼブラフィッシュはoverfedべきではありません。 <ol class="lalpha"><li>に食物を注入する際に水、空腹の魚はブラインシュリンプをキャッチするために泳ぐ。 </li></ol></li><li>乾燥餌は水生エコシステムの/水生生息地シンプルなSpringベースの魚の餌ディスペンサーを用いて行うことができる。代わりに、乾燥した給餌もシンプルスプーンを使用するか、またはそれを小さなスプーンのような見た目を与えるためにハサミで斜めにプラスチック製のスポイトを切断することによって行うことができます。 </li></ol> 3。繁殖<ol><li>光の発症時に繁殖を開始するゼブラフィッシュ。受精卵は、タンク内の飼育または繁殖ペアのいずれかを介して取得することができる。タンク内の繁殖がより労働効率的であり、我々の研究室で定期的な胚の収集のために実装されている間の遺伝子または変異が個々の魚から上映されるときに、繁殖ペアが好ましい。 </li><li>インタンク繁殖のため、タンク内のブリーダーを組み立てると光の発症後に水槽にゆっくりと落下。代わりに、タンク内の繁殖セットアップは水槽で一晩放置することができます。 </li><li> Lひさし約15分間タンク内のブリーダー魚がタンクからブリーダーを除去し、卵を収集する前に嵌合するようにします。 </li><li>ペアワイズ繁殖は通常、摂食した後に夕方に設定されています。 </li><li>繁殖水槽を組み立て、高齢者、システム水でそれを埋める。 </li><li>繁殖水槽の両側に一人の女性と男性の1を移す。雌は大きいため、その下腹部の男性と区別することができる。彼らは女性より色がもっとほっそりと暗くなりますので、男性も女性と区別することができる。また、男性は女性（ 図1を参照）に比べて尻鰭でより黄色に着色されています。迷ったときは女性のゼブラフィッシュの産卵管を探します（ 図4を参照）。 </li><li>まもなく光の発症後に翌朝分周器を取り外します。 20分間または胚十分な数のタンクの底部に敷設されるまでは邪魔されずに発生するように交配を許可します。 </li><li>繁殖した後、彼らのタンクに魚を戻す。ストレーナーを使って卵を集める。 </li><li>システムの水で十分に胚を洗浄します。 </li><li>胚培地でストレーナーを洗浄することによってシャーレに胚を移し、別名EM3塩（NaCl、13.7ミリメートル;のKCl、0.54ミリメートル;のMgSO 4、1.0mMの;のCaCl 2、1.3mMの;のNa 2 HPO 4、0.025ミリメートル; KH 2 PO 4、0.044ミリメートル; NaHCO 3を 、4.2 mm）です。 </li><li>胚を顕微鏡下で観察することができます。受精卵は、その後、針とピペット（ 図3を参照）を使用して未受精卵から分離される。 </li></ol> 4。幼虫の引き上げ<ol><li>幼虫が孵化するまで受精卵は72時間インキュベーター（〜28.5℃）に保管されています。 </li><li>今すぐ幼虫は絨毛膜の外であり、彼らはメイン水槽に転送することができます自由に泳ぐ。幼虫は5日後に受精（DPF）から供給する必要があり、胚媒体に保管されている（に記載された組成物パート3、10）またはシステム水。幼虫はそこに毎日のように変更された水の約50％以上で丸皿に維持することができる。水換えは、死んでいるか病気の幼虫や他の破片を除去することを含むべきである。 </li><li>小型バッフル（約300から400ミクロン）を含むタンクにそっと幼虫を転送します。死者と病気の幼虫は除去されるべきであり、水を数ミリリットルを毎日徐々に添加しなければならない。 </li><li> 14日後、幼虫タンクは、システムに棚上げにすることができ、循環水の小さな流れ（毎秒1〜2滴）を供給。幼虫が成長するにつれ、水の流れを増大させることができる。バッフルの異なるサイズは成魚に使用されるべき幼虫（ 例えばバッフルサイズは300から400、500、700から750、そして1000ミクロン）と、通常のプラスチック·バッフルの大きさに応じて使用することができます。 </li><li>胚は性的に成熟した大人へと成長することは通常3ヶ月かかります。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

ゼブラフィッシュは、インド北部のガンジス川に由来し、その成人とスペンスらによって審査幼虫2、両方の研究で普及しつつある。3。ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、メンテナンスのしやすさ、胚の光学クリアランス、急速な胚発生、低メンテナンスコストなどの他の動物モデルに比べていくつかの利点を有する。彼らは遺伝子操作6に従順で、4,5ハイスループット薬剤スクリーニングに適しています。彼らの受精は、発生生物学者による彼らの使用のために有利である外部にある。これらの有利な特性のために、ゼブラフィッシュは、遺伝学7、薬理8、行動研究9,10で人気を集めている。胚を取得するためにゼブラフィッシュ施設及びゼブラフィッシュの飼育を維持するために多くの課題があります。ここで、我々は、これらの課題とoに対処する私たちの経験と推奨事項について説明します繁殖と幼生の飼育、餌、システムメンテナンスのためのプロトコルをutline。 システム保守健康な状態でのゼブラフィッシュを維持するためには、適切に機能して水槽システム内の清潔な環境でそれらを提供することが重要です。この重要な部分は、すべてのタンクは、適切な水の流れときれいな水を受けるように、定期的にシステムのフィルタを変更しています。それはブロックされ、システムのパイプに起因する各タンクに循環水供給の失敗を回避することが不可欠である。閉塞が発生した場合、パイプがより高く、通常の水の圧力と流量を用いて洗浄することができます。理想的には、システム上の水の約10％が良好な水質を維持するために毎日交換する必要があります。キャニスターやカーボンフィルターを変化させながら、あるいは、水を交換することができます。これは、これらのフィルタを接続する配管に堆積している汚れが除去されることを保証します。水の水質を定期的にチェックする必要があります。このようなアルカリ度などのパラメータは、pHは、temperatURE、硬度、アンモニア、溶存酸素、塩分濃度、導電率は、システムの水（詳細については表2を参照）の品質を表す重要な要素として考慮されるべきである。せめて硝酸塩、pH、および温度は、ハウジングゼブラフィッシュのための良好な水質を確保するために、定期的に監視する必要があります。理想的な硝酸塩（NO 3 - ）濃度は&lt;50 mg / Lで11アール、高い場合は、これらのレベルは、新鮮なシステム水と循環系中の水を交換することによって減らすことができます。時折、フィルタはうまく適合し、それがフィルタ変更時に漏れがないか確認することをお勧めしますので、漏れはありません。メイン貯水池からの水の流れは水ポンプを変更したり、フィルタを変更した後、いずれかのブロックされた場合、水流はパイプに生成されている任意の真空を解放するために数秒間フィルターを緩めたり取り外したりするのいずれかの方法で復元することができます。フィルタを変更するのに必要な時間は、そのような生物学的な総荷重Oなどの様々な要因によって異なる可能性がありますnシステム、他のフィルタの清潔さ、汚れがパイプ内に堆積。彼らは汚れて見える場合、またはすべてのタンクが正しい水の供給を受けていない場合は、したがって、フィルタはすぐに変更してください。また、漁網を70％エタノールで洗浄し、それを除染するために水で洗浄し、再利用される前に乾燥させることをお勧めします。乾燥は、特に魚に有毒であるエタノールの蒸発を確実にします。 ゼブラフィッシュシステムのほとんどは脱塩素水道水を使用していますが、一部のシステムでは、脱イオン水を使用しています。これが魚は体塩を維持するために必要なエネルギーを減少させるので、300〜1,500μSとの間のシステム水の導電率を維持することが重要である。塩が最適な導電率のレベルを維持するために追加されていない限り、したがって、ゼブラフィッシュを脱イオン水に保つことができない。カーボンフィルターは、銅が削除されないため、水道水を使用する場合は、システムの水の可能性が高い銅濃度の危険があります。従って、uSERSは、銅の濃度を確認し、可能であれば銅の配管を避けるべきである。 給餌いくつかの魚は食べ過ぎが原因で死亡することもあるので、これは、おそらく彼らの繁殖11、または生存率に影響を与え、水の硝酸レベルを増加させることができるようにゼブラフィッシュはoverfedべきではありません。我々は魚のタンクが10分以内に完了することができますよりもいずれか授乳中なしより多くの食糧を提供することをお勧めします。それが過剰な塩分濃度は死を引き起こすとしてゼブラフィッシュにそれらを供給する前にブラインシュリンプから塩を除去することは非常に重要です。もっとゼブラフィッシュの卵が必要な場合には、魚は一日三回を供給することができます。毎日のブリーダー水槽を掃除しても産卵のレベルを向上させます。 水生生息地·システム上で供給する場合、我々は通常、魚は10分間の食品を食べることを許可するようにウォーターポンプと空気ポンプをオフにします。これは、フィルタに洗浄される食品の量を減少させる。ただし、ユーザーはREMに注意する必要がありますその後、再び、これらのポンプをオンにする燃えさし。 繁殖ゼブラフィッシュは、〜3、生後18カ月の間の最適な飼育条件で通常です。ペアワイズ育種は2日間連続で11のために実行すべきではありません。タンクが2日連続で飼育されている魚の同じ組の可能性を減らすことができ、多くの魚を保持することができますしかし、タンク内の繁殖は、毎日行うことができます。繁殖は卵が必要とされない場合でも、一定の間隔を置いて行われるべきである。このプロセスでは、魚の繁殖サイクルが維持されるようになります。それは繁殖セットアップで男性よりも女性がいることをお勧めします。男性ゼブラフィッシュはさらに、この勧告をサポートして毎日12上の女性パートナーを変更してください。さらに、我々の研究室の中で、我々は最初にセットアップ問題を解決する助け繁殖に男性よりも女性を使用して、しかし、繁殖の問題を経験した。また、高タンパクコンテと供給NTダイエットやブラインシュリンプは、二から三倍の日、別のタンク（別の親）からの混合魚、繁殖の温度は27〜28℃の間のセットアップ、保守、および使用して、ブロックされた卵巣管で女性の腹を絞る穏やかなマッサージさらに改良産卵。私たちは、兄弟間での繁殖を避けるために、魚のライン/起源の記録を保管することをお勧め。これは、さらに胚の生産性が向上します。各タンクから魚によって築かれた胚の数の記録を保存することも推奨します。これは最高の繁殖水槽を追跡し、産卵しない魚で繁殖を改善するための措置をとることを支援します。 幼虫の引き上げ幼虫の餌は5 DPF（日後に受精）から開始すべきである。若い幼虫は〜100サイズはミクロン（ 例えば 、ZM100）、またはそのようなゾウリムシやワムシ（成長を刺激する）など、ライブ食品の乾燥食品を供給することができます。食品の大きさを徐々に増加させることができる200ミクロン（ 例えば ZM200）または400分の300ミクロン（ 例えば ZM300）へ。成魚の人口は水のリットル当たり6から7の魚の周りでなければなりません。このような行為は、タンクへのBOD（生物学的酸素要求量）のより良いメンテナンスのために推奨されます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ循環システム</td><td>水生生息地、米国</td><td> AHABスタンドアロンのベンチトップシステム</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td>食べ物魚ディスペンサー/ドライ食品フィーダー</td><td>水生生息地、米国</td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td>乾燥食品</td><td> ZM食べ物魚、英国</td><td> ZM100、ZM200、ZM300 </td><td></td></tr><tr><td>ブラインシュリンプの卵</td><td>ソルトクリーク、Inc。、米国</td><td>プレミアムグレード</td><td></td></tr><tr><td>タンク内のブリーダー</td><td>水生生息地、米国</td><td> ITSTS- </td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>ペン·粘体プロカニ、米国</td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td>繁殖タンク</td><td>水生生息地、米国</td><td> SBTANK（1L） ブリーダータンク-2（2L） </td><td></td></tr><tr><td>赤い海塩</td><td>赤い海塩、米国</td><td>地元のペットショップ/ <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td>フィルタ（キャニスター、フィルターパッド、およびUV） </td><td>水生生息地、米国</td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporaxメディア</td><td>水生生息地、米国</td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td>ブラインシュリンプネット</td><td>水生生息地、米国</td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td>ブラインシュリンプ·ハッチャー</td><td>水生生息地、米国</td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td>バッフル</td><td>水生生息地、米国</td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1は、このプロトコルで使用される特定の試薬 ​​や機器の表。 </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの実験室の定期的ケアおよび保守について説明します。ゼブラフィッシュは現在、遺伝学、薬理学と行動研究で人気を集めている。脊椎動物のように、人間とゼブラフィッシュシェアかなりの遺伝子配列類似性および種々のヒト疾患状態の動物モデルとして使用されている。他の一般的な脊椎動物のモデルと比較して、ゼブラフィッシュの利点は、高い繁殖力、低メンテナンスコスト、透明な胚、かつ急速な発展があります。ゼブラフィッシュの研究への関心の拍車のために、生産的なゼブラフィッシュの住宅施設を設置し、及び維持する必要性も高まっている。文学はゼブラフィッシュの実験室のメンテナンスのために利用可能ですが、簡潔なビデオプロトコルが欠けている。このビデオでは、摂食飼育およびゼブラフィッシュ幼生の飼育、定期的な住宅のためのプロトコルを示しています。このプロセスは、研究者がzebrafisの自然な行動と最適な条件を理解するのに役立ちますH畜産それゆえ、魚の飼育条件に由来する実験的な問題のトラブルシューティングを行います。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの実験室を確立するために、また、動物モデルとしてゼブラフィッシュを使用しようとしている学生を卒業する予定の研究者にとって非常に助けになるでしょう。

ゼブラフィッシュハウジングおよびメンテナンスは、伝統的なげっ歯類のモ​​デルよりも容易かつ安価である。数千ゼブラフィッシュは、小さな実験室に収容することができる。このプロトコルの結果として、研究者は、ゼブラフィッシュに健康的な条件を提供するゼブラフィッシュ施設を管理できるようになります。また、次の図は、識別受精卵、成人ゼブラフィッシュ、そして彼らの食糧を支援します。男性のゼブラフィッシュ（ 図1A）とメスゼブラフィッシュ（ 図1B及び1C）のイラストは、研究者は男性と目的を繁殖のためにメスのゼブラフィッシュを容易に区別できるように示されている図2の顕微鏡ビュー描い; 12X（ 図でブラインシュリンプ2A）、90X（図2B）で単一ブラインシュリンプ、および90X（ 図2C）における未受精卵ブラインシュリンプの卵。これは小道具のための未受精卵と受精卵ブラインシュリンプの違いを理解するのに役立つだろうER送り目的。受精卵と未受精卵を図3に示します。 図3Aは、受精卵と未受精卵の胚の顕微鏡図を示す。未受精胚は、一般的に不透明であり、および/ ​​または絨毛膜内部破裂したセル（複数可）（黒矢印）で受精した胚をしながら無傷（ゼブラフィッシュ胚の別の段階の詳細な読書は1を参照）は、次の細胞分裂状態に成長して表示されます。受精卵と未受精卵は、それぞれ図3Bおよび3Cに示されている。 図4の高倍率のビューには、研究者は、男性と女性のゼブラフィッシュを区別しやすくするために女性のゼブラフィッシュの産卵管を示しています。 ゼブラフィッシュの実験室で発生する可能性のあるいくつかの重要な問題は、個々の/すべての住宅制度におけるタンク、悪い水質、循環系の配管や貯水池内の漏れへの水供給の閉塞を含む。加えて、繁殖から胚を得ることに問題は別の問題になる可能性があります。これらの問題のトラブルシューティングについては後述する。 <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：ゼブラフィッシュの雄（A）と雌のゼブラフィッシュ（A、B、C）のイラスト。 <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 12X（）、90X（B）の単一ブラインシュリンプ、および90X（C）での未受精卵ブラインシュリンプの卵でブラインシュリンプの顕微鏡写真。 <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="図3" /> 図3は2つだけ卵が無精卵アール受精卵と未受精卵の顕微鏡写真（16X）は、未受精卵は、黒い矢印（）で示しています。高倍率受精卵のビュー（90X）（B）と未受精卵（C）である。 <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：女性のゼブラフィッシュの産卵管（黒い矢印で示されている）イラスト。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> パラメーター </td><td fo:width="3in"> 最適範囲 </td></tr><tr><td>アルカリ度</td><td> 50から150 mg / LでのCaCO 3 </td></tr><tr><td> pHは</td><td> 6.8から7.5（6.0から8.5までは許容） </td></tr><tr><td>温度</td><td> 26から28.5°C </td></tr><tr><td>硬さ</td><td> 50から100 mg / LでのCaCO 3 </td></tr><tr><td>非イオン化アンモニア</td><td> &lt;0.02 mg / Lで</td></tr><tr><td>硝酸イオン（NO 3 - ） </td><td> &lt;50 mg / Lで</td></tr><tr><td>亜硝酸塩（NO 2で- ） </td><td> &lt;0.1 ​​mg / Lで</td></tr><tr><td>溶存酸素</td><td> &gt; 6.0 mg / Lで</td></tr><tr><td>塩分濃度</td><td> 0.5〜1グラム/リットル</td></tr><tr><td>導電率</td><td> 300 -1500μS </td></tr></tbody></table> 表2。水質パラメータ。水質パラメータ。ゼブラフィッシュ水槽11内の環境パラメータの最適範囲。

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Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの飼育に最適な条件を維持するために定期的なメンテナンスやケアについて概説します。ビデオでは、システムの保守、定期的な住宅、給餌、繁殖、およびゼブラフィッシュ幼生の引き上げのためのプロトコルを示しています。

ゼブラフィッシュの定期的ケアとメンテナンス（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）研究所：はじめに

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.4K ビュー.  Edith Cowan University. このプロトコルは、ゼブラフィッシュの飼育に最適な条件を維持するために定期的なメンテナンスやケアについて概説します。ビデオでは、システムの保守、定期的な住宅、給餌、繁殖、およびゼブラフィッシュ幼生の引き上げのためのプロトコルを示しています。

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

生物学

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

幼虫の心臓の解剖、少年と大人ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュ</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

哺乳類セルラインの嫌気性成長と維持

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.