Les auteurs tiennent à remercier Tammy Esmaili pour son aide dans la gestion des consommables de laboratoire. AA est le récipiendaire d&#39;une bourse de doctorat du Centre d&#39;excellence pour la recherche sur les maladies d&#39;Alzheimer et de soins, École des sciences médicales, Université Edith Cowan. MC reçoit doctorat soutien financier du Rotary Club, Perth. AM, GV, KT, et RNM sont financés par la Fondation de recherche de la maladie d&#39;Alzheimer McCusker l&#39;.

1. Maintenance du système <ol><li> Le poisson zèbre sont conservés dans un système de circulation que les filtres en continu et aère l&#39;eau du système pour maintenir la qualité de l&#39;eau requise pour un environnement aquatique sain. Le système de circulation permet également de filtrer l&#39;excès de nourriture et les excréments des poissons. Différentes entreprises de fournir des systèmes de poisson zèbre, mais nous utilisons des systèmes d&#39;habitats aquatiques, USA, notre laboratoire. La température ambiante ou la température du réservoir est généralement maintenue entre 26 à 28,5 ° C et les conditions d&#39;éclairage sont 14:10 h (lumière: obscurité). Un système de poisson-zèbre habitats aquatiques (par exemple, le système de table) Frais de ~ 9.000 USD. Ce système de table avec deux étagères peut contenir six 10 litres, douze de 3 litres, soit vingt de 1,5 litres réservoirs sur chaque étagère. Plusieurs lignes de poissons (par exemple, transgénique, mutant, type sauvage) peuvent également être hébergés sur le même système. </li><li> Un ensemble de différents types de filtres sont utilisés dans le système. Dans notre système, l&#39;eau de tous les réservoirs passes par un 120-microns tampon filtrant, 50-micron Cartouche de filtre, filtre biologique, l&#39;absorption du carbone actif désinfection UV et filtre filtre avant d&#39;être remis en circulation dans le réservoir. De-chlorinated/aged eau est utilisée dans le système de poisson-zèbre. L&#39;eau peut être dé-chlorée par le vieillissement pendant au moins 48 heures. Dans des conditions idéales, l&#39;eau doit être conservée dans un réservoir avec une pompe de circulation de l&#39;eau pour le garder chaud, et d&#39;accélérer le dé-chloration. </li><li> Le pH de l&#39;eau du système doivent être contrôlés quotidiennement et maintenu entre 6,8 et 7,5. Le cas échéant, de bicarbonate de sodium doit être utilisé pour augmenter le pH. </li><li> Réservoirs de poissons doivent être nettoyés régulièrement. Pour nettoyer un réservoir de poissons, fermer le débit d&#39;eau dans ce réservoir, vider l&#39;excès d&#39;eau en inclinant le réservoir vers l&#39;arrière et retirez soigneusement le réservoir du système. La croissance des algues et la saleté sera apparent sur le fond et les côtés de la cuve. </li><li> Placez le déflecteur dans un réservoir propre, et remplir avec de l&#39;eau chlorée de (aka Système water). Transférer délicatement le poisson dans ce réservoir avec un filet de pêche. Fermer le couvercle et transférer le nom de tag dans le réservoir. Placez soigneusement le réservoir propre dans le système et de l&#39;alimentation en eau. </li><li> Pour décontaminer le filet de pêche, spray avec de l&#39;éthanol à 70%, rincer à l&#39;eau et laisser sécher avant de la réutiliser. Retirez le déflecteur du réservoir sale et pulvériser les deux parties avec de l&#39;éthanol à 70%. Rincer abondamment avec de l&#39;eau du robinet et laisser le réservoir et le déflecteur sécher complètement avant de la réutiliser. </li><li> Les filtres du système de circulation doivent être vérifiés et changés régulièrement pour s&#39;assurer de leur bon fonctionnement. Ces filtres doivent être changés régulièrement pour assurer un approvisionnement adéquat de l&#39;eau propre et à tous les aquariums. </li><li> Le pavé de 120 microns est généralement déplacés ou remplacés tous les jours; repositionner vers l&#39;écoulement de l&#39;eau pour l&#39;utiliser complètement avant de le remplacer par un nouveau. </li><li> Le filtre Canister doit être changé chaque semaine. Pour changer le filtre à cartouche, retirez le filtre en le tournant fourmiiclockwise avec une clé ou les mains. Placez une feuille de plastique ou une serviette en dessous pour éviter ou absorber les déversements d&#39;eau. Remplacez le filtre à cartouche par une neuve puis remonter le filtre à l&#39;unité dans le système, serrez soigneusement les mains et une clé si nécessaire. </li><li> Le filtre à charbon doit être remplacé tous les quinze jours (toutes les deux semaines). Pour changer le filtre à charbon, retirez l&#39;unité de filtre à charbon soigneusement avec une clé. Jeter le carbone actif utilisé et le remplacer par du charbon actif neuf. Remonter le porte-balai et le placer dans l&#39;unité de filtration. Remettre le filtre à l&#39;unité dans le système. Allumez le système et vérifiez que l&#39;eau coule dans le filtre. Si nécessaire, rincer un peu d&#39;eau dans les tuyaux pour nettoyer la saleté dans les tuyaux avant de reposer le filtre dans le système. </li><li> Le filtre biologique doit être nettoyé tous les six mois. Un filtre biologique est généralement située entre le réservoir et le filtre de carbone dans le système de circulation. Pour changer le filtre biologique, remove l&#39;unité de filtration à partir du système. Relâchez la pression du filtre en appuyant sur le bouton de dégagement de pression. Dévisser le filtre avec une clé. En général, deux personnes sont nécessaires pour cette étape. Retirez le couvercle de l&#39;unité filtre. Vider le contenu du filtre dans un récipient tamisée pour séparer la siporax de l&#39;eau. Remarque: siporax est une amende pores bio-filtre des médias qui a la capacité de réaliser la nitrification et la dénitrification. </li><li> Si le siporax est très sale, le remplacer par une nouvelle. Remplir le filtre avec de l&#39;eau du système (de l&#39;eau chlorée), fermer le couvercle, retourner l&#39;appareil au système de filtre et mettez l&#39;approvisionnement en eau. Remarque: Dans un aquarium acclimaté, le siporax sera le foyer de plusieurs bactéries nitrifiantes. Ces micro-organismes sont essentiels pour le maintien du cycle de l&#39;azote dans l&#39;aquarium, et retirer le boîtier principal pour le filtre biologique (le siporax sale) pourrait entraîner un pic d&#39;ammoniaque grave, suivie d&#39;un pic de nitrite alors que le new filtre biologique (avec siporax nouveau) est le rétablissement. Ces deux états intermédiaires du cycle de l&#39;azote peut être toxique pour les organismes aquatiques, et peut tuer les poissons zèbres s&#39;il n&#39;est pas répondu de façon appropriée. Par conséquent, il est important d&#39;avoir un filtre biologique secondaire ailleurs dans le système de logement poisson zèbre (par exemple, dans le réservoir de collecte dans le système habitats aquatiques) afin de permettre le repeuplement rapide de ces micro-organismes importants sur le siporax nouvelle. </li><li> Les filtres UV sont utilisés pour contrôler les contaminants biologiques système (comme les bactéries) et doit être remplacé tous les mois neuf à dix. Il convient de noter que le taux filtre UV dose de désinfection est ~ 110 mJ / cm 2 au début de la vie de la lampe et le débit de dose diminue au cours du temps, il est donc nécessaire de remplacer le monde même quand il semble être encore en fonctionnelle. </li></ol> 2. Alimentation <ol><li> Le poisson zèbre peut être alimenté avec des aliments secs (taille de 100 microns alimentaire pour les larves to 300/400 microns pour les poissons adultes) ou des aliments vivants (crevettes de saumure). Saumure de crevettes (Artemia sp.) Œufs sont disponibles dans les animaleries locales et peuvent éclore dans le laboratoire en suivant les étapes simples décrites ci-dessous. <ol class="lalpha"><li> Dissoudre le sel dans l&#39;eau de mer rouge vieilli en plaçant le becher avec du sel sur un agitateur magnétique pour une meilleure solubilité. En variante, le sel peut être dissous dans l&#39;eau en l&#39;aérant avec le tube d&#39;aération. Sel marin instantanée peut également être utilisé comme une solution d&#39;incubation si le rouge sel de mer n&#39;est pas disponible. Crevettes de saumure peut tolérer une large gamme de salinité, mais nous éclosent notre crevette de saumure (10-15 g) dans 30-35 g / L d&#39;eau rouge sel marin. Remarque: En cas oeufs d&#39;artémias sont pas facilement disponibles dans les magasins d&#39;animaux locaux, puis les crevettes de saumure encapsulées peuvent également être utilisés après &quot;décapsuler&quot; les en lots avant de les ajouter à l&#39;écloserie de crevettes. Cela pourrait aussi éviter de fréquents voyages à l&#39;animalerie. </li><li> Remplissez le éclosoir crevette de saumure avec salt d&#39;eau et ajouter les oeufs de crevettes à une concentration de 1,2 cuillères à soupe / litre. Aérer l&#39;éclosoir vigoureusement avec une pompe à air et laisser les oeufs d&#39;artémias à éclore pour ~ 48 h. Remarque: Il convient de noter que non enrichi la crevette de saumure perdre de la valeur nutritive toutes les heures après l&#39;éclosion. Par conséquent, il peut être approprié de trappe, soit plus de 24 heures ou d&#39;enrichir pendant 48 h afin d&#39;obtenir la valeur maximale nutritionnel de la crevette de saumure. </li><li> Les eaux usées provenant du système d&#39;incubation est ajouté à la quarantaine des déchets à désinfecter l&#39;eau de Javel et éliminés par la suite. </li></ol></li><li> Pour collecter les crevettes de saumure, retirez le tuyau d&#39;air et permettre à la culture de se contenter de 4-5 min, mais pas plus de 10 min. Les crevettes de saumure éclos arriver au bas de l&#39;Hatcher. <ol class="lalpha"><li> Recueillir les crevettes de saumure à l&#39;aide du robinet au bas de l&#39;éclosoir. Jeter l&#39;effluent initial qui consiste non éclos des oeufs d&#39;artémias. </li><li&gt; Après avoir jeté les crevettes de saumure non éclos, de recueillir les artémias éclos qui seront utilisés comme aliments du poisson zèbre. </li><li> Séparez les crevettes de saumure de l&#39;eau salée, avec un filet collection artémia (~ 350 mesh nylon micron). Rincez les crevettes de saumure sur le net dans un récipient avec de l&#39;eau du système. </li></ol></li><li> Les crevettes de saumure recueillies sont généralement présents en concentration élevée dans le bas du récipient en lui donnant une couleur plutôt orange. </li><li> Nourrissez les crevettes de saumure de poisson zèbre à l&#39;aide d&#39;une pipette ou d&#39;un flacon compte-gouttes / squeezy. La quantité de nourriture distribuée dépend de la taille de la population de réservoirs individuels. Le ratio communément admis pour le poisson zèbre est de recevoir 4% du poids corporel en nourriture par jour. Le poisson zèbre ne doit jamais être suralimenté car cela peut augmenter le niveau de nitrates dans l&#39;eau, qui pourrait affecter leur reproduction, ou la viabilité, comme certains poissons peuvent mourir en raison de la suralimentation. <ol class="lalpha"><li> Lors de l&#39;injection de la nourriture dans lel&#39;eau, les poissons affamés nager pour attraper les crevettes de saumure. </li></ol></li><li> Alimentation sèche peut être réalisée en utilisant un Aquatic Eco-System / habitats aquatiques simples à base de ressort distributeur de nourriture pour poissons. Alternativement, l&#39;alimentation sèche peut également être effectuée à l&#39;aide d&#39;une cuillère simple ou en coupant un compte-gouttes en plastique en diagonale avec des ciseaux pour lui donner l&#39;apparence d&#39;une petite cuillère. </li></ol> 3. Élevage <ol><li> Poisson-zèbre lancer la reproduction à l&#39;apparition de la lumière. Les œufs fécondés peut être obtenue soit par en-bac d&#39;élevage ou de reproduction par paires. Alors que dans le réservoir d&#39;élevage est plus de travail efficace et est mis en œuvre pour la collecte des embryons régulière dans notre laboratoire, la sélection par paires est préférable lorsque les gènes ou mutations seront projetés sur chaque poisson. </li><li> Pour en bac d&#39;élevage, l&#39;éleveur monter dans le réservoir et descendre lentement dans le réservoir de poissons après l&#39;apparition de la lumière. Alternativement, dans le réservoir d&#39;élevage set-up peut être laissé toute la nuit dans l&#39;aquarium. </li><li> Lavant-toit de l&#39;éleveur dans le réservoir pendant environ 15 minutes pour permettre aux poissons de s&#39;accoupler avant de retirer le sélectionneur de la cuve et la collecte des œufs. </li><li> Élevage paire est généralement mis en place à la fin de l&#39;après-midi après le repas. </li><li> Assemblez le réservoir d&#39;élevage et de le remplir avec de l&#39;eau du système vieilli. </li><li> Transfert d&#39;une femelle et un mâle sur les côtés opposés de l&#39;aquarium de reproduction. Les femelles se distinguent des mâles en raison de leur plus grand ventre. Les mâles peuvent aussi être distingués des femelles parce qu&#39;ils sont plus minces et de couleur plus foncée que les femelles. En outre, les mâles ont une coloration plus jaune dans la nageoire anale chez les femmes (voir figure 1). En cas de doute regard de l&#39;ovipositeur femelle chez le poisson zèbre (voir Figure 4). </li><li> Enlevez le séparateur, le lendemain matin, peu après l&#39;apparition de la lumière. Permettre l&#39;accouplement de se produire au repos pendant 20 minutes, ou jusqu&#39;à un nombre suffisant d&#39;embryons sont fixées au fond de la cuve. </li><li> Après l&#39;accouplement,retourner le poisson à leurs chars. Ramassez les oeufs à l&#39;aide d&#39;une passoire. </li><li> Laver les embryons abondamment à l&#39;eau du système. </li><li> Transférer les embryons dans une boîte de Pétri par rinçage du filtre avec un milieu embryon; autre titre EM3 (NaCl, 13,7 mM; KCl, 0,54 mM; MgSO 4, 1,0 mM; CaCl 2, 1,3 mM, Na 2 HPO 4, 0,025 mM; KH 2 PO 4, 0,044 mM; NaHCO 3, 4,2 mM). </li><li> Les embryons peuvent être observées sous un microscope. Les œufs fécondés sont ensuite séparés des œufs non fécondés à l&#39;aide d&#39;une aiguille et d&#39;une pipette (voir figure 3). </li></ol> 4. Élevage de larves <ol><li> Les œufs fécondés sont maintenus dans un incubateur (~ 28,5 ° C) pendant 72 heures jusqu&#39;à ce que les larves éclosent. </li><li> Maintenant, les larves sont hors du chorion et la natation librement, ils sont prêts à transférer à un aquarium principal. Les larves ont besoin d&#39;être nourris de 5 jours post-fécondation (dpf) et sont conservés dans le milieu de l&#39;embryon (composition décrite dansLa pièce 3, 10) ou de l&#39;eau du système. Les larves peuvent être conservés dans des boîtes rondes avec environ 50% d&#39;eau ou plus y changer sur une base quotidienne. Le changement d&#39;eau devraient inclure la suppression des larves mortes ou malades et tout autre débris. </li><li> Transférer les larves doucement dans une cuve contenant un déflecteur de petite taille (de l&#39;ordre de 300-400 microns). Larves mortes ou malades doivent être enlevés et quelques millilitres d&#39;eau doit être ajoutée lentement sur une base quotidienne. </li><li> Après 14 jours, les réservoirs de larves peuvent être rangés dans le système, et fourni avec un petit jet d&#39;eau à vélo (1-2 gouttes par seconde). Que les larves grandissent, le débit d&#39;eau peut être augmentée. Différentes tailles de chicanes peuvent être utilisés en fonction de la taille des larves (taille chicane par exemple, 300-400, 500, 700-750, et 1000 microns) et un déflecteur en plastique normale doit être utilisée pour les poissons adultes. </li><li> Il faut généralement 3 mois pour les embryons de se développer en adulte sexuellement mature. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Poisson-zèbre proviennent du Gange dans le nord de l&#39;Inde et gagnent en popularité dans la recherche, tant dans leur stades adultes et larvaires 2, examiné par Spence et al. 3. Le poisson zèbre possède plusieurs avantages par rapport aux modèles d&#39;autres animaux tels que les taux de fécondité élevé, facilité d&#39;entretien, la clairance optique d&#39;embryons, rapide développement de l&#39;embryon, et faible coût d&#39;entretien. Ils se prêtent à la manipulation génétique 6 et approprié pour le dépistage des drogues à haut débit 4,5. Leur fécondation est externe qui est avantageux pour leur utilisation par les biologistes du développement. En raison de ces caractéristiques favorables, le poisson zèbre gagnent en popularité en génétique 7, pharmacologique 8, et la recherche comportementale 9,10. Il ya un certain nombre de défis au maintien d&#39;un centre d&#39;élevage de poisson zèbre et le poisson-zèbre d&#39;obtenir des embryons. Ici, nous décrivons nos expériences et recommandations pour relever ces défis et oPERÇU un protocole pour la maintenance du système, l&#39;alimentation, reproduction et l&#39;élevage des larves. La maintenance du système Pour maintenir le poisson-zèbre en bonne santé, il est important de leur fournir un environnement propre aquarium dans un système qui fonctionne correctement. Une partie importante de ce système est de changer les filtres régulièrement afin que tous les réservoirs reçoivent écoulement de l&#39;eau et de l&#39;eau propre. Il est essentiel d&#39;éviter l&#39;échec du cycle d&#39;approvisionnement en eau dans chaque réservoir en raison de conduites du système bloqués. Les tuyaux peuvent être nettoyées avec un débit supérieur à la pression d&#39;eau normale et si le blocage se produit. Idéalement, environ 10% de l&#39;eau du système doivent être remplacés tous les jours pour maintenir la qualité de l&#39;eau. Sinon, l&#39;eau peut être remplacée lors du changement de la cuve du filtre ou de carbone. Cela garantit que la saleté déposée dans les tuyaux de raccordement de ces filtres est retiré. La qualité de l&#39;eau doivent être vérifiés sur une base régulière. Des paramètres tels que l&#39;alcalinité, le pH, tempéraure, de la dureté, de l&#39;ammoniac, l&#39;oxygène dissous, la salinité et la conductivité doit être considéré comme des facteurs importants dans la représentation de la qualité de l&#39;eau du système (voir le tableau 2 pour plus de détails). Au moins, nitrate, pH et la température doit être surveillée sur une base régulière afin d&#39;assurer une bonne qualité de l&#39;eau pour le poisson zèbre logement. Nitrate idéal (NO 3 -) sont les niveaux de &lt;50 mg / l 11, et si ces niveaux élevé peut être réduit en remplaçant l&#39;eau circulant dans le système avec de l&#39;eau fraîche système. De temps en temps, les filtres ne cadrent pas bien et fuir il est donc recommandé de vérifier la présence de fuites après un changement de filtre. Si le débit d&#39;eau à partir du réservoir principal est bloquée après avoir changé supporte la pompe à eau ou un changement de filtre, le débit d&#39;eau peut être rétablie en supporte le desserrage ou le retrait du filtre pendant quelques secondes afin de supprimer toute vide est généré dans les tuyaux. Le temps nécessaire pour changer les filtres peut varier en fonction de divers facteurs tels que la charge totale biologiques on le système, la propreté des filtres autres, et la saleté déposée dans les tuyaux. Par conséquent, les filtres doivent être changés immédiatement si elles sont sales ou si tous les réservoirs ne reçoivent pas l&#39;alimentation en eau correcte. Il est également recommandé que le filet de poisson être nettoyé avec 70% d&#39;éthanol, et on le rince à l&#39;eau pour le décontaminer, et les laisser sécher avant d&#39;être réutilisés. Le séchage permet l&#39;évaporation de l&#39;éthanol qui est par ailleurs toxique pour les poissons. La plupart des systèmes de poisson zèbre utiliser de l&#39;eau chlorée du robinet, mais certains systèmes utilisent de l&#39;eau déminéralisée. Il est important de garder la conductivité de l&#39;eau du système entre 300 et 1.500 ~ uS car cela réduit l&#39;énergie le poisson a besoin pour maintenir sels de corps. Par conséquent, le poisson zèbre peut pas être conservés dans de l&#39;eau déminéralisée à moins que les sels sont ajoutées pour maintenir les niveaux de conductivité optimale. Il ya un risque de possibles concentrations élevées de cuivre dans l&#39;eau du système si l&#39;eau du robinet est utilisée parce que le filtre à charbon ne pas retirer le cuivre. Par conséquent, ul faut vérifier les concentrations de cuivre et d&#39;éviter la tuyauterie en cuivre si possible. Alimentation Le poisson zèbre ne doit jamais être suralimenté car cela peut augmenter le niveau de nitrates dans l&#39;eau, qui pourrait affecter leur reproduction 11, ou de la viabilité, comme certains poissons peuvent mourir en raison de la suralimentation. Nous recommandons de fournir plus de nourriture durant toute une que l&#39;alimentation d&#39;un réservoir de poissons peut finir dans les 10 min. Il est très important d&#39;enlever le sel des crevettes de saumure avant de les introduire dans le poisson zèbre comme la concentration de sel en excès provoque la mort. Si œufs de poisson zèbre de plus sont nécessaires, les poissons peuvent être nourris trois fois par jour. Nettoyage des réservoirs de poissons reproducteurs jour améliore également les niveaux de la production d&#39;œufs. Lors de l&#39;alimentation sur les systèmes d&#39;habitats aquatiques nous avons l&#39;habitude éteindre la pompe à eau et la pompe à air pour permettre aux poissons de manger la nourriture pendant 10 min. Cela diminue la quantité de nourriture qui est lavé dans les filtres. Toutefois, les utilisateurs doivent faire attention à rembraise pour allumer ces pompes par la suite. Élevage Le poisson zèbre sont généralement à condition d&#39;élevage optimal entre ~ 3 et 18 mois d&#39;âge. Élevage paire ne doit pas être effectué pendant deux jours consécutifs 11, mais en aquarium de reproduction peut être effectuée quotidiennement comme un réservoir peut contenir de nombreux poissons qui réduit les risques de la même paire de poissons sont élevés pendant deux jours dans une rangée. La sélection doit être effectuée à intervalles réguliers, même si les œufs ne sont pas nécessaires. Ce processus permettra d&#39;assurer le cycle de reproduction des poissons est maintenue. Il est recommandé qu&#39;il ya plus de femmes que d&#39;hommes dans un élevage de set-up. Le poisson-zèbre mâle changer leurs partenaires féminines sur une base de 12 jours qui vient appuyer davantage cette recommandation. Par ailleurs, au sein de notre laboratoire, nous avons d&#39;abord eu des problèmes avec l&#39;élevage, cependant, l&#39;utilisation de plus de femmes que d&#39;hommes dans un élevage set-up a aidé à résoudre le problème. En outre, une alimentation avec une haute teneur en protéines content alimentation et des artémias deux à trois fois par jour, à mélanger le poisson de différentes cuves (de parents différents), le maintien de la température de l&#39;élevage set-up entre 27 et 28 ° C, et en serrant le ventre des femelles avec des tubes ovaires bloqués à l&#39;aide massage doux encore amélioré la production d&#39;œufs. Nous vous recommandons de conserver une trace de lignées de poissons / origines pour éviter la consanguinité entre frères et sœurs. Cela améliore la production d&#39;embryons. Tenir un registre du nombre d&#39;embryons pondus par les poissons de chaque citerne est également recommandée. Cela aide à garder une trace des meilleurs réservoirs de poissons d&#39;élevage et de prendre des mesures pour améliorer la reproduction chez les poissons pondent pas. Élevage de larves L&#39;alimentation des larves devrait commencer à partir de 5 dpf (après la fécondation jours). Les jeunes larves peuvent être nourris avec des aliments secs de ~ 100 microns (par exemple, ZM100) ou des aliments vivants tels que les paramécies et les rotifères (qui stimule la croissance). La taille des aliments peut être augmentée lentementà 200 microns (par exemple ZM200) ou 300/400 microns (par exemple ZM300). Une population de poissons adultes devrait être environ 6-7 poissons par litre d&#39;eau. Cette pratique est recommandée pour un meilleur entretien de la DBO (demande biologique en oxygène) dans les réservoirs.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td></td></tr><tr><td> Le poisson zèbre système de circulation </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> Achab autonome, paillasse systèmes </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Distributeur de nourriture pour poissons / chargeur de nourriture sèche </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Olympe </td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td> Nourriture sèche </td><td> Nourriture pour poissons ZM, Royaume-Uni </td><td> ZM100, ZM200, ZM300 </td><td></td></tr><tr><td> Oeufs d&#39;artémias </td><td> Salt Creek, Inc, USA </td><td> Premium Grade </td><td></td></tr><tr><td> En antichars éleveurs</td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> ITSTS-A </td><td></td></tr><tr><td> Le charbon actif </td><td> Penn-Plax Pro-crabe, USA </td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td> Bassins d&#39;élevage </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> SBTANK (1L) Eleveur Réservoir-2 (2L) </td><td></td></tr><tr><td> Rouge sel de mer </td><td> Rouge sel de mer, Etats-Unis </td><td> Animalerie locale / <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Filtres (traîneau, tampons filtreurs et UV) </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporax médias </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td> Filet à crevettes de saumure </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td> Éclosoir crevette de saumure </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td> Chicanes </td><td> Habitats aquatiques, États-Unis </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Tableau des réactifs spécifiques et des équipements utilisés dans le présent protocole. </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

Ce protocole décrit les soins et l&#39;entretien régulier d&#39;un laboratoire de poisson zèbre. Le poisson zèbre sont en train de gagner en popularité dans la génétique, la recherche pharmacologique et comportementale. Comme un vertébré, la part de poisson zèbre grande similarité de séquences génétiques avec les humains et sont utilisés comme modèle animal pour diverses pathologies humaines. Les avantages de poisson zèbre par rapport à d&#39;autres modèles vertébrés communs incluent une fécondité élevée, faible coût d&#39;entretien, les embryons transparents, et le développement rapide. En raison de l&#39;éperon d&#39;intérêt dans la recherche du poisson zèbre, la nécessité d&#39;établir et de maintenir une installation de production du poisson zèbre logement est également en augmentation. Bien que la littérature est disponible pour l&#39;entretien d&#39;un laboratoire de poisson zèbre, un protocole vidéo concise fait défaut. Cette vidéo illustre le protocole pour le logement, l&#39;alimentation, la reproduction et l&#39;élevage des larves de poisson zèbre. Ce processus aidera les chercheurs à comprendre les comportements naturels et des conditions optimales de zebrafish élevage et donc de résoudre les problèmes expérimentaux qui proviennent des conditions d&#39;élevage de poissons. Ce protocole sera d&#39;un grand secours pour les chercheurs envisagent de créer un laboratoire de poisson-zèbre, et aussi à des étudiants diplômés qui ont l&#39;intention d&#39;utiliser le poisson zèbre comme modèle animal.

Logements poisson zèbre et l&#39;entretien est plus facile et moins cher que les modèles de rongeurs traditionnels. Plusieurs milliers poisson zèbre peut être logé dans un petit laboratoire. À la suite de ce protocole, les chercheurs seront en mesure de gérer une installation poisson zèbre qui offrira des conditions saines pour le poisson-zèbre. En outre, les illustrations suivantes vous aideront à identifier les œufs fécondés, poisson zèbre adulte, et leur nourriture. Une illustration d&#39;un poisson zèbre mâle (figure 1A) et le poisson-zèbre femelle (figure 1B et 1C) est indiqué pour aider les chercheurs distinction entre un mâle et une femelle pour la reproduction du poisson zèbre objectif figure 2 représente une vue microscopique de;. Crevettes de saumure à 12X (figure 2A), une crevette de saumure unique à 90X (figure 2B), et d&#39;un ovule non fécondé la saumure de crevettes à 90X (figure 2C). Cela vous aidera à comprendre la différence entre les crevettes de saumure non fertilisés et fertilisés pour propfins d&#39;alimentation er. Les œufs fécondés et non fécondés sont présentés dans la figure 3. Figure 3A illustre une vue microscopique des embryons fécondés et non fécondés. Embryons non fécondés sont généralement opaques et / ou avec la cellule de rupture (s) à l&#39;intérieur du chorion (flèche noire), tandis que les embryons fécondés semble intact et de plus en plus à l&#39;état de division cellulaire suivant (pour la lecture détaillée des différentes étapes du embryons de poisson zèbre voir 1). Vue d&#39;un plus fort grossissement Figure fécondé et un ovule non fécondé est montré sur la figure 3B et 3C, respectivement. 4 illustre un poisson zèbre ovipositeur femelle pour aider les chercheurs à établir une distinction entre un mâle et une femelle zèbre. Plusieurs problèmes critiques qui pourraient se produire dans un laboratoire de poisson zèbre comprennent le blocage de l&#39;approvisionnement en eau à l&#39;individu / tous les réservoirs du système de logement, la qualité médiocre de l&#39;eau, et les fuites dans les tuyaux ou réservoirs du système de circulation. En outre,difficultés à obtenir des embryons de l&#39;élevage pourrait être une autre préoccupation. Dépannage de ces questions est traitée ci-dessous. <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Une illustration d&#39;un poisson zèbre mâle (A) et femelle poisson zèbre (B, C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Vue microscopique de crevettes de saumure à 12X (A), une crevette de saumure unique à 90X (B), et d&#39;un ovule non fécondé la saumure de crevettes à 90X (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Vue microscopique (16X) d&#39;œufs fécondés et non fécondés, où seuls deux œufs non fécondés sont, les œufs non fécondés sont indiqués par des flèches noires (A). Plus fort grossissementVue (90X) d&#39;un. fécondé (B) et un oeuf non fécondé (C) <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un poisson zèbre femelle ovipositeur (indiqué par la flèche noire) illustration. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Paramètre </td><td fo:width="3in"> Plage optimale </td></tr><tr><td> Alcalinité </td><td> 50-150 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 06.08 à 07.05 (6.0 à 8.5 toléré) </td></tr><tr><td> Température </td><td> 26 à 28,5 ° C </td></tr><tr><td> Dureté </td><td> 50-100 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> Ammoniac non ionisé </td><td> &lt;0,02 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrate (NO 3 -) </td><td> &lt;50 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrite (NO 2 -) </td><td> &lt;0,1 mg / L </td></tr><tr><td> L&#39;oxygène dissous </td><td> &gt; 6,0 mg / L </td></tr><tr><td> Salinité </td><td> 0,5-1 g / L </td></tr><tr><td> Conductivité </td><td> 300 -1 500 uS </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Paramètres de qualité de l&#39;eau. Paramètres de qualité de l&#39;eau. Domaine d&#39;utilisation optimal des paramètres environnementaux dans l&#39;aquarium poisson zèbre 11.

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Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Ce protocole décrit entretien régulier et des soins afin de maintenir des conditions optimales pour le poisson-zèbre élevage. La vidéo illustre le protocole pour la maintenance du système, le logement, l&#39;alimentation, la reproduction, et l&#39;élevage de larves de poisson zèbre.

Soins et entretien réguliers d&#39;un poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratoire: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.6K vues.  Edith Cowan University. Ce protocole décrit entretien régulier et des soins afin de maintenir des conditions optimales pour le poisson-zèbre élevage. La vidéo illustre le protocole pour la maintenance du système, le logement, l'alimentation, la reproduction, et l'élevage de larves de poisson zèbre.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Recherche

Biologie

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Détection des Ligands oestrogéniques dans les produits de soins personnels à l’aide d’une levure oestrogène écran optimisé pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

La croissance anaérobie et l’entretien de lignées cellulaires de mammifères

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Établissement et entretien des blattes américaines gnotobiotiques (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.